Summary

Um modelo de expressão de Quimiocina ectópica para testar o recrutamento de macrófago in vivo

Published: September 25, 2019
doi:

Summary

Para testar o efeito de um quimiocina no recrutamento do macrófago in vivo, a hibridação in situ da montagem inteira foi usada para detectar a expressão ectópica do quimiocina, e a imunomarcação foi usada para etiquetar macrófagos. A imagem latente viva foi usada para a observação tempo real da migração do macrófago.

Abstract

Zebrafish são amplamente utilizados na pesquisa básica e biomédica. Muitas linhas transgênicas de zebrafish estão atualmente disponíveis para rotular vários tipos de células. Devido ao corpo embrionário transparente de zebrafish, é conveniente para nós estudar o efeito de uma quimiocina sobre o comportamento de um determinado tipo de células in vivo. Aqui nós fornecemos um fluxo de trabalho para investigar a função de uma quimiocina na migração de macrófago in vivo. Nós construímos um plasmídeo tecido-específico do superexpressão para sobre-expressão Il-34 e injetamos o plasmídeo em embriões transgênicas da fase da um-pilha dos peixes cujos os macrófagos foram etiquetados especificamente por uma proteína fluorescente. Nós usamos então a hibridação in situ fluorescente da montagem inteira e a imunocoloração para detectar o teste padrão da expressão do quimiocina e o número ou a posição dos macrófagos. Os embriões de WT injetados foram levantados para gerar uma linha transgênica estável. Por fim, utilizou-se a imagem latente ao vivo confocal para observar diretamente o comportamento dos macrófagos no peixe transgênico estável para estudar a função da IL-34 sobre o macrófago in vivo.

Introduction

O zebrafish é um pequeno peixe tropical de água doce de ossos duros originado na Índia. A respeito da conservação genética, o zebrafish tem uma similaridade de 87% ao ser humano1. Pode fornecer-nos introspecções em assuntos relacionados do ser humano estudando o Regulamento do gene, a função da proteína e o comportamento da pilha tais como a migração, proliferação et.al no zebrafish. O embrião de zebrafish pode ser usado para observar o desenvolvimento de embriões adiantados em estágios diferentes após ter inibindo o pigmento. Enquanto isso, leva apenas três meses para que o zebrafish se desenvolva em maturidade sexual, então o zebrafish pode produzir centenas de ovos a cada 4 dias. O mini-tamanho, melhoramento simples, capacidade reprodutiva forte, estas vantagens faz a cultura do zebrafish muito espaço-economia, conducente à cultura em grande escala. O rato modelo tradicional de mamíferos tem um custo de manutenção mais elevado do que o zebrafish, limitando conseqüentemente a escala da elevação do rato. No aspecto do desenvolvimento embrionário precoce, o embrião de camundongo é difícil de observar em condições de viver devido às características do desenvolvimento embrionário do camundongo no útero materno. Pelo contrário, os embriões de zebrafish desenvolvem-se externamente e são transparentes, por isso são fáceis de observar um microscópio. Além disso, o zebrafish é muito fácil construir uma variedade de linhas transgênicas para a pesquisa relacionada da função do gene. Atualmente, várias linhas de zebrafish transgênicos estão disponíveis para rotular diferentes tipos de células. É muito conveniente agora para construir linhas transgênicas para sobre-expressão quimiocinas em locais específicos e estudar a função de quimiocinas no comportamento celular em zebrafish.

Aqui, fornecemos um fluxo de trabalho para a utilização da linha de zebrafish transgênica para investigar a função do Il-34 no comportamento dos macrófago in vivo2,3,4,5,6,7. Primeiramente, nós construímos um plasmídeo de superexpressão fígado-específico do gene il34 e injetamos o plasmídeo em embriões de peixes do estágio TG da um-pilha (MPEG1: GFP) que etiquetaram especificamente os macrófagos pela proteína fluorescente GFP. Então, nós usamos a hibridação in situ fluorescente da montagem inteira e a imunocoloração para detectar o teste padrão da expressão il34 e o número ou a posição dos macrófagos. Os embriões de WT injetados foram levantados para gerar uma linha transgênica estável. Nessas etapas, estabelecemos e validamos a linha produtora de citocinas e avaliamos visualmente os efeitos que podem ser observados na distribuição de macrófago. Por fim, para investigar o comportamento dos macrófago em resposta à citocina, utilizou-se a imagem viva confocal para observar diretamente a migração de macrófago para confirmar a função de il34 na migração de macrófago in vivo.

Protocol

Nota: Todas as amostras foram tratadas pela água do ovo de phenylthiourea (PTU) para inibir o pigmento. 1. geração de TG (fabp10a: il34) construções transgênicas e injeção de peixe Clone o 2,8 KB fabp10a promotor8 e as regiões de codificação Il-34 (ensdart 00000126460.3) de zebrafish no vetor pTol2 para gerar a construção fabp10a-il34. Injete os constructos em um estádio de células TG (MPE…

Representative Results

As etapas envolvidas no protocolo de zebrafish são ilustradas na Figura 2. Em primeiro lugar, geramos o construto pBLK-fabp10a-il34-SV40 no qual il34 foi conduzido pelo promotor fabp10a (Figura 2). O construto foi microinjetado em embriões de zebrafish de fase TG (MPEG1: GFP) de uma célula que pode rotular macrófagos com embriões de GFP e WT que foram levantados para adultos para gerar lin…

Discussion

O protocolo descrito aqui nos permite investigar a função de uma quimiocina sobre o comportamento do macróagein vivo e o procedimento requer algum conhecimento técnico. Em síntese, existem várias etapas críticas para evitar complicações no protocolo: 1) selecionar uma linha transgênica adequada que mostre um sinal transgênico específico e forte para rotular a célula de interesse; 2) selecionar um tecido apropriado que seja acessível para a imagem latente e o overexpression do gene transgênicas; 3) faça um…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos ao Dr. Jingrong Peng por compartilhar a linha transgênica TG (fabp10a: DsRed) ; Dr. Zilong Wen por compartilhar as linhas transgênicas TG (MPEG1: GFP) ; Dr. Koichi Kawakami para fornecer o vetor pTol2. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (31771594), Guangdong ciência e tecnologia projetos plano (2019A030317001) e os fundos de investigação fundamentais para as universidades centrais (D2191450).

Materials

Antibody
Alexa 488-Anti-Goat antibody Invitrogen A11055
Anti-Digoxigenin-HRP  perkinelmer NEF832001EA
Goat-Anti-GFP antibody Abcam ab6658
Reagent
CaCl2H2O Sigma 21097
Cyanine 3 Plus Amplification Reagent perkinelmer NEL745001KT
E2 solution 15 mM  NaCl +0.5 mM KCl +1.0 mM MgSO4+150 µM  KH2PO4 + 50 µM  Na2HPO4 +1.0 mM CaCl2 + 0.7 mM NaHCO3 
Fetal Bovine Serum(FBS) Life 10099-133
formamide Diamond A100314
glycerol  Sigma V900860
heparin sodium Sigma H3149
hybridization buffer(HB) 50% formamide+ 5×SSC+9 mM sodium citrate+50 μg/ml heparin sodium+ 500 μg/ml tRNA+ 0.1% Tween20
KCl Sigma P5405
KH2PO4 Sigma P5655
low melting agarose Sigma A9414
methanol GHTECH 1.17112.023
methylene blue  Sigma M9140
MgSO4 Sigma M2643
Na2HPO4 Sigma S5136
NaCl Sigma S5886
NaHCO3  Sigma S5761
paraformaldehyde(PFA) Sigma 158127 Suspend 16 g of PFA in 400 ml of 1x PBS, heat at 60 °C  to dissolve about 30 min. This solution can be prepared in advance and stored at -4 °C. Caution. Manipulate with mask.
10×PBS 14.2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2.4 g KH2PO4 in 1L ddH2O
phenylthiourea(PTU) Sigma P7629
1×Plus Amplification Diluent perkinelmer NEL745001KT
Proteinase K  Fermentas E00492
20×Saline sodium citrate(SSC) 175.3 g NaCl+ 88.2 g sodium citrate in 1 L ddH2O, PH 7.0
sodium citrate Sigma A5040
tricaine Sigma E10521
tRNA  Sigma R6625
Tween20 Sigma P2287
Plasmid
pBLK-fabp10a-il34-sv40 For Tg (fab10a:il34) transgenic line generation
pBSK-il34 For il34 probe preparation
Fish
Tg (mpeg1: GFP) Label macrophages with GFP
Tg (fabp10a: DsRed) Label liver cells with DsRed
Tg (fab10a:il34) Over-expression IL-34 in liver cells

References

  1. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  2. Wang, Y., et al. IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia. Nature Immunology. 13 (8), 753-760 (2012).
  3. Lin, H., et al. Discovery of a cytokine and its receptor by functional screening of the extracellular proteome. Science. 320 (5877), 807-811 (2008).
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Cite This Article
Jiang, Y., Chen, J., Xu, J. An Ectopic Chemokine Expression Model for Testing Macrophage Recruitment In Vivo. J. Vis. Exp. (151), e60161, doi:10.3791/60161 (2019).

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