Summary
यहाँ, हम नियंत्रित deoxygenation और reoxygenation के तहत सिकल सेल रोग के साथ रोगियों से नमूनों में लाल रक्त कोशिका विकृति को मापने के लिए एक तेजी से और पुन: उत्पादन विधि ऑक्सीजन ढाल ektacytometry, एक तेजी से और पुन: उत्पादन योग्य विधि प्रस्तुत करते हैं। इस तकनीक लाल रक्त कोशिका sickling का अध्ययन करने के लिए और सिकल सेल रोग उपचार प्रभावकारिता की निगरानी करने के लिए एक रास्ता प्रदान करता है.
Abstract
सिकल सेल रोग (एससीडी) में, बीटा-ग्लोबिन के लिए जीन कोडिंग में एक एकल बिंदु उत्परिवर्तन असामान्य हीमोग्लोबिन एस (एचबीएस) के उत्पादन का कारण बनता है। जब deoxygenated, HbS बहुलक कर सकते हैं, हीमोग्लोबिन की कठोर छड़ बनाने, लाल रक्त कोशिकाओं (RBCs) के sickling में जिसके परिणामस्वरूप. इन बीमार RBCs काफी विकृति कम हो गई है, vaso-occlusion के कारण, जो कई एससीडी से संबंधित नैदानिक जटिलताओं की ओर जाता है, दर्द सहित, स्ट्रोक, और अंग क्षति. आरबीसी विकृति भी आरबीसी निर्जलीकरण द्वारा कम है, घने लाल रक्त कोशिकाओं है कि सिकल की संभावना है और अधिक में जिसके परिणामस्वरूप. तारीख करने के लिए, वहाँ एक भी व्यापक रूप से उपलब्ध नहीं है, तेजी से, और reproduible प्रयोगशाला परख रोग गंभीरता की भविष्यवाणी करने में सक्षम है या सीधे उपन्यास के लिए उपचार प्रभाव की निगरानी, गैर-fetal हीमोग्लोबिन प्रेरक चिकित्सा. इस अध्ययन में, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए pO2 के एक समारोह है कि SCD रोगियों में sickling व्यवहार की मात्रा के लिए अनुमति देता है के रूप में आरबीसी विकृति को मापने के लिए. ऑक्सीजन प्रवणता एकादशमिति उपाय आरबीसी विकृति, को पी ओ2के एक समारोह के रूप में दीर्घीकरण सूचकांक (ईआई) के रूप में व्यक्त किया गया है। आरबीसी deoxygenation और reoxygenation के एक दौर के दौरान 30 पा की एक निश्चित कतरनी तनाव को उजागर कर रहे हैं. छह readout पैरामीटर का उत्पादन कर रहे हैं. इनमें से, sickling के बिंदु (पीओएस), पीओ2 के रूप में परिभाषित किया गया है जिस पर अधिकतम ईआई (ईआईअधिकतम) 5% कमी से पता चलता है, और deoxygenation के दौरान न्यूनतम EI (EIमिनट) सबसे जानकारीपूर्ण हैं, एक व्यक्ति रोगी के पीओ2 को दर्शाती है जिस पर sickling शुरू होता है और एक रोगी की लाल रक्त कोशिकाओं की न्यूनतम विकृति, क्रमशः. PoS ऑक्सीजन के लिए एक व्यक्ति के रोगी के हीमोग्लोबिन संबंध के साथ जुड़ा हुआ है, जबकि ईआईमिन भ्रूण हीमोग्लोबिन के स्तर के साथ एक मजबूत संबंध से पता चलता है. हम निष्कर्ष है कि ऑक्सीजन ढाल ektacytometry एससीडी के साथ रोगियों के उपचार की निगरानी करने के लिए एक आशाजनक तकनीक है, नैदानिक और पूर्व नैदानिक परीक्षणों में विरोधी बीमार एजेंटों के लिए एक biomarker के रूप में, और एक महत्वपूर्ण उपकरण से RBCs के sickling व्यवहार का अध्ययन करने के लिए एससीडी और सिकल सेल लक्षण के साथ व्यक्तियों.
Introduction
एससीडी में, एचबीएस के उत्पादन में एक एकल बिंदु उत्परिवर्तन का परिणाम होता है, जो deoxygenation पर बहुलक कर सकते हैं। HbS बहुलकीकरण RBCs के sickling का कारण बनता है और आरबीसी विकृति कम कर देता है. एंडोथेलियम के आरबीसी बीमारऔर आरबीसी पालन के संयोजन विभिन्न एससीडी जटिलताओं की ओर जाता है, जिसमें वासो-ऑक्लूसिव संकट (वीओसी), स्ट्रोक, अंग क्षति, और क्रोनिक हेमोलिटिक एनीमिया शामिल हैं। यहां तक कि normoxic शर्तों पर, आरबीसी विकृति एससीडी के साथ रोगियों में समझौता किया है. कम ऑक्सीजन सांद्रता में विकृति में और कमी आई है। मुख्य खिलाड़ी जो नॉर्मोक्सिया में विकृति का निर्धारण करते हैं, वे घने कोशिकाएं, अपरिवर्तनीय रूप से बीमार कोशिकाएं (आईएससी) और निर्जलित कोशिकाएं होती हैं, जिनमें से सभी में सतह से मात्रा अनुपात1,2,3होता है।
एकात्मकता मिति आरबीसी विकृति को मापने के लिए एक स्थापित विधि है, व्यापक रूप से वंशानुगत हेमोलिटिक एनीमिया के निदान के लिए प्रयोग किया जाता है, विशेष रूप से झिल्ली पैथी4. इसका उपयोग हीमोरेय विज्ञान5,6,7,8,9 का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकताहै. परासरणी प्रवणता एकेटासाइटोमिति, जिसमें आरबीसी विकृति को अडमोलिटी में निरंतर परिवर्तन के दौरान मापा जाता है, का उपयोग एक दशकसेअधिक समय से एससीडी का अध्ययन करने के लिए किया गयाहै। भ्रूण हीमोग्लोबिन (HbF) का प्रतिशत HbS बहुलकीकरण के सबसे मजबूत inhibitors में से एक है क्योंकि न तो HbF और न ही इसके मिश्रित संकर tetramer ([2S]) deoxyHbS बहुलक चरण12में प्रवेश कर सकते हैं . हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि एससीडी रोगियों में एचबीएफ के स्तर में वृद्धि से सतह से मात्रा अनुपात बेहतर होता है, जिससे जलयोजन की स्थिति में सुधार होता है और इस प्रकार गैर-ट्रांसफ्यूजरोगियों में विकृति11होती है।
आरबीसी विकृति एससीडी जटिलताओं के लिए एक biomarker के रूप में अतीत में अध्ययन किया गया है, लेकिन परस्पर विरोधी परिणामों के साथ. अध्ययनों में क्रॉस-सेक्शनली और स्थिर अवस्था में, आरबीसी विकृति के उच्च स्तर वाले व्यक्तियों में ऑस्टियोनेक्रोसिस की अधिक घटनाएं पाई गई और अधिक दर्द संकट13,14,15पाया गया. इन निष्कर्षों के विपरीत, जब एक तीव्र VOC के दौरान स्थिर राज्य मूल्यों की तुलना में, आरबीसी विकृति एक ही व्यक्ति16के भीतर अनुदैर्घ्य अध्ययन में कमी आई थी. यह विसंगति विभिन्न परिस्थितियों (यानी स्थिर राज्य बनाम वीओसी के दौरान) के तहत आरबीसी विकृति का अध्ययन करने का परिणाम हो सकता है। बीमार कोशिकाओं का प्रतिशत एक वीओसी के शुरू में उच्च है और कोशिकाओं को तेजी से नष्ट कर रहे हैं के रूप में संकट की प्रगति, जो स्थिर राज्य पार अनुभागीय घटना डेटा और वीओसी के दौरान प्राप्त अनुदैर्घ्य डेटा के बीच अंतर की व्याख्या कर सकते हैं. हालांकि, अन्य कारकों, जैसे एंडोथेलियल सतह के लिए आरबीसी subpopulations के पालन के रूप में भी VOC की घटना में महत्वपूर्ण हो सकता है. एससीडी में, यह deoxygenation के दौरान विकृति को मापने के लिए और अधिक चिकित्सकीय प्रासंगिक है, क्योंकि vaso-occlusion आम तौर पर hypoxic postcapillary venules में होता है और कम hypoxic microcapillary नेटवर्क17में नहीं. इसके अतिरिक्त, ISCs की उपस्थिति normoxia में विकृति को मापने के लिए एक ektacytometer की क्षमता को बदल सकता है. विवर्तन पैटर्न का विरूपण आईएससी के कारण होता है, जिसका परिणाम प्रवाह1,2,3के दौरान गुट निरपेक्षता से होता है।
वीओसी के पैथोफिजियोलॉजी का अध्ययन करने के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोण में एक कृत्रिम सतह18,एकल सेल विद्युत प्रतिबाधा माइक्रोफ्लो साइटोमेट्री19,माइक्रोफ्लूइडिक-आधारित मॉडल के संयोजन मात्रात्मक के लिए आरबीसी पालन की माप शामिल है एकल कोशिका rheology20,और लेजर प्रेरित बहुलकीकरण21के साथ sickling और unsickling सेल के माप. हालांकि वादा, इन तकनीकों महंगा कर रहे हैं, श्रम गहन, और व्यापक ऑपरेटर प्रशिक्षण की आवश्यकता है. इसके अलावा, परख है कि आकृति विज्ञान आधारित हैं सेलुलर व्यवहार का अध्ययन करने की क्षमता की कमी, इस तरह के विकृति के रूप में, एक ऑक्सीजन ढाल के एक समारोह के रूप में.
इस अध्ययन में, हम एक ektacytometer के साथ प्रदर्शन किया एक तेजी से और reproduible कार्यात्मक परख का वर्णन. यह एक अगली पीढ़ी के एक्टासाइटोमिति माप है जो डीऑक्सीजन (1,300 एस) और तेज पुनर्ऑक्सीजन (280 एस) के दौरान ईआई के रूप में व्यक्त आरबीसी विकृति के विभिन्न गुणात्मक पहलुओं को मापता है। इन समय अंतराल HbS बहुलक गठन के लिए अनुमति देते हैं, और इस तरह आकृतिक परिवर्तन और फिर वसूली की घटना. डाइऑक्सीजन नाइट्रोजन गैस शुरू करने से होता है, जो धीरे-धीरे एक्टासाइटोमीटर के बॉब और कप के बीच के अंतराल में रक्त नमूने में ऑक्सीजन तनाव को कम करता है। आरबीसी विकृति लगातार मापा जाता है, जबकि ऑक्सीजन तनाव कप की दीवार में मौजूद एक छोटे से ओ2स्पॉट के माध्यम से हर 20 s मापा जाता है। परीक्षण के दौरान, लगभग 80 PO2 माप उस पल में मापा ईआई करने के लिए युग्मित कर रहे हैं. ऑक्सीजन का दबाव deoxygenation के दौरान 20 mmHg नीचे चला जाता है, और reoxygenation परिवेश हवा के निष्क्रिय प्रसार द्वारा सुविधा है. एक्टासाइटोमीटर तथा ऑक्सीजन प्रवणता एक्टासाइटोमिति मॉड्यूल की प्रायोगिक स्थापना चित्र 1 और चित्र 2में वर्णित है। एक्टासाइटोमेट्री का सिद्धांत लेजर बीम से प्रकाश के आरबीसी-प्रेरित प्रकीर्णन पर आधारित है। जब एक ही समय में कतरनी प्रतिबल लागू किया जाता है तो इसका परिणाम दीर्घवृत्तीय विवर्तन प्रतिवर्तन होता है (चित्र 1)।
Protocol
सभी प्रक्रियाओं विश्वविद्यालय चिकित्सा केंद्र यूट्रैक्ट (UMCU) की नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया और हेलसिंकी की घोषणा के अनुसार. टेक्सास बच्चों के Hematology केंद्र (TCHC) में नामांकित मरीजों को स्थानीय आईआरबी द्वारा अनुमोदित किया गया और हेलसिंकी की घोषणा के अनुसार.
1. सामान्य विचार
- बॉब और कप को गर्म करने के लिए एक परीक्षण माप प्रदर्शन से शुरू। सुनिश्चित करें कि बॉब और कप का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस है। यह अच्छी प्रजनन क्षमता के लिए महत्वपूर्ण है।
- सुनिश्चित करें कि चिपचिपा polyvinylpyrrolidone (PVP) समाधान osmolarity के लिए सख्त सीमा के भीतर आता है (282-286 mOsm/kg), पीएच (7.35-7.45) और चिपचिपापन (27.5-32.5 MPa) कमरे के तापमान पर (22 डिग्री सेल्सियस).
नोट: PVP कमरे के तापमान पर इस्तेमाल किया जाना चाहिए. यदि एक कम तापमान पर संग्रहीत, सुनिश्चित करें कि यह कमरे के तापमान को गर्म किया है किसी भी माप लेने से पहले.
2. एक्टासाइटोमीटर का स्टार्ट-अप
- कंप्यूटर और पीछे से ektacytometer पर स्विच करें. कंप्यूटर पर सॉफ्टवेयर प्रोग्राम(सामग्री की तालिका)प्रारंभ करें।
- सुनिश्चित करें कि नाइट्रोजन नाइट्रोजन सिलेंडर को खोलकर नमूने को deoxygenate करने के लिए उपलब्ध है।
- कप में बॉब कम है और सुनिश्चित करें कि कप स्वतंत्र रूप से बदल सकते हैं. एक नरम कपड़े और आसुत पानी के साथ अंदर और बाहर पर कप साफ, क्योंकि मलबे EI माप में बाधा कर सकते हैं.
- जब सॉफ़्टवेयर प्रोग्राम चल रहा है, तो स्क्रीन पर निम्न संदेश के लिए जाँच करें:"सुनिश्चित करें कि गैस वाल्व खुला है" और ठीकक्लिक करें.
- सुनिश्चित करें कि ektacytometer pO2 स्वयं की जांच प्रक्रिया है कि स्क्रीन पर दिखाई देगा शुरू होता है. प्रारंभ करें का चयन करें (दर्ज करें). यह विफल रहता है, तो हार्डवेयर जाँच क्लिक करके स्वयं-जाँच पुन: चलाएँ ] पो 2 | स्वयं की जांच|
नोट: स्वयं जाँच फिर से विफल रहता है, तो O2-स्पॉट को बदलने पर विचार करें। O2-स्पॉट धीरे एक उंगलियों के साथ कप के अंदर से बाहर जगह धक्का द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है. एक नई जगह धीरे से कप में बाहर से जगह धक्का द्वारा रखा गया है. - बाईं ओर सूचीबद्ध विभिन्न परीक्षणों से pO2 स्कैन चुनें. स्क्रीन के दाईं ओर सेटिंग्स चुनें और सुनिश्चित करें कि वे तालिका 1में सूचीबद्ध पैरामीटरों के अनुसार सेट हैं। हर माप के लिए एक ही सेटिंग्स रखें.
- इन सेटिंग्स को सहेजने के लिए, ठीक दबाएँ | ठीकहै .
नोट: पसंदीदा सेटिंग्स तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं, लेकिन उपयोगकर्ता वरीयताओं और investigational उद्देश्यों के अनुसार समायोजित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, अधिक बड़े पैमाने पर sickling व्यवहार का अध्ययन करने के लिए, deoxygenation गति और अवधि बदला जा सकता है.
3. नमूना संग्रह और तैयारी
नोट: तकनीक के सत्यापन के लिए, ethylenediamine tetraacetic एसिड (EDTA) से रक्त का इलाज 38 एससीडी रोगियों और 5 स्वस्थ नियंत्रण विश्वविद्यालय चिकित्सा केंद्र यूट्रैक्ट या टेक्सास बच्चों के Hematology केंद्र में शामिल, विभिन्न नैदानिक अध्ययनों में ( नीदरलैंड परीक्षण रजिस्ट्री [NTR] पहचानकर्ता, एनटीआर 6779 और एनटीआर 6462), साथ ही आउट पेशेंट क्लिनिक का दौरा करने वाले या अस्पताल में भर्ती किए गए रोगियों से अनाम ीकृत बचे हुए रक्त नमूनों का उपयोग किया गया।
- EDTA युक्त एक ट्यूब में venipuncture (एक न्यूनतम 300 डिग्री सेल्सियस/प्रतिदर्श) द्वारा रक्त के नमूने ले लीजिए। सुनिश्चित करें कि रक्त 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 30 मिनट के लिए संग्रहीत किया गया है, लेकिन अब 24 एच से अधिक नहीं है।
नोट: साइट्रेट फॉस्फेट डेक्सट्रोस एडेनिन (सीपीडीए) या हेपरिन का भी उपयोग किया जा सकता है, लेकिन ऑक्सीजन ढाल ektacytometry के संबंध में नमूना संरक्षण पर इन अभिकर्मकों का प्रभाव अच्छी तरह से ज्ञात नहीं है। - समरूपाकेप्रति प्रतिलोम द्वारा नमूना को धीरे से मिलाएं। नमूना हिला मत करो. नमूना माप से पहले एक रोलर बेंच पर कमरे के तापमान को गर्म करते हैं।
नोट: एक नमूना ट्यूब (9-10 एमएल) है कि अधिक से अधिक 1 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है 15 मिनट के लिए गर्म करना चाहिए. जब 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 1 एच के लिए संग्रहीत किया जाता है, तो इसे 10 मिनट तक गर्म करना चाहिए। एक नमूना ट्यूब (2-6 एमएल) जो 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 से अधिक ज के लिए संग्रहीत किया जाता है, 10 मिनट के लिए गर्म होना चाहिए। जब 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 1 एच के लिए संग्रहीत किया जाता है, तो इसे 5 मिनट के लिए गर्म करना चाहिए। - एक hematology विश्लेषक पर पूरा रक्त गिनती उपाय. ऐसा करने के लिए, EDTA युक्त एक ट्यूब में पूरे रक्त के 20-200 डिग्री सेल्सियस ले लो. ट्यूब में आकांक्षा सुई प्लेस और माप शुरू करने के लिए hematology विश्लेषक की सुई के पीछे बटन पर दबाएँ.
नोट: पूर्ण रक्त गणना में, आरबीसी संख्या मापा जाता है, जो ऑक्सीजन ढाल ektacytotry माप मानकीकरण के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है. RBC गणना प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा आगे और बगल स्कैटर से परिकलित की जाती है। स्वस्थ नियंत्रण में सामान्य आरबीसी गिनती 3.7-5.0 x 1012/L महिलाओं के लिए और 4.2-5.5 x 1012/ एससीडी के साथ रोगियों में आरबीसी गिनती आम तौर पर कम है. कुछ hematology analyzers भी प्रतिशत घने घने लाल रक्त कोशिकाओं को मापने (% DRBC) जो व्यक्तिगत ऑक्सीजन ढाल ektacytotry घटता की व्याख्या में अतिरिक्त मूल्य का हो सकता है. - 5 एमएल पीवीपी (200 x 106 RBCs/vial) में 200 x 106 RBCs की एक आरबीसी गिनती करने के लिए पूरे रक्त नमूने मानकीकरण जोड़ा जाएगा कि नमूना की मात्रा का समायोजन करके। यदि कुल आरबीसी संख्या 200 x 106से कम है, तो विवर्तन पैटर्न और ईआई प्रभावित होंगे।
- गिनती करने के लिए नीचे दिए गए समीकरण का उपयोग करें।
4.0/xx (x 1012/L) x 50 ]y y ]L पूरे रक्त /
जहां xx की गणना आरबीसी गिनती चरण 3.3 से प्राप्त की है और yy पूरे रक्त की राशि है कि वास्तविक माप के लिए आवश्यक है. एनीमिया और आरबीसी गणना को प्रभावित करने वाले अन्य कारकों के ग्रेड के आधार पर, आवश्यक पूरे रक्त की मात्रा 40-90 डिग्री सेल्सियस है।
- गिनती करने के लिए नीचे दिए गए समीकरण का उपयोग करें।
4. ऑक्सीजन प्रवणता एक्टासाइटोमेट्री मापन
- PVP में परिकलित नमूना मात्रा (रक्त का yy $L) 5 एमएल की कुल मात्रा प्राप्त करने के लिए पिपेट। धीरे से रक्त 3x resssssssssssss. आरबीसी पर अतिरिक्त दबाव से बचने के लिए एक विस्तृत उद्घाटन के साथ पिपेट टिप का उपयोग करें। धीरे-धीरे नमूना को व्युत्क्रम द्वारा मैन्युअल रूप से तब तक मिलाएं जब तक कि यह सजातीय न हो जाए।
नोट: हवा से संपर्क से बचने के लिए संभव के रूप में कम समय के लिए पीवीपी शीशी खोलें। - धीरे-धीरे सुई के बिना 3 एमएल सिरिंज में रक्त/पीवीपी मिश्रण का 2.0 एमएल ड्रा करें। 1.5-1.8 एमएल सिरिंज में छोड़ दिया जाता है जब तक किसी भी दिखाई हवा के बुलबुले और अत्यधिक नमूना समाधान को दूर करने के लिए प्लंजर पुश (कप मात्रा पर निर्भर करता है)।
- कनेक्टर के माध्यम से बॉब में धीरे-धीरे और समान रूप से कुल नमूना मात्रा इंजेक्ट करें। सुनिश्चित करें कि नमूने का स्तर ऑक्सीजन सेंसर (गुलाबी स्थान) से ऊपर और छोटे चूषण छेद से ऊपर है। सिरिंज में कोई नमूना समाधान न छोड़ें।
- नया क्लिक करें और नमूना पहचानकर्ता, टिप्पणियों, दान की तारीख, और पीवीपी की चिपचिपापन में भरें। ठीक क्लिक करें ] अस्थावः। 60 s के बाद, कप बारी बारी से और 15 s के लिए नमूना aspirate होगा. ठीक क्लिक करें जब रोटेशन बंद हो जाता है. मशीन का ढक्कन बंद करें. जारी रखें क्लिक करें ] अब शुरू करो,के रूप में ऑक्सीजन ढाल ektacytometry एक निश्चित लाभ के साथ किया जाता है. माप के बारे में 28 मिनट लगेंगे.
- माप के बाद, वह रिपोर्ट मुद्रित करें जो सॉफ़्टवेयर द्वारा स्वचालित रूप से परिकलित किए जाने वाले वक्र और पैरामीटर दिखाती है. सुनिश्चित करें कि कच्चे डेटा स्वचालित रूप से सेटिंग्समें निर्दिष्ट फ़ोल्डर में संग्रहीत किया जाता है. अधिकतम ईआई (EIअधिकतम), न्यूनतम EI (EIन्यूनतम), pO2$95%EI (PoS), और क्षेत्र (वक्र के अंतर्गत क्षेत्र) स्वचालित रूप से गणना की जाती है और मुद्रित रिपोर्ट और कच्चे डेटा में जोड़ा जाता है.
- ईआईअधिकतम और ईआईन्यूनतमके बीच अंतर की गणना करके मैन्युअल रूप से $EI प्राप्त करें । विऑक्सीजनेशन (प्व्2 100-120 उम्हग) से पहले माध्य ईI में अंतर लेकर प्रतिशत वसूली की गणना कीजिए तथा 100-120 उम्हग पर पुनर्ऑक्सीजन के दौरान ईआई मानों का अर्थ है।
5. एक्टासाइटोमीटर की सफाई
- नमूना सिरिंज निकालें और आसुत पानी या deionized पानी से भरा एक सिरिंज के साथ बदलें।
- प्रेस साफ,धीरे धीरे rinsing के दौरान संबंधक फ्लशिंग. दोनों दिशाओं में फ्लश करने के लिए सुनिश्चित करें।
- सिरिंज निकालें और बॉब उठा. एक नरम कपड़े के साथ अच्छी तरह से बॉब, कप, और संबंधक सूखी.
- ट्यूब और बॉब में शेष किसी भी पानी को हटाने के लिए कनेक्टर फ्लश करने के लिए एक बड़ी सिरिंज (10-50 एमएल) का उपयोग करें। ट्यूबों में वापस दबाव प्राप्त करने के लिए बॉब के निचले इनलेट/आउटलेट को ब्लॉक करें, जिससे शेष जल को हटा दिया जा सके।
- कप में बॉब कम करें। मशीन अब अगले माप के लिए तैयार है।
6. मशीन का शट डाउन
- सुनिश्चित करें कि मशीन ठीक से पिछले माप के बाद कुल्ला है, जैसा कि ऊपर वर्णित है. सुनिश्चित करें कि उचित ट्यूब सफाई समाधान से संबंधित हैं।
- सॉफ़्टवेयर बंद करें, बंद करें दबाएँ, और अंत के दिन सफाई प्रोग्राम प्रारंभ करने के लिए प्रारंभ करें दबाएँ।
- पूरे सफाई कार्यक्रम को पूरा करने के बाद, सिरिंज को हटा दें और बॉब को उठाएं। कनेक्टर को एक बड़ी सिरिंज से फ्लश करें।
- अपशिष्ट बोतल खाली करें और एक नरम कपड़े से बॉब और कप को सुखा लें। ट्यूब और बॉब में शेष पानी को दूर करने के लिए कनेक्टर फ्लश। ट्यूबों में वापस दबाव प्राप्त करने के लिए बॉब के निचले इनलेट/आउटलेट को ब्लॉक करें, जिससे बचे हुए पानी को हटा दिया जाए।
- मशीन का ढक्कन बंद करें। नाइट्रोजन सिलेंडर बंद कर दीजिए। कंप्यूटर और मशीन बंद करें।
Representative Results
ऑक्सीजन ढाल ektacytometry एससीडी के साथ रोगियों में sickling व्यवहार की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस अध्ययन में, कुल 38 एससीडी रोगियों और पांच स्वस्थ नियंत्रण से रक्त के नमूने शामिल किए गए थे। स्वस्थ नियंत्रण में विवर्तन पैटर्न विराम पर परिपत्र होता है तथा उच्च अपरूपण प्रतिबल4पर दीर्घवृत् तीय होता है। दीर्घवृत् तीय विवर्तन प्रतिरूप से, दीर्घीकरण सूचकांक (ईआई) की गणना विवर्तन पैटर्न की ऊँचाई और चौड़ाई के आधार पर की जाती है। ऑक्सीजन प्रवणता एक्टासाइटोमेट्री में नाइट्रोजन गैस द्वारा नमूने की धीमी और सतत विऑक्सीजन के बाद परिवेशी वायु द्वारा तीव्र ऑक्सीजनीकरण किया जाता है। इन परिस्थितियों के तहत, आरबीसी sickling deoxygenation के तहत देखा जा सकता है. यह विवर्तन पैटर्न के एक विरूपण का कारण होगा क्योंकि बीमार लाल कोशिकाओं को लागू कतरनी तनाव के तहत ठीक से संरेखित नहीं होगा. अतः वे स्वस्थ आरबीसी के विपरीत कम विरूप्य प्रतीत होते हैं (चित्र 2)।
चित्र 3ए दर्शाता है कि डिऑक्सीजन पर सिकल आरबीसी आकार में कैसे परिवर्तन करते हैं, जो ऑक्सीजन प्रवणता एक्टैटोमी के दौरान स्थितियों की नकल करते हैं, जबकि नियंत्रण सिकल आरबीसी बिना ऑक्सीजन के आकार में कोई परिवर्तन नहीं दिखाता है। इस प्रक्रिया के परिणामस्वरूप ऑक्सीजन प्रवणता एक्टासाइटोमिति के दौरान विवर्तन पैटर्न का विरूपण होता है, और इस प्रकार ईआई में कमी आती है। चित्र 3ठ विभिन्न विवर्तन प्रतिमानों को दर्शाता है जिनसे विभिन्न पैरामीटर उत्पन्न होते हैं।
एक्टासाइटोमीटर द्वारा प्राप्त एक प्रतिनिधि वक्र चित्र 3ब्में दर्शायागया है। छह पैरामीटर RBCs के sickling व्यवहार के विभिन्न विशेषताओं को प्रतिबिंबित: EIअधिकतम deoxygenation से पहले माप के शुरू में अधिकतम ईआई है. यह पैरामीटर आधारभूत स्थिति का प्रतिनिधित्व करता है और परिवेशी वायु में कुल आरबीसी जनसंख्या की समग्र विकृति को दर्शाता है. ईआईमिनट न्यूनतम ईआई है, जो deoxygenation के बाद न्यूनतम विकृति का प्रतिनिधित्व करता है. इस पैरामीटर के आकार और उन्मुखीकरण में परिवर्तन को दर्शाता है (बीमार) rbCs deoxygenation पर. EIअधिकतम और ईआईमिनटके बीच अंतर है, जो इंगित करता है कि कितने कोशिकाओं deoxygenation के एक दौर के दौरान सिकल कर सकते हैं. 5% प्वाइंट ऑफ सिकलिंग (पीओएस5%) पीओ2 (एमएमएचजी) है जिस पर डिऑक्सीजन के दौरान ईआईअधिकतम की 5% कमी मापी जाती है। यह ऑक्सीजन तनाव का प्रतिनिधित्व करता है जहां बीमार प्रक्रिया शुरू होती है। क्षेत्र वक्र के अंतर्गत क्षेत्र को दर्शाता है, जो EI और pO2 माप के बीच 100 mmHg और pO2मिनट (mmHg) का एक अभिन्न गणना द्वारा निर्धारित किया जाता है. यह पहले से वर्णित पैरामीटर EIअधिकतमका परिणाम है , EIन्यूनतम, और PoS. वसूली आधार रेखा पर EI की तुलना में reoxygenation के अंतिम भाग के दौरान EI के अंतर का प्रतिनिधित्व करता है. दोनों EI मान ों को 100-120 उम्हग के एक प्भ्2 पर मापा जाता है। यह पैरामीटर आरबीसी की उस क्षमता को दर्शाता है जो पुनर्ऑक्सीजन22के दौरान रुग्णों को उलटने के लिए विऑक्सीजन के दौरान सिकल करता है . डुप्लिकेट माप से पैरामीटर आम तौर पर भिन्नता का एक गुणांक था (CV) और lt;5% (मध्य 1.83%). मामले में एक CV gt; 5% प्राप्त किया गया था, एक तीसरा माप किया गया था. पैरामीटर ईआईअधिकतम और वसूली औसत CVs के साथ सबसे reproduible हैं;lt;1%.
स्वस्थ नियंत्रण के RBCs के प्रतिनिधि घटता, HbS लक्षण (heterozygous HbS) के साथ रोगियों, और एक समयुग्मज एससीडी रोगी चित्रा 4एमें दिखाए गए हैं. HbSC रोगी के प्रतिनिधि वक्र एक कम वसूली से पता चलता है, जो एक अलग sickling प्रक्रिया का संकेत हो सकता है (चित्र 4बी). एचबीएसएस रोगियों के प्रतिनिधि वक्रों को हाइड्रॉक्सीयूरिया (एचयू) के साथ उपचारित किया जाता है और आधान चित्र 4ग तथा चित्र 4ठ में दर्शाया गयाहै। जाहिर है, वहाँ एच एस लक्षण के प्रतिनिधि घटता के बीच एक बड़ा अंतर है (HbAS कोशिकाओं) और HbSSS रोगियों के RBCs आधान के साथ इलाज किया (homogygous सिकल का एक मिश्रण का संबंध (HbSS) और समयुग्मज सामान्य (HbAAA) कोशिकाओं, चित्रा 4ए ,डी)। अनुपचारित एससीडी रोगी और एचयू तथा रक्ताधान उपचारित रोगियों के वक्रों में स्पष्ट अंतर इस परख की उपयोगिता पर प्रकाश डालता है (चित्र 4ग,डी) । HbF और HbS के स्तर काफी EIमिनट के साथ सहसंबद्ध और, एक हद तक कम करने के लिए, POS के साथ (चित्र 5ए-डी). यह इंगित करता है कि उन प्रयोगशाला पैरामीटर है कि रोगी के मूल्यांकन में महत्वपूर्ण हैं भी ऑक्सीजन ढाल ektacytometry में परिलक्षित होते हैं. नॉर्मोक्सिया में रुग्ण कोशिकाओं की संख्या और घने आरबीसी (DRBCs) के प्रतिशत दोनों EImax मूल्यों को प्रभावित करते हैं, क्योंकि वे काफी सहसंबद्ध हैं (चित्र 5ई-एफ), जो इंगित करता है कि EImax में एक और महत्वपूर्ण कारक को दर्शाता है रुग्ण प्रक्रिया. ये परिणाम दिखाते हैं कि कैसे विभिन्न विशेषताओं इस तरह है %HbS, %HbF, normoxia पर बीमार कोशिकाओं, और %DRBCs विभिन्न मापदंडों को प्रभावित.
चित्र 1| एक्टासाइटोमीटर की योजनाबद्ध स्थापना। कोशिकाओं पर कतरनी तनाव लागू करने के लिए एक Couette प्रणाली का उपयोग करता है. एक रोटेशन बाहरी सिलेंडर (कप) और एक स्थिर आंतरिक सिलेंडर (बॉब) 37 डिग्री सेल्सियस पर लेमिनर प्रवाह के निर्माण से कतरनी तनाव प्रेरित करने के लिए उपयोग किया जाता है। बॉब और कप के बीच एक छोटा सा अंतराल है जिसमें रक्त निलंबन इंजेक्शन है। एक लेजर बीम रक्त निलंबन के माध्यम से बॉब से चमकता है और RBCs की उपस्थिति से बिखरे हुए है. विवर्तन पैटर्न का अनुमान लगाया जाता है और कैमरे द्वारा विश्लेषण किया जाता है। दीर्घीकरण सूचकांक (ईआई) की गणना विवर्तन पैटर्न4की ऊँचाई (ं) तथा चौड़ाई (इ) से की जाती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2| ऑक्सीजन ढाल ektacytotry मॉड्यूल के साथ ektacytometer के योजनाबद्ध सेटअप. नाइट्रोजन गैस के अर्क के साथ धीरे-धीरे रक्त निलंबन के deoxygenation से पता चलता है कि मॉड्यूल के Schematic आरेख (एन2)। ऑक्सीजन तनाव एलईडी फाइबर से ओ2-स्पॉटकरने के लिए भेजा luminophore संकेत के शमन की मात्रा से मापा जाता है। deoxygenation पर, सिकल RBCs सिकल करने के लिए शुरू कर देंगे, उनके विकृति कम हो जाएगा, और वे अब अंडाकार RBCs के साथ संरेखित करेगा. रुग्ण आरबीसी विवर्तन पैटर्न को विकृत कर देगा, एक दीर्घवृत्त से विषमकोणीय या हीरे की तरह आकार में इसके आकार को बदल देगा। विवर्तन पैटर्न के आकार में यह परिवर्तन ईआई की कमी का परिणाम है। पो2 और ईआई के मापन कप में एक ही ऊंचाई पर नहीं किए जाते हैं। यह deoxygenation और reoxygenation घटता के बीच बेहतर भेदभाव सुनिश्चित करता है और, इसलिए, वक्र की एक बेहतर व्याख्या. यह आंकड़ा राब एट अल से संशोधित किया गया है22कृपया यहाँ क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.
चित्र 3| प्रतिनिधि ऑक्सीजन प्रवणता एकासाइटोमिति वक्र और विवर्तन पैटर्न। (क)ऑक्सीजन प्रवणता एक्टासाइटोमिति के समान परिस्थितियों में विऑक्सीजनीकरण पर, सिकल आरबीसी निर्धारित किया गया था। नियंत्रण सिकल RBCs में, एक ही स्थिति का इस्तेमाल किया गया, लेकिन नाइट्रोजन गैस के बिना. विऑक्सीजनित सिकल आरबीसी नियंत्रण आरबीसी के विपरीत आकार में परिवर्तन दिखाते हैं।(बी) अपऑक्सीजन तथा अपरूपण प्रतिबल (30 प), विवर्तन पैटर्न दीर्घवृत्त से समचतुर्भुज में परिवर्तित होता है। (ग)ऑक्सीजन प्रवणता एक्टासाइटोमेट्री का प्रतिनिधि वक्र। अधिकतम दीर्घीकरण सूचकांक (EIअधिकतम) आधारभूत स्थिति का प्रतिनिधित्व करता है और कुल आरबीसी जनसंख्या की एक समग्र विकृति से पता चलता है. न्यूनतम ईआई (ईआईमिन) न्यूनतम विकृति का प्रतिनिधित्व करता है, जो deoxygenation पर आरबीसी के आकार और अभिविन्यास में परिवर्तन के कारण होता है। [EI (dEI, EIअधिकतम और EIन्यूनतमके बीच में अंतर ) से पता चलता है कि कितने कोशिकाओं deoxygenation के एक दौर के दौरान सिकल कर सकते हैं. sickling के बिंदु (पीओएस, पीओ2 पर 5% ईआई कमी) ऑक्सीजन तनाव से पता चलता है जब पहली RBCs सिकल शुरू करते हैं. वक्र के अंतर्गत क्षेत्रफल (पो2मिन से 100 mmHg) की गणना पैरामीटर क्षेत्र में की जाती है। यह EIअधिकतम,EIन्यूनतम, और POS को सारांशित करता है। reoxygenation के दौरान unsickle करने के लिए sickled कोशिकाओं की क्षमता पैरामीटर वसूली में प्रतिनिधित्व किया है (ईऑक्सीजन के दौरान पहुँच ई अधिकतम का प्रतिशत). व्याख्या में सहायता करने के लिए, सभी डेटा बिंदुओं को रेखांकन परिणाम प्रस्तुत करने के लिए एक पंक्ति द्वारा हर व्यक्ति के प्रयोग में जुड़े थे. यह आंकड़ा राब एट अल से संशोधित किया गया है22कृपया यहाँ क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.
चित्र 4| ऑक्सीजन ढाल ektacytotry पैरामीटर एससीडी के साथ एससीडी रोगियों के जीनोटाइप और उपचार regimens के साथ सहसंबंधित. (ए)एचबीएस वाहकों (एचबीएस विशेषता) के आरबीसी का प्रतिनिधि ग्राफ और अनुपचारित एचबीएसएस रोगियों के संबंध में स्वस्थ नियंत्रण। (ख) अनुपचारित HbSS रोगियों के संबंध में हीमोग्लोबिन अनुसूचित जाति रोग (HbSC) के साथ रोगियों की आरबीसी के प्रतिनिधि ग्राफ. (ग)हाइड्रॉक्सीयूरिया के आरबीसी के प्रतिनिधि ग्राफ का इलाज अशोधित एचबीएसएस रोगियों के संबंध में समयुग्मज एससीडी रोगियों (एचबीएसएचयू) का उपचार किया गया। (घ)बिना इलाज किए गए एचबीएसएस रोगियों के संबंध में रक्त आधान (एचबीएसएस आधान) के साथ इलाज किए गए एचबीएसएस रोगियों के आरबीसी का प्रतिनिधि ग्राफ। यह आंकड़ा राब एट अल से संशोधित किया गया है22कृपया यहाँ क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.
चित्र 5| ऑक्सीजन ग्रेडिएंट एक्टासाइटोमेट्री पैरामीटर %HbF, %HbS, normoxia पर %sickled कोशिकाओं और %dense RBCs के साथ जुड़े रहे हैं। (क)रक्ताधान के बिना 15HbSS या HbS/ (B) ईआईन्यूनतम और %HbS के रैखिक सहसंबंध (C) पोस और %HbF के रैखिक सहसंबंध (D) पोस और %HbS के रैखिक सहसंबंध . (E) अधिकतम ईआई (ईआईअधिकतम) के रैखिक सहसंबंध और पर रुग्ण कोशिकाओं का प्रतिशत नॉर्मॉक्सिया को डिजिटल माइक्रोस्कोपी के साथ मापा जाता है। (च)एचबीएसएस वाले 21 रोगियों के ईआईअधिकतम और प्रतिशत सघन आरबीसी (%डीआरसी) का रैखिक सहसंबंध। यह आंकड़ा राब एट अल से संशोधित किया गया है22कृपया यहाँ क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.
| सेटिंग्स | ||
| फ़ाइलें | संग्रहण निर्देशिका | |
| सामान्य विकल्प | डिफ़ॉल्ट मध्यम चिपचिपापन | पीवीपी की विशालता |
| pO2 स्कैन | न्यूनतम आकांक्षा समय (s) | 60 |
| pO2 अपरूपण तनाव (पा) | 30 | |
| PO2 प्रत्येक (S) निर्धारित करें | 20 | |
| औसत आकार ले जा रहा है | 2 | |
| pO2 स्कैन कदम; संपादित | 0 -ऑफ; 60 -पर; 1360 -ऑफ; 1640 -ऑफ | |
| Cal. के बीच क्षेत्र (mmHg) | 10 और 100 | |
| PO2 नियंत्रण | बंद (अनचेककिया) |
तालिका 1. एक्टासाइटोमीटर की पसंदीदा सेटिंग।
Discussion
यहाँ हम ऑक्सीजन प्रवणता एक्टासाइटोमेट्री का वर्णन करते हैं, एक विधि जिसका उपयोग ऑक्सीजन सांद्रता की श्रेणी के अंतर्गत एससीडी रोगियों से लाल रक्त कोशिकाओं के रुग्ण व्यवहार का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है(चित्र 4 तथा चित्र 5)। पुन: उत्पादनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए, परिणामों को प्रभावित करने वाले कारकों की पहचान करना महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, तापमान आरबीसी विकृति पर एक बड़ा प्रभाव पड़ता है, ज्यादातर चिपचिपा समाधान (PVP) की मोटाई पर इसके प्रभाव के कारण. हम अच्छी तरह से 37 डिग्री सेल्सियस के लिए मशीन गर्मी करने के लिए दिन के शुरू में एक परीक्षण माप प्रदर्शन की सलाह देते हैं। यह परिणामों की पुन: उत्पादन क्षमता में सुधार होगा। चिपचिपा समाधान की osmolarity एक संकीर्ण सीमा के भीतर होना चाहिए (282-286 mOsm/kg PVP के लिए), क्योंकि osmolarity जलयोजन स्थिति को प्रभावित करती है, जो बारी में आरबीसी विकृति को प्रभावित करता है. पीवीपी के पीएच और चिपचिपापन को भी कसकर विनियमित किया जाना चाहिए। पीएच और तापमान में अंतर वक्रों को नाटकीय रूप से22तक प्रभावित कर सकता है। इसके अतिरिक्त, कप, बॉब, और ट्यूबों में शेष पानी, RBCs के lysis कारण हो सकता है, जिससे गलत डेटा में जिसके परिणामस्वरूप, क्योंकि कप में मौजूद कम बरकरार RBCs मापा जाएगा.
ऑक्सीजन प्रवणता ektacytometry प्रदर्शन करने के लिए सेटिंग्स विशिष्ट जांच प्रश्नों को संबोधित करने के लिए समायोजित किया जा सकता है। पसंदीदा सेटिंग्स तालिका 1में सूचीबद्ध हैं। 1,300 s के एक deoxygenation समय दिखा रहा है कि deoxygenation के विस्तार ज्यादातर रोगियों के लिए एक कम EIमिनट में परिणाम नहीं था टिप्पणियों के आधार पर चुना गया था. इसके विपरीत, विऑक्सीजन समय को कम करने से ऑक्सीजन प्रवणता एक्टैटोमेट्री की भेदभावकारी शक्ति बाधित हो जाती है। reoxygenation समय reoxygenation के दौरान तेजी से हल HbS पॉलिमर के कारण 280 s करने के लिए सेट किया गया था, और deoxygenation से पहले मापा मूल्यों की ओर ईआई के सहवर्ती बहाली. शीर तनाव को 30 पा पर सेट किया गया था, जो परासरणी प्रवणता एक्टासाइटोमेट्री के अनुरूप है। इस पैरामीटर को कम करने से भेदभाव की शक्ति बाधित हो सकती है। deoxygenation नियंत्रण इस्तेमाल किया जा सकता है अगर deoxygenation गति का एक सेट हर रोगी के नमूने के लिए लागू किया जाता है. हमारी पसंदीदा सेटिंग्स में, इस विकल्प को बंद कर दिया गया था क्योंकि विऑक्सीजन की दर अद्वितीय हीमोग्लोबिन वियोजन वक्र के कारण रोगी-विशिष्ट है। इसलिए, deoxygenation नियंत्रण पर स्विचन परख से इस विशेषता को खत्म होगा. तथापि, ऑक्सीजन प्रवणता एक्टासाइटोमेट्री की यह विशेषता अभी भी जांच के अधीन है।
कई प्रसिद्ध कारक ऑक्सीजन प्रवणता एक्टासाइटोमेट्री पैरामीटर को प्रभावित करते हैं, अर्थात् पीएच, तापमान, और अमोलता। एक्साइटोमेट्री, विशेष रूप से पीओएस, 2,3-डाइफॉस्फोग्लिसेरेट (2,3-डीपीजी)22से प्रभावित है। इसके अलावा, %HbF और EIमिनटके बीच एक स्पष्ट सहसंबंध है , और कुछ हद तक पीओएस (चित्र 5ए-डी) । ईआईअधिकतम normoxia पर सिकल कोशिकाओं के साथ जुड़ा हुआ है, जो अवलोकन की व्याख्या कर सकते हैं कि शीघ्र ही एक VOC के बाद, normoxia पर आरबीसी विकृति (ईआईअधिकतम),अधिक है. बाद में सबसे बीमार कोशिकाओं के विनाश के कारण होता है, और इसलिए वीओसी16के दौरान कम विकृत RBCs . जैसा कि चित्र 5चमें दर्शायागया है , उच्च %dense RBCs (एक हीमोग्लोबिन सांद्रता के साथ RBCs के रूप में परिभाषित किया गया है और 1.11 मिलीग्राम/एमएल) एक कम ईआईअधिकतमके साथ दृढ़ता से सहसंबंधित . यह इंगित करता है कि घने कोशिकाओं normoxia पर आरबीसी विकृति में एक महत्वपूर्ण कारक हैं, पहले की सूचना दी परिणाम1के समान .
नमूनों का मानकीकरण पुन: उत्पादनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए और विभिन्न जीनोटाइप और उपचार के बीच भेद करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। आरबीसी की संख्या विवर्तन पैटर्न की तीव्रता को प्रभावित करने के रूप में आरबीसी की संख्या के रूप में आरबीसी गिनती के लिए सही महत्वपूर्ण है। यदि बॉब और कप के बीच के अंतराल में कम आरबीसी संख्याएं मौजूद हैं, तो वक्र ऊपर की ओर और बाईं ओर खिसकाएगा। इसके अतिरिक्त, वक्र उतार चढ़ाव होगा, मानकों की सटीक गणना में बाधा, विशेष रूप से POS.
इस तकनीक की एक सीमा यह है कि EI मान सभी कोशिकाओं के एक औसत का प्रतिनिधित्व करता है, विभिन्न subpopulations सहित. एससीडी रोगियों में आरबीसी की आबादी की विषमता और एक्टासाइटोमेट्री माप पर इसके प्रभाव का गहन अध्ययन किया गया है। इसके परिणामस्वरूप मानकीकरण हुआ जिसमें विवर्तन पैटर्न के आकार को आरबीसी गणना23,24के लिए सही करने के बजाय एक निश्चित मान में समायोजित कर दिया जाता है . चाहे या नहीं मानकीकरण के इस तरह भी ऑक्सीजन ढाल ektacytotry माप करने के लिए लागू किया जाना चाहिए वर्तमान में अध्ययन के तहत है.
हाइपोक्सिक परिस्थितियों के तहत आरबीसी विकृति को मापने के लिए कई तकनीकों को एक्टीसाइटोमीटर25,26,27के बाहर हुए डिऑक्सीजन कदम के आधार पर विकसित किया गया . इन परिस्थितियों में, शारीरिक पीएच25के तहत एचबीएस लक्षण और स्वस्थ नियंत्रण वाले रोगियों के बीच सेलुलर व्यवहार में अंतर नहीं देखा गया। ऑक्सीजन प्रवणता एक्टासाइटोमेट्री, तथापि, स्पष्ट रूप से HbS लक्षण वाले व्यक्तियों में कम लेकिन स्पष्ट स्थिति दर्शाती है (चित्र 4क)। तारीख करने के लिए, नियमित नैदानिक अभ्यास में, केवल वैकल्पिक तरीकों इन विट्रो में सिकल के लिए एक व्यक्ति रोगी RBCs की प्रवृत्ति को मापने के लिए एक आकृति विज्ञान आधारित sickling परख शामिल हैं: RBCs शर्तों है कि HbS बहुलकीकरण को बढ़ावा देने के तहत incubated रहे हैं, जैसे कम ऑक्सीजन तनाव या कम पीएच. ऊष्मायन के बाद एक स्थिर जोड़ा जाता है और बीमार कोशिकाओं का प्रतिशत मैन्युअल रूप से या डिजिटल रूप से प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके गिना जाता है। कई पूर्व नैदानिक और प्रारंभिक चरण फार्माकोलॉजिक परीक्षण sickling परख का उपयोग करने के लिए एक माध्यमिक परिणाम चर उत्पन्न करने के लिए एससीडी28,29,30,31 में नैदानिक प्रभावकारिता की भविष्यवाणी करने में सक्षम हो ,32. हालांकि, यह समय लगता है, परिवर्तनशीलता उच्च है और संवेदनशीलता कम है, तकनीक स्वचालित नहीं है और, इसलिए, श्रम गहन. इसके अलावा, बीमार के कारण आकृतिपरिवर्तनीय परिवर्तन शारीरिक मापदंडों, जैसे आरबीसी विकृति के साथ अच्छी तरह से सहसंबंधित नहीं हो सकता है, क्योंकि यह एक 2-आयामी स्थैतिक परख2है।
ऑक्सीजन प्रवणता एक्टासाइटोमेट्री रुग्णों की एक कार्यात्मक परख प्रदान करती है जो तीव्र और पुनरुत्पाद्य होती है। यह एक इन विट्रो परीक्षण है जो एंडोथेलियल सतह पर विचार नहीं करता है। हालांकि, यह sickling व्यवहार और आरबीसी विशेषताओं के कार्यात्मक पहलुओं प्रदान करता है, यह सिकल सेल अध्ययन के लिए एक आशाजनक तकनीक बना रही है. तकनीक के भविष्य के अनुप्रयोगों SCD रोगियों में उपचार प्रभावकारिता की निगरानी शामिल, नए उपचार रणनीतियों के लिए एक biomarker के रूप में सेवारत, sickling व्यवहार का अध्ययन, और SCD में स्टेम सेल प्रत्यारोपण के बाद झंकार की निगरानी.
Disclosures
लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा करते हैं.
Acknowledgments
यह काम भाग में एक Eurostars अनुदान estar18105 द्वारा और आरआर Mechatronics द्वारा प्रदान की एक अप्रतिबंधित अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था. लेखक अपने तकनीकी सहायता के लिए Sisto Hendriks और जन डे zoeten धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADVIA 120 Hematology Analyzer | Siemens | 067-A004-14 | Instrument |
| Cell-Dyn Sapphire Hematology Analyzer | Abbott | 8H00-01 | Instrument |
| Lorrca | RR Mechatronics | LORC109230 or LORC109110 | Instrument |
| Lorrca Software version V5.08 | RR Mechatronics | - | Software |
| Nitrogen gas 4.8 or 5.0 | Local | - | |
| O2-spot | RR Mechatronics | PO2S020153 | O2 measurement |
| Oxygenscan module (pO2scan) | RR Mechatronics | PO2S109000 | Add-on |
| Oxy-ISO | RR Mechatronics | QRR 030905 | Viscous solution |
| X-Clean | RR Mechatronics | QRR 010946 | Cleaning solution Lorrca |
References
- Clark, M. R., Mohandas, N., Shohet, S. B. Deformability of oxygenated irreversibly sickled cells. Journal of Clinical Investigation. 65 (1), 189-196 (1980).
- Smith, C., Kuettner, J., Tukey, D., White, J. Variable Deformability of Irreversibly Sickled Erythrocytes. Blood. 58 (1), 71-78 (1981).
- Clark, M., Mohandas, N., Embury, S., Lubin, B. A simple laboratory alternative to irreversibly sickled (ISC) counts. Blood. 60 (3), 659-663 (1982).
- DaCosta, L., et al. Diagnostic tool for red blood cell membrane disorders Assessment of a new generation ektacytometer. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 56 (1), 9-22 (2016).
- Rabai, M., et al. Deformability analysis of sickle blood using ektacytometry. Biorheology. 51 (2-3), 159-170 (2014).
- Ballas, S. K., Mohandas, N. Sickle red cell microrheology and sickle blood rheology. Microcirculation. 11 (2), 209-225 (2004).
- Connes, P., Alexy, T., Detterich, J., Romana, M., Hardy-Dessources, M. D., Ballas, S. K. The role of blood rheology in sickle cell disease. Blood Reviews. 30 (2), 111-118 (2015).
- Hierso, R., et al. Effects of oxidative stress on red blood cell rheology in sickle cell patients. British Journal of Haematology. 166 (4), 601-606 (2014).
- Mozar, A., et al. Red blood cell nitric oxide synthase modulates red blood cell deformabilityin sickle cell anemia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 64 (1), 47-53 (2016).
- Clark, M. R., Mohandas, N., Shohet, S. B. Osmotic Gradient Ektacytometry: Comprehensive Characterization of Red Cell Volume and Surface Maintenance. Blood. 61 (5), 899-911 (1983).
- Parrow, N. L., et al. Measurements of red cell deformability and hydration reflect HbF and HbA2in blood from patients with sickle cell anemia. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 65, 41-50 (2017).
- Steinberg, M. H., Chui, D. H. K., Dover, G. J., Sebastiani, P., Alsultan, A. Fetal hemoglobin in sickle cell anemia: A glass half full. Blood. 123 (4), 481-485 (2014).
- Ballas, S. K., Larner, J., Smith, E. D., Surrey, S., Schwartz, E., Rappaport, E. F. Rheologic predictors of the severity of the painful sickle cell crisis. Blood. 72 (4), 1216-1223 (1988).
- Lande, W. M., et al. The Incidence of Painful Crisis in Homozygous Sickle Cell Disease: Correlation with Red Cell Deformability. Blood. 72 (6), 2056-2059 (1988).
- Lemonne, N., et al. Does increased red blood cell deformability raise the risk for osteonecrosis in sickle cell anemia. Blood. 121 (15), 3054-3057 (2013).
- Ballas, S. K., Smith, E. D. Red blood cell changes during the evolution of the sickle cell painful crisis. Blood. 79 (8), 2154-2163 (1992).
- Telen, M. Cellular adhesion and the endothelium: E-selectin, L-selectin, and pan-selectin inhibitors. Hematology/Oncology Clinics of North America. 28 (2), 341-354 (2014).
- Papageorgiou, D. P., et al. Simultaneous polymerization and adhesion under hypoxia in sickle cell disease. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (38), 201807405 (2018).
- Liu, J., Qiang, Y., Alvarez, O., Du, E. Electrical impedance microflow cytometry with oxygen control for detection of sickle cells. Sensors and Actuators, B: Chemical. 255, 2392-2398 (2018).
- Du, E., Diez-Silva, M., Kato, G. J., Dao, M., Suresh, S. Kinetics of sickle cell biorheology and implications for painful vasoocclusive crisis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (5), 1422-1427 (2015).
- Li, Q., et al. Kinetic assay shows that increasing red cell volume could be a treatment for sickle cell disease. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (5), 689-696 (2017).
- Rab, M. A. E., et al. Rapid and reproducible characterization of sickling during automated deoxygenation in sickle cell disease patients. American Journal of Hematology. 94, February 575-584 (2019).
- Renoux, C., et al. Importance of methodological standardization of ektacytometric measures of red blood cell deformability in sickle cell anemia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 62 (2), 173-179 (2016).
- Parrow, N. L., et al. Measuring Deformability and Red Cell Heterogeneity in Blood by Ektacytometry. Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).
- Bessis, M., Feo, C., Jones, E. Quantitation of red cell deformability during progressive deoxygenation and oxygenation in sickling disorders (the use of an automated Ektacytometer). Blood Cells. 8 (1), 17-28 (1982).
- Sorette, M. P., Lavenant, M. G., Clark, M. R. Ektacytometric measurement of sickle cell deformability as a continuous function of oxygen tension. Blood. 67 (6), 1600-1606 (1987).
- Huang, Z., Hearne, L., Irby, C. E., King, S. B., Ballas, S. K., Kim-Shapiro, D. B. Kinetics of increased deformability of deoxygenated sickle cells upon oxygenation. Biophysical journal. 85 (4), 2374-2383 (2003).
- Antoniani, C., et al. Induction of fetal hemoglobin synthesis by CRISPR/Cas9-mediated editing of the human β-globin locus. Blood. 131 (17), 1960-1973 (2018).
- Abdulmalik, O., et al. Crystallographic analysis of human hemoglobin elucidates the structural basis of the potent and dual antisickling activity of pyridyl derivatives of vanillin. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (12), 1076 (2011).
- Oder, E., Safo, M. K., Abdulmalik, O., Kato, G. J., Discovery, D. New Developments in Anti-Sickling Agents: Can Drugs Directly Prevent the Polymerization of Sickle Haemoglobin In Vivo. British Journal of Haematology. 175 (1), 24-30 (2016).
- Oksenberg, D., et al. GBT440 increases haemoglobin oxygen affinity, reduces sickling and prolongs RBC half-life in a murine model of sickle cell disease. British Journal of Haematology. 175 (1), 141-153 (2016).
- Xu, G. G., et al. Synthesis, and Biological Evaluation of Ester and Ether Derivatives of Antisickling Agent 5-HMF for the Treatment of Sickle Cell Disease. Molecular Pharmaceutics. 14 (10), 3499-3511 (2017).
