Здесь мы представляем протокол для сбора конфокальных спектров Раман из человеческих субъектов в клинических исследованиях в сочетании с химиометрическими подходами для удаления спектральных выбросов и последующего извлечения ключевых особенностей.
Разработка этого in vivo confocal Raman спектроскопического метода позволяет непосредственно измерять воду, белки и липиды с разрешением глубины у людей. Эта информация очень важна для заболеваний, связанных с кожей и характеризующих производительность продукта по уходу за кожей. Этот протокол иллюстрирует метод сбора конфокальных спектров Раман и последующего анализа спектрального набора данных с использованием химиометрии. Цель этого метода заключается в создании стандартного протокола для сбора данных и обеспечении общего руководства для анализа данных. Предварительная обработка (например, удаление спектров выбросов) является критическим шагом при обработке больших наборов данных из клинических исследований. В качестве примера мы предоставляем рекомендации, основанные на предварительных знаниях набора данных для определения типов выбросов и разработки конкретных стратегий для их устранения. Выполняется основной анализ компонентов, а спектры загрузки сравниваются со спектрами из справочных материалов для выбора количества компонентов, используемых в окончательном анализе разрешения многовариантной кривой (MCR). Этот подход успешен для извлечения значимой информации из большого спектрального набора данных.
В клинических исследованиях, in vivo confocal Раман спектроскопии показал свою уникальную способность для определения толщины роговицы слоя и содержания воды1,2,3,4, и отслеживания проникновения активные материалы местно применяется к коже5,6. В качестве неинвазивного подхода конфокальная Рамана спектроскопия обнаруживает молекулярные сигналы на основе вибрационных режимов. Таким образом, маркировка не требуется7. In vivo confocal Raman спектроскопия обеспечивает химическую информацию с разрешением глубины на основе конфокального характера техники. Эта глубинно зависимая информация очень полезна при изучении последствий продуктов по уходу за кожей4,8,старение9,10, сезонные изменения3,а также заболевания функции кожного барьера, атопический дерматит11,12. Существует много информации в высокочастотной области конфокальной раманской спектроскопии (2500-4000 см-1),где вода производит различные пики в регионе между 3250-3,550 см-1. Тем не менее, Раман пики белков и липидов, которые сосредоточены между примерно 2800-3000 см-1, перекрывают друг друга, потому что сигналы в основном производятся из метилена (-CH2-) и метил (-CH3)группы 13 . Эта перекрытая информация представляет собой техническую проблему при получении относительного количества отдельных молекулярных видов. Для решения этой задачи были использованы пиковые установки14,15 и селективная пиковая позиция12,16 подходов. Тем не менее, это трудно для этих одного пиковых методов для извлечения чистой информации компонента, потому что несколько пиков Раман из одного и того же компонента изменения одновременно17. В нашей недавней публикации18, MCR подход был предложен, чтобы прояснить чисто компонент информации. Используя этот подход, три компонента (вода, белки и липиды) были извлечены из большого in vivo конфокального спектроскопического набора данных Раман.
Выполнение крупных клинических исследований может быть требовательным к лицам, собирающим в vivo спектроскопические данные. В некоторых случаях, спектральные приобретения может потребовать операционного оборудования в течение многих часов в день, и исследование может продлиться до недель или месяцев. В этих условиях спектроскопические данные могут генерироваться операторами оборудования, которые не имеют технических знаний для выявления, исключения и исправления всех источников спектроскопических артефактов. Полученный набор данных может содержать небольшую часть спектроскопических выбросов, которые необходимо идентифицировать и исключить из данных до анализа. В этой статье подробно иллюстрируется процесс химиометрического анализа для «очистки» клинического набора данных Рамына перед анализом данных с помощью MCR. Для успешного удаления выбросов необходимо определить типы выбросов и потенциальную причину генерации спектров выбросов. Затем может быть разработан конкретный подход для удаления целевых выбросов. Это требует предварительного знания набора данных, включая детальное понимание процесса генерации данных и проектирования исследования. В этом наборе данных большинство выбросов являются низкой спектрами сигнала к шуму и происходят в основном из 1) спектров, собранных над поверхностью кожи (6208 из 30 862), и 2) сильный вклад в спектр от флуоресцентного света комнаты (67 из 30 862). Спектры, собранные над поверхностью кожи, производят слабую реакцию Раман, так как лазерный координационный центр приближается к поверхности кожи и в основном находится в окне прибора под кожей. Спектра с сильным вкладом флуоресцентного света комнаты генерируются либо из-за ошибки оператора инструмента или субъекта движения, который производит условие, при котором конфоконсльное окно коллекции Раман не полностью покрыто тела объекта субъекта. Хотя эти типы спектральных артефактов могут быть идентифицированы и исправлены в ходе спектрального приобретения спектроскопическим экспертом во время получения данных, обученным операторам приборов, использоваваемым в этом исследовании, было поручено собирать все данные, если катастрофический сбой наблюдался. Задача выявления и исключения выбросов включена в протокол анализа данных. Представленный протокол разработан для решения этой проблемы. Для решения низких сигнальных-шумовых спектров над поверхностью кожи необходимо сначала определить местоположение поверхности кожи, чтобы позволить удаление спектров, собранных над поверхностью кожи. Расположение поверхности кожи определяется как глубина, где Раман лазерный координационный центр наполовину в коже и половина из кожи, как показано на дополнительной рисунке 1. После удаления низкой спектры сигнала к шуму, основной анализ компонентов (PCA) реализуется для извлечения фактора, в котором доминируют флуоресцентные пики света комнаты. Эти выбросы удаляются на основе значения оценки соответствующего фактора.
Этот протокол содержит подробную информацию о том, как шесть основных компонентов определяются в процессе MCR. Это делается на основе анализа PCA с последующим сравнением спектральной формы между нагрузками для моделей, генерируемых с разным количеством основных компонентов. Подробно подробно разъясняется также экспериментальный процесс сбора данных справочных материалов, а также и субъектов человека.
Во время сбора данных, как описано в разделе 2 и 3 протокола, каждый профиль глубины был собран в области со контактом между окном инструмента и кожей, найдя темные области из микроскопических изображений, выделенных в красных кругах в Рисунок 2C. После того, как э…
The authors have nothing to disclose.
Авторы в значительной степени признают финансовую поддержку со стороны отдела корпоративной функции аналитического и личного чистки. Мы хотим выразить нашу благодарность директорам по аналитическим партнерам г-же Джасмин Ван и д-ру Роббу Гарднеру за их руководство и поддержку, а г-же Ли Ян за помощь в сборе данных.
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
Cholesterol | Sigma-Aldrich | ||
Cholesterol 3-sulfate sodium | Sigma-Aldrich | ||
D-Erythro-Dihydrosphingosine | Sigma-Aldrich | ||
DI water | Purified with Milipore(18.2MΩ) | ||
Gen2-SCA skin analyzer | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | Gen2 | |
Matlab 2018b | Mathwork | 2018b | |
N-behenoyl-D-erythro-sphingosine | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
N-Lignoceroyl-D-erythro-sphinganine(ceramide) | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
Oleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | ||
Palmitoleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
PLS_Toolbox version 8.2 | Eigenvector Research Inc. | 8.2 | |
RiverICon | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | version 3.2 | |
Squalene | Sigma-Aldrich | ||
Stearic Acid | Sigma-Aldrich |