Summary
Här presenterar vi syregradient ektacytometri, en snabb och reproducerbar metod för att mäta röda blodkroppar deformabilitet i prover från patienter med sicklecellanemi under kontrollerad deoxygenering och reoxygenering. Denna teknik ger ett sätt att studera röda blodkroppar patologiska och att övervaka sicklecellanemi behandlingseffekt.
Abstract
I sicklecellanemi (SCD), en enda punktmutation i genen kodning för beta-globin orsakar produktionen av onormala hemoglobin S (HbS). När deoxygenated, HbS kan polymerisera, bildar stela stavar av hemoglobin, vilket resulterar i sjukling av röda blodkroppar (RBCs). Dessa sickled RBCs har signifikant minskad deformabilitet, orsakar vaso-ocklusion, vilket leder till många SCD-relaterade kliniska komplikationer, inklusive smärta, stroke, och organskador. RBC deformability reduceras också genom RBC dehydrering, vilket resulterar i täta röda blodkroppar som är mer benägna att skära. Hittills finns det inte en enda allmänt tillgänglig, snabb, och reproducerbara laboratorieanalys kan förutsäga sjukdomens svårighetsgrad eller direkt övervakning av Behandlingseffekterna för nya, icke-fetala hemoglobin inducerande terapier. I denna studie, vi beskriver ett protokoll för att mäta RBC deformability som en funktion av pO2 som möjliggör kvantifiering av sjukling beteende hos SCD-patienter. Syregradienten ektacytometri mäter RBC-deformabilitet, uttryckt som förlängningen (EI), som en funktion av pO2. RBCs utsätts för en fast skjuvning stress av 30 pa under en omgång av deoxygenation och reoxygenation. Sex parametrar för avläsning produceras. Av dessa, den punkt av sjukling (PoS), definierad som pO2 vid vilken maximal EI (eiMax) visar en 5% minskning, och minimum EI under DEOXYGENATION (eimin) är de mest informativa, återspeglar en enskild patients pO2 där sjukling börjar och den minimala deformabiliteten hos patientens röda blodkroppar. PoS är associerat med en individuell patients hemoglobin affinitet för syre, medan EImin visar en stark korrelation med fetalt hemoglobin nivåer. Vi drar slutsatsen att syregradienten ektacytometry är en lovande teknik för att övervaka behandlingen av patienter med SCD, som en biomarkör för anti-sjukling agenter i kliniska och prekliniska prövningar, och ett viktigt verktyg för att studera patologiska beteende av RBCs från individer med SCD och sicklecelldrag.
Introduction
I SCD, en enda punktmutation resultat i produktionen av HbS, som kan polymerisera på deoxygenation. HbS polymerisation orsakar sjukling av RBCs och minskar RBC deformabilitet. Kombinationen av RBC patologiska och RBC anslutning till endotelet leder till olika SCD komplikationer, inklusive vaso-ocklusiv kriser (VOC), stroke, organskador, och kronisk hemolytisk anemi. Även vid behandling villkor, RBC deformabilitet äventyras hos patienter med SCD. Deformabilitet minskas ytterligare vid låga syrekoncentrationer. Nyckelspelare som bestämmer deformabilitet vid normoxia är täta celler, oåterkalleligt sjukliga celler (ISC), och dehydrerade celler, som alla har en minskad yta till volymförhållandet1,2,3.
Ektacytometri är en etablerad metod för att mäta RBC deformability, ofta används för diagnos av ärftliga hemolytiska anemier, särskilt membranopatier4. Det kan också användas för att studera hemorheologi5,6,7,8,9. Osmotisk gradient ektacytometri, där RBC deformability mäts under en kontinuerlig förändring i osmolalitet, har använts för att studera SCD i över ett decennium10,11. Andelen fetalt hemoglobin (HbF) är en av de starkaste hämmare av HbS polymerisation eftersom varken HbF eller dess blandade hybrid tetramer (∝ 2βSγ) kan komma in i deoxyHbS polymer fas12. Nyligen genomförda studier tyder på att ökande HbF nivåer i SCD-patienter leder till en bättre yta-till-volym-förhållande, vilket förbättrar hydrering tillstånd och därmed deformability i icke transfixerade patienter11.
RBC deformability har studerats tidigare som en biomarkör för SCD komplikationer, men med motstridiga resultat. I studier som utfördes tvärsektionellt och vid steady state konstaterades att individer med högre RBC-deformerbarhet hade en högre incidens av osteonekros och mer smärt kriser13,14,15. I motsats till dessa fynd, jämfört med de steady state värden under en akut VOC, minskade RBC deformabilitet i longitudinella studier inom samma individer16. Denna avvikelse kan vara resultatet av studier av RBC-deformabilitet under olika förhållanden (dvs. under steady state kontra VOC). Andelen sjuknade celler är hög i början av en VOC och cellerna förstörs snabbt när krisen fortskrider, vilket kan förklara skillnaden mellan de tvärsnittsdata för steady state och longitudinella data som erhålls under VOC. Emellertid, andra faktorer, såsom följsamhet av RBC subpopulationer till endoteliala ytan, kan också vara viktigt i förekomsten av VOC. I SCD, det är mer kliniskt relevant att mäta deformabilitet under deoxygenation, eftersom vaso-ocklusion förekommer vanligtvis i hypoxisk postkapillära venoler och inte i mindre hypoxisk microcapillary nätverk17. Dessutom kan närvaron av ISCs förändra förmågan hos en ektacytometer att mäta deformabilitet vid normoxia. Förvrängning av diffraktions mönstret orsakas av iSCS, vilket resulterar från icke-anpassningen underflödet1,2,3.
Alternativa metoder för att studera patofysiologin av VOC inkluderar mätningar av RBC anslutning till en konstgjord yta18, Single cell elektrisk impedans microflow flödescytometrianalys19, microfluidic-baserade modeller som kombinerar kvantitativa mätningar av cellen sjuklig och unsickling med Single cell rheologi20, och laserinducerad polymerisation21. Även lovande, dessa tekniker är kostsamma, arbetsintensiva, och kräver omfattande förarutbildning. Dessutom, de analyser som är morfologi-baserade saknar förmågan att studera cellulära beteende, såsom deformabilitet, som en funktion av en syregradient.
I denna studie beskriver vi en snabb och reproducerbar funktionell analys utförd med en ektacytometer. Detta är en nästa generations ektakytometri mätning som mäter de olika kvalitativa aspekterna av RBC deformability uttryckt som EI under deoxygenation (1 300 s) och snabb reoxygenation (280 s). Dessa tidsintervall möjliggör HbS polymerbildning, och därmed uppkomsten av morfologiska förändringar och sedan återhämtning. Deoxygenation sker genom att införa kvävgas, som sakta minskar syre spänningen i blodprovet i gapet mellan Bob och kopp ektacytometer. RBC deformability mäts kontinuerligt medan syre spänningen mäts var 20: an med hjälp av en liten O2-fläck som finns i väggen på koppen. Under provningen är cirka 80 pO2 mätningar kopplade till EI mätt vid det tillfället. Syre trycket sjunker under 20 mmHg under avsyresättning, och reoxygenering underlättas av passiv diffusion av omgivningsluften. Den experimentella installationen av ektacytometer och syregradienten ektacytometry modul beskrivs i figur 1 och figur 2. Principen för ektacytometri är baserad på RBC-inducerad spridning av ljus från en laserstråle. Detta resulterar i ett elliptiskt diffraktionsmönster när skjuvspänningen appliceras samtidigt (figur 1).
Protocol
Alla förfaranden godkändes av etikkommittén vid University Medical Center Utrecht (UMCU) och i enlighet med Helsingforsdeklarationen. Patienter inskrivna vid Texas Children ' s hematologi Center (TCHC) godkändes av den lokala IRB och i enlighet med Helsingforsdeklarationen.
1. allmänna överväganden
- Börja med att utföra en test mätning för att värma upp Bob och Cup. Se till att temperaturen på Bob och Cup är 37 ° c. Detta är viktigt för god reproducerbarhet.
- Säkerställ att den trögflytande polyvinylpyrrolidon (PVP) lösningen faller inom de strikta gränserna för osmolaritet (282 – 286 mOsm/kg), pH (7.35 – 7.45) och viskositet (27,5 – 32,5 MPa) vid rumstemperatur (22 ° c).
Obs: PVP måste användas vid rumstemperatur. Om den förvaras vid en lägre temperatur, se till att den har värmde upp till rumstemperatur innan du tar några mätningar.
2. uppstart av ektacytometer
- Slå på datorn och ektacytometer från bak. Starta programvaran (tabell över material) på datorn.
- Se till att kvävgasen är tillgänglig för att deoxygenate provet genom att öppna kväve cylindern.
- Sänk Bob i koppen och se till att koppen kan vända fritt. Rengör koppen på insidan och utsidan med en mjuk trasa och destillerat vatten, eftersom skräp kan hämma EI mätningar.
- När programvaran körs, kontrollera följande meddelande på skärmen: "Se till att gasventilen är öppen" och klicka på OK.
- Kontrollera att ektacytometer startar den Self-check-process för IO2 som visas på skärmen. Välj Start (RETUR). Om det misslyckas, kör självkontrollen genom att klicka på maskinvarukontroll | pO2 | Självkontroll.
Anmärkning: om självkontrollen misslyckas igen, Överväg att ersätta O2-spot. O2-spot ersätts genom att försiktigt trycka ut fläcken från insidan av koppen med fingertopparna. En ny plats är placerad genom att försiktigt trycka på plats från utsidan i koppen. - Välj pO2 -skanning från de olika testerna som listas till vänster. Välj Inställningar till höger på skärmen och se till att de är inställda enligt parametrarna som anges i tabell 1. Behåll samma inställningar för varje mätning.
- För att spara dessa inställningar, tryck OK | OK.
Obs: önskade inställningar listas i tabell 1 men kan justeras enligt användarpreferenser och prövnings syfte. Till exempel, för att studera den sjukling beteende mer omfattande, deoxygenation hastighet och varaktighet kan ändras.
3. provinsamling och beredning
Anmärkning: för validering av tekniken, etylendiamamin tetraättiksyra (EDTA)-behandlat blod från 38 SCD patienter och 5 friska kontroller som ingår i University Medical Center Utrecht eller Texas Children ' s hematologi Center, i olika kliniska studier ( Nederländernas prövnings register [NTR] Identifier, NTR 6779 och NTR 6462), samt anonymiserade rester av blodprov från patienter som besökte öppenvårds kliniken eller som lades in på sjukhus.
- Samla blodprov genom venipunktering (minst 300 μL/prov) i ett rör som innehåller EDTA. Se till att blodet har lagrats i minst 30 min vid 4 ° c, men inte längre än 24 h.
Anmärkning: citrat fosfat dextros adenin (CPDA) eller heparin kan också användas, men påverkan av dessa reagenser på provet bevarande med avseende på syregradienten ektacytometry är inte välkänd. - Blanda provet försiktigt med inversion för att homogenisera. Skaka inte provet. Låt provet värma upp till rumstemperatur på en rullbänk före mätningen.
Anmärkning: ett prov rör (9 – 10 mL) som lagras i mer än 1 h vid 4 ° c måste värmas upp i 15 minuter. Vid förvaring i mindre än 1 h vid 4 ° c måste den värmas upp i 10 minuter. Ett prov rör (2 – 6 mL) som lagras i mer än 1 h vid 4 ° c måste värmas upp i 10 minuter. Vid förvaring i mindre än 1 h vid 4 ° c måste den värmas upp i 5 minuter. - Mät hela blod räkningen på en hematologisk analysator. För att göra detta, ta 20 – 200 μL helblod i ett rör som innehåller EDTA. Placera aspirationskanylen i röret och tryck på knappen bakom nålen på hematologianalysatorn för att starta mätningen.
Anmärkning: i hela blod räkningen mäts RBC-numret, vilket är en viktig faktor för standardisering av mätningarna av syregradienten ektacytometri. RBC räkna beräknas från framåt och sidled scatter med flödescytometri. Normal RBC-räkning i friska kontroller är 3,7 – 5,0 x 1012/l för kvinnor och 4,2 – 5,5 x 1012/l för män. RBC-antalet hos patienter med SCD är generellt minskat. Vissa hematologiska analysatorer kommer också att mäta procent täta röda blodkroppar (% DRBC) som kan vara av ytterligare värde i tolkningen av individuella syregradienten ektacytometry kurvor. - Standardisera hela blodprovet till en RBC-räkning på 200 x 106 RBCs i 5 ml PVP (200 x 106 RBCs/Vial) genom att justera volymen av provet som kommer att tillsättas. Om det totala antalet RBC är mindre än 200 x 106kommer diffraktions mönstret och EI att påverkas.
- Använd ekvationen nedan för att utföra räkningen.
4.0/XX (x 1012/l) x 50 = yy μl helblod/INJEKTIONSflaska PvP
där xx är det beräknade antalet RBC som erhålls från steg 3,3 och yy är den mängd helblod som krävs för den faktiska mätningen. Beroende på graden av anemi och andra faktorer som påverkar RBC räknas, mängden helblod som krävs är 40 – 90 μL.
- Använd ekvationen nedan för att utföra räkningen.
4. syregradient ektacytometri mätning
- Pipettera den beräknade provvolymen (yy μL blod) till PVP för att få en total volym på 5 mL. Prewet spetsen genom att försiktigt omlägga blodet 3x. Använd pipettspetsen med en bred öppning för att undvika ytterligare påfrestningar på de röda blodkropparna. Blanda försiktigt provet manuellt genom inversion tills det är homogent.
Obs: öppna PVP injektionsflaskan så kort tid som möjligt för att undvika luftkontakt. - Dra långsamt 2,0 mL av blod/PVP blandningen i en 3 mL spruta utan nålen. Tryck in kolven för att avlägsna synliga luftbubblor och överdriven provlösning tills 1,5 – 1,8 mL finns kvar i sprutan (beroende på koppvolymen).
- Injicera den totala provvolymen långsamt och jämnt i Bob genom kopplingen. Se till att nivån på provet är ovanför syresensorn (rosa fläck) och ovanför det lilla sughålet. Lämna inte någon provlösning i sprutan.
- Klicka på ny och fyll i exempel-ID, anmärkningar, datum för donation, och viskositet PvP. Klicka på OK | Aspirera. Efter 60 s, kommer koppen rotera och aspirera provet för 15 s. Klicka på OK när rotationen avbryts. Stäng maskinens lock. Klicka på Fortsätt | Börja nu, som syregradienten ektacytometry görs med en fast förstärkning. Mätningen tar ca 28 min.
- Efter mätningen skriver du ut rapporten som visar kurvan och parametrarna som automatiskt beräknas av programvaran. Kontrollera att rådata lagras automatiskt i den angivna mappen i Inställningar. Maximal EI (EIMax), minimum EI (eimin), pO2@ 95% EI (POS) och Area (område under kurvan) beräknas automatiskt och läggs till i den utskrivna rapporten och rådata.
- Hämta ΔEI manuellt genom att beräkna differensen mellan EIMax och EImin. Beräkna den procentuella återhämtningen genom att ta skillnaden i medelvärde EI före avsyresättning (pO2 100 – 120 mmHg) och medelvärdet för EI-värden under reoxygenering vid 100 – 120 mmHg.
5. rengöring av ektacytometern
- Ta ut prov sprutan och ersätt den med en spruta fylld med destillerat vatten eller avjoniserat vatten.
- Tryck på Clean, sakta spolning av kontakten under sköljningen. Se till att spola i båda riktningarna.
- Ta bort sprutan och lyft Bob. Torka av Bob, kopp och kontakt ordentligt med en mjuk trasa.
- Använd en stor spruta (10 – 50 mL) för att spola kontakten för att avlägsna eventuellt vatten som finns kvar i rören och Bob. Blockera den nedre inloppet/utlopp Bob att få tillbaka trycket i rören, vilket tar bort kvarvarande vatten.
- Sänk Bob i koppen. Maskinen är nu klar för nästa mätning.
6. avstängning av maskinen
- Se till att maskinen sköljs ordentligt efter den sista mätningen, enligt beskrivningen ovan. Se till att de rätta rören rör rengöringslösningen.
- Stäng programvaran, tryck på Stäng och tryck på Start för att starta programmet för rengöring i slutet av dagen.
- Efter avslutad hela rengöringsprogrammet, ta bort sprutan och lyft Bob. Spola kontakten med en stor spruta.
- Töm avfallsflaskan och torka Bob och koppen med en mjuk trasa. Spola kontakten för att avlägsna det vatten som återstår i rören och Bob. Blockera den nedre inloppet/utloppet av Bob att få tillbaka trycket i rören, vilket tar bort eventuella kvarvarande vatten.
- Stäng locket på maskinen. Stäng kväve cylindern. Stäng av datorn och maskinen.
Representative Results
Syregradient ektacytometri kan användas för att karakterisera sjukling beteende hos patienter med SCD. I denna studie ingick blodprov från totalt 38 SCD-patienter och fem friska kontroller. I friska kontroller är diffraktions mönstret cirkulärt i vila och elliptisk vid högre skjuvning stress4. Från det elliptiska diffraktions mönstret beräknas förlängnings index (EI) utifrån höjden och bredden på diffraktions mönstret. I syregradienten ektacytometri, långsam och kontinuerlig deoxygenering av provet med kvävgas följs av snabb reoxygenering av luften. Under dessa förhållanden, RBC patologiska kan observeras under deoxygenation. Detta kommer att orsaka en snedvridning av diffraktions mönstret eftersom sickled röda celler inte kommer att justeras korrekt under tillämpad skjuvning stress. Därför verkar de vara mindre deformerbara i motsats till friska röda blodkroppar (figur 2).
Figur 3A visar hur skäran RBCs förändras i form vid deoxygenering, som härmade förhållanden under syregradienten ektacytometri, medan kontroll skäran RBCs utan deoxygenation visar ingen förändring i form. Denna process resulterar i snedvridning av diffraktions mönstret under syregradienten ektacytometri, och därmed i en minskning av EI. Figur 3B visar de olika diffraktions mönstren från vilka olika parametrar genereras.
En representativ kurva som erhålls genom ektacytometern visas i figur 3C. Sex parametrar återspeglar olika egenskaper för sjukling beteende RBCs: EIMax är den maximala EI i början av mätningen innan deoxygenation. Den här parametern representerar baslinjens position och återspeglar den totala deformabiliteten hos den sammanlagda populationen av RBC i luften. EImin är den minsta ei, som representerar minimal deformabilitet efter deoxygenering. Den här parametern återspeglar förändringar i formen och orienteringen av (skäran) RBCs vid avsyresättning. ΔEI är skillnaden mellan EIMax och EImin, vilket indikerar hur många celler som kan skäras under en runda av avsyresättning. 5% punkt av sickling (PoS5%) är den pO2 (mmHg) vid vilken en 5% minskning av EIMax under deoxygenation mäts. Detta representerar syre spänningen där sjukling processen börjar. Området återspeglar arean under kurvan, som bestäms av en integrerad beräkning av EI-och pO2 -mätningar mellan 100 mmHg och Po2min (mmHg). Detta är resultatet av tidigare beskrivna parametrar EIMax, eimin, och POS. återhämtning representerar skillnaden i EI under den sista delen av reoxygenering jämfört med EI vid baseline. Båda EI-värdena mäts vid en pO2 på 100 – 120 mmHg. Denna parameter återspeglar kapaciteten hos RBCs att skära under deoxygenering att vända patologiska under reoxygenation22. Parametrar från dubbla mätningar hade i allmänhet en variationskoefficient (CV) < 5% (median 1,83%). Om ett CV > 5% erhölls genomfördes en tredje mätning. Parametrarna EIMax och Recovery är de mest reproducerbara med median CVS < 1%.
Representativa kurvor av RBCs av friska kontroller, patienter med HBS drag (heterozygot HBS), och en homozygot SCD patienten visas i figur 4a. Den representativa kurvan för HBSC-patienten visar en lägre återhämtning, vilket kan tyda på en annan patologiska process (figur 4B). De representativa kurvorna av HbSS-patienter som behandlats med Hydroxyurea (HU) och transfusion visas i figur 4C och figur 4D. Det är uppenbart att det finns en stor skillnad mellan de representativa kurvorna av HS-karaktärsdrag (HBA-celler) och RBCs hos Hbss-patienter som behandlats med transfusion (bestående av en blandning av homozygot skäran (Hbss) och homozygot normala (hbaa) celler, figur 4a ,D). De tydliga skillnaderna i kurvor för obehandlad SCD-patient och HU-och transfusions behandlade patienter belyser nyttan av denna analys (figur 4C,D). HbF-och HbS-nivåerna korrelerade signifikant med EImin och, i mindre utsträckning, med POS (figur 5a–D). Detta indikerar att de laboratorieparametrar som är viktiga vid utvärderingen av patienten också återspeglas i syregradienten ektacytometri. Antalet sickled celler vid normoxia och procent av täta RBCs (DRBCs) påverkar båda EImax-värden, eftersom de är signifikant korrelerade (figur 5E–F), vilket indikerar att eimax återspeglar en annan viktig faktor i sjukling process. Dessa resultat visar hur olika egenskaper så har% HbS,% HbF, sickled celler vid normoxia, och% DRBCs påverkar olika parametrar.
Figur 1. Schematisk inställning av ektacytometern. Den ektacytometer använder en Couette system för att tillämpa skjuvning stress på cellerna. En rotation yttre cylinder (kopp) och en statisk inre cylinder (Bob) används för att inducera skjuvning stress genom att skapa laminärt flöde vid 37 ° c. Mellan Bob och Cup finns en liten lucka där blod suspensionen injiceras. En laserstråle lyser från Bob genom blod suspensionen och sprids genom närvaron av RBCs. Diffraktions mönstret projiceras och analyseras av en kamera. Tationsindex (EI) beräknas med höjden (a) och bredden (b) i diffraktions mönstret4. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Schematisk inställning av ektacytometer med syregradient ektacytometri modul. Schematiskt diagram över den modul som visar desyresättning av blod suspensionen långsamt med infusion av kvävgas (N2). Syre spänningen mäts med den mängd släckning av luminofor-signalen som skickas från LED-fiber till O2-spot. Vid avsyresättning kommer skäran RBCs att börja skära, deras deformabilitet kommer att minska, och de kommer inte längre att anpassa sig till elliptiska RBCs. Den sjukliga RBCs kommer att snedvrida diffraktion mönstret, ändra sin form från en ellips till en romb eller diamant-liknande form. Denna förändring i form av diffraktions mönstret resulterar i en minskning av EI. Mätningar av pO2 och EI utförs inte på samma höjd i koppen. Detta säkerställer bättre diskriminering mellan deoxygenation och reoxygenation kurvor och därmed en bättre tolkning av kurvan. Denna siffra har modifierats från Rab et al.22vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Representativ syregradient ektacytometri kurva och diffraktionsmönster. Avid avsyresättning under förhållanden som liknar syregradienten ektacytometri, har skäran RBCs fastställts. I kontroll skäran RBCs, samma villkor användes, men utan kvävgas. Deoxygenated skäran RBCs visar en förändring i form i motsats till kontroll RBCs. (B) vid deoxygenering och skjuvning stress (30 Pa), diffraktion mönstret ändras från en ellips till en Rhomboid. Crepresentativ kurva för syregradienten ektacytometri. Det maximala förlängnings indexet (EIMax) representerar utgångspositionen och visar en övergripande deformerbarhet för den totala RBC-populationen. Minimum EI (EImin) representerar minimal deformerbarhet, som orsakas av förändringen i form och orientering av RBCs vid deoxygenering. ΔEI (dEI, skillnaden i EI mellan EIMax och EImin) visar hur många celler kan skära under en runda av deoxygenation. Point of patologiska (POS, pO2 vid 5% EI minskning) visar syre spänningen när de första RBCs börjar skära. Arean under kurvan (från pO2min = 100 mmHg) beräknas i parameter området. Detta summerar EIMax, eiminoch POS. Kapaciteten av sickled celler till unsickle under reoxygenation representeras i parametern återhämtning (procent av EIMax uppnåtts under reoxygenation). För att underlätta tolkningen var alla datapunkter sammankopplade i varje enskilt experiment med en linje för att grafiskt presentera resultaten. Denna siffra har modifierats från Rab et al.22vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Syre lutning ektacytometry parametrar korrelerar med genotyp och behandlingsregimer av SCD-patienter med SCD. (A) representativ kurva över RBCs av HBS-bärare (HBS-drag) och friska kontroller i förhållande till obehandlade Hbss-patienter. B) representativ kurva över RBCs hos patienter med Hemoglobinsjukdom (HBSC) i förhållande till obehandlade Hbss-patienter. C) representativ kurva över RBCs av Hydroxyurea behandlade HOMOZYGOT SCD-patienter (Hbss hu) i förhållande till obehandlade Hbss-patienter. D) representativ kurva över RFC av Hbss-patienter som behandlats med blodtransfusion (Hbss-transfusion) i förhållande till obehandlade Hbss-patienter. Denna siffra har modifierats från Rab et al.22vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Syregradienten ektacytometry parametrar är associerade med% HbF,% HbS,% sickled celler vid normoxia och% täta RBCs. (A) linjär korrelation mellan minimi-och förlängnings index (eimin) och% Hbf av 15 Hbss-eller HBS/β-Thalassemia-patienter utan transfusion. Blinjär KORRELATION mellan EImin och% HBS.Clinjär korrelation av POS och% Hbf.Dlinjär korrelation mellan POS och% HBS.elinjär korrelation av högsta EIMaxoch procent av sjuka celler vid normoxia mätt med digital mikroskopi. Flinjär KORRELATION av EIMax och procentuell tät RBCs (% drbcs) av 21 patienter med Hbss. Denna siffra har modifierats från Rab et al.22vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Inställningar | ||
| Filer | Lagrings katalog | |
| Allmänna alternativ | Standard medium viskositet | Viskositet PVP |
| pO2 Scan | Minsta aspirationstid (er) | 60 |
| pO2 Scan skjuvning stress (PA) | 30 | |
| Bestäm pO2 varje (S) | 20 | |
| Glidande medelstorlek | 2 | |
| pO2 Scan steg; Redigera | 0-AV; 60-PÅ; 1360 – AV; 1640-OFF | |
| Område mellan (mmHg) | 10 och 100 | |
| pO2-kontrollen | Av (avmarkerad) |
Tabell 1. Önskad inställning av ektacytometern.
Discussion
Här beskriver vi syregradient ektacytometri, en metod som kan användas för att studera det sjukling beteendet hos röda blodkroppar från SCD-patienter under en rad syrekoncentrationer (figur 4 och figur 5). För att få reproducerbara resultat är det viktigt att identifiera de faktorer som påverkar resultatet. Till exempel har temperaturen en stor inverkan på RBC deformability, främst på grund av dess effekter på tjockleken av trögflytande lösning (PVP). Vi rekommenderar att du utför en test mätning i början av dagen för att grundligt värma upp maskinen till 37 ° c. Detta kommer att förbättra reproducerbarheten av resultaten. Den osmolaritet av trögflytande lösning bör vara inom ett smalt intervall (282-286 mOsm/kg för PVP), eftersom osmolaritet påverkar hydrering status, vilket i sin tur påverkar RBC deformabilitet. PH och viskositet PVP bör också vara hårt reglerad. Skillnader i pH och temperatur kan påverka kurvor dramatiskt22. Dessutom, resterande vatten i koppen, Bob, och rör, kan orsaka lys av RBCs, vilket resulterar i felaktiga data, eftersom färre intakta RBCs som finns i koppen kommer att mätas.
Inställningar för att utföra syregradient ektacytometri kan justeras för att lösa specifika prövnings frågor. Önskade inställningar listas i tabell 1. En deoxygenation tid på 1 300 s valdes baserat på observationer som visar att förlängningen av deoxygenation inte resultera i en lägre EImin för de flesta patienter. Däremot skulle en förkortning av deoxygenationstiden hämma den diskriminerande kraften hos syregradienten ektacytometri. Den reoxygenation tiden var satt till 280 s på grund av den snabbt lösa HbS polymerer under reoxygenation, och samtidig restaurering av EI mot värden som mäts före deoxygenering. Skjuvning stress var inställd på 30 Pa, vilket är analogt med den osmotiska lutningen ektacytometry. En sänkning av denna parameter kan hämma den diskriminerande kraften. Avsyresättning kan användas om en uppsättning avsyresättning tillämpas på varje patientprov. I våra föredragna inställningar, detta alternativ var avstängd eftersom graden av deoxygenation är patientspecifik på grund av den unika hemoglobin dissociation kurvan. Därför, slå på deoxygenation kontroll skulle eliminera denna egenskap från analysen. Emellertid, denna funktion av syregradient ektacytometri är fortfarande under utredning.
Flera välkända faktorer påverkar syregradienten ektacytometry parametrar, nämligen pH, temperatur, och osmolaritet. Ektacytometri, speciellt PoS, påverkas av 2, 3-diphosphoglycerate (2, 3-DPG)22. Det finns också ett tydligt samband mellan% HbF och EImin, och i mindre utsträckning POS (figur 5a–D). EIMax är associerad med sickleceller vid normoxia, som kan förklara observationen att kort efter en VOC, RBC deformability vid normoxia (eiMax), är högre. Den senare orsakas av förstörelsen av de mest sjuka cellerna, och därmed mindre deformerbara röda blodkroppar under VOC16. Som visas i figur 5F, högre% täta RBCs (definierad som RBCs med en hemoglobin koncentration ≫ 1,11 mg/ml) korrelerar starkt med en lägre EIMax. Detta indikerar att täta celler är en viktig faktor i RBC deformability vid normoxia, liknande tidigare rapporterade resultat1.
Standardisering av prover är mycket viktigt för att erhålla reproducerbara resultat och för att skilja mellan olika genotyper och behandlingar. Korrigera för RBC räkna är viktigt, eftersom antalet RBCs påverka intensiteten i diffraktions mönstret. Om det finns lägre RBC-nummer i gapet mellan Bob och Cup, kommer kurvan att skifta uppåt och till vänster. Dessutom kommer Kurvan fluktuera, hämmar korrekt beräkning av parametrarna, särskilt PoS.
En begränsning av denna teknik är att EI-värdet representerar ett genomsnitt av alla celler, inklusive olika subpopulationer. Heterogenitet av RBC populationer hos SCD-patienter och dess påverkan på ektacytometri mätning har studerats intensivt. Detta resulterade i standardisering vari storleken på diffraktion mönstret justeras till ett fast värde i stället för korrigeras för RBC greve23,24. Huruvida detta sätt för standardisering bör också tillämpas på syre lutning ektacytometry mätningar är för närvarande under studie.
Flera tekniker för att mäta deformabilitet av RBC under hypoxiska förhållanden utvecklades baserat på ett deoxygenationssteg som ägde rum utanför ektacytometern25,26,27. Under dessa förhållanden observerades inte skillnader i cellulära beteenden mellan patienter med HbS-egenskaper och friska kontroller under Fysiologiskt pH25. Syregradienten ektacytometri visar dock tydligt en låg men tydlig PoS hos individer med HbS drag (figur 4a). Hittills, i rutinmässig klinisk praxis, de enda alternativa metoder för att mäta tendensen hos en enskild patients RBCs att skära in vitro inkluderar en morfologi-baserade patologiska assay: RBCs inkuberas under förhållanden som främjar HBS polymerisation, såsom låg syre spänning eller lågt pH. En fixativ tillsätts efter inkubering och andelen sickled celler manuellt eller digitalt räknas med hjälp av ljusmikroskopi. Många prekliniska och tidig fas farmakologiska prövningar använder sjukling analysen för att generera en sekundär utfall variabel för att kunna förutsäga klinisk effekt i SCD28,29,30,31 ,32. Det är dock tidskrävande, variabiliteten är hög och känsligheten är låg, tekniken är inte automatiserad och därför arbetsintensiva. Dessutom kan morfologiska förändringar på grund av sjukling inte korrelera väl med fysiologiska parametrar, såsom RBC deformability, eftersom det är en 2-dimensionell statisk analys2.
Syregradienten ektacytometry ger en funktionell analys av sjukling som är snabb och reproducerbar. Detta är ett in vitro-test som inte beaktar endotelytan. Emellertid, det ger funktionella aspekter av sjukling beteende och RBC egenskaper, vilket gör det en lovande teknik för skäran cellstudier. Framtida tillämpningar av tekniken omfattar övervakning av behandlingseffekten hos SCD-patienter, som fungerar som en biomarkör för nya behandlingsstrategier, studerar sjukling beteende, och övervakning chimärism efter stamcellstransplantation i SCD.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av ett Eurostars Grant estar18105 och av ett fritt bidrag från RR Mechatronics. Författarna tackar Sisto Hendriks och Jan de Zoeten för deras tekniska stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADVIA 120 Hematology Analyzer | Siemens | 067-A004-14 | Instrument |
| Cell-Dyn Sapphire Hematology Analyzer | Abbott | 8H00-01 | Instrument |
| Lorrca | RR Mechatronics | LORC109230 or LORC109110 | Instrument |
| Lorrca Software version V5.08 | RR Mechatronics | - | Software |
| Nitrogen gas 4.8 or 5.0 | Local | - | |
| O2-spot | RR Mechatronics | PO2S020153 | O2 measurement |
| Oxygenscan module (pO2scan) | RR Mechatronics | PO2S109000 | Add-on |
| Oxy-ISO | RR Mechatronics | QRR 030905 | Viscous solution |
| X-Clean | RR Mechatronics | QRR 010946 | Cleaning solution Lorrca |
References
- Clark, M. R., Mohandas, N., Shohet, S. B. Deformability of oxygenated irreversibly sickled cells. Journal of Clinical Investigation. 65 (1), 189-196 (1980).
- Smith, C., Kuettner, J., Tukey, D., White, J. Variable Deformability of Irreversibly Sickled Erythrocytes. Blood. 58 (1), 71-78 (1981).
- Clark, M., Mohandas, N., Embury, S., Lubin, B. A simple laboratory alternative to irreversibly sickled (ISC) counts. Blood. 60 (3), 659-663 (1982).
- DaCosta, L., et al. Diagnostic tool for red blood cell membrane disorders Assessment of a new generation ektacytometer. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 56 (1), 9-22 (2016).
- Rabai, M., et al. Deformability analysis of sickle blood using ektacytometry. Biorheology. 51 (2-3), 159-170 (2014).
- Ballas, S. K., Mohandas, N. Sickle red cell microrheology and sickle blood rheology. Microcirculation. 11 (2), 209-225 (2004).
- Connes, P., Alexy, T., Detterich, J., Romana, M., Hardy-Dessources, M. D., Ballas, S. K. The role of blood rheology in sickle cell disease. Blood Reviews. 30 (2), 111-118 (2015).
- Hierso, R., et al. Effects of oxidative stress on red blood cell rheology in sickle cell patients. British Journal of Haematology. 166 (4), 601-606 (2014).
- Mozar, A., et al. Red blood cell nitric oxide synthase modulates red blood cell deformabilityin sickle cell anemia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 64 (1), 47-53 (2016).
- Clark, M. R., Mohandas, N., Shohet, S. B. Osmotic Gradient Ektacytometry: Comprehensive Characterization of Red Cell Volume and Surface Maintenance. Blood. 61 (5), 899-911 (1983).
- Parrow, N. L., et al. Measurements of red cell deformability and hydration reflect HbF and HbA2in blood from patients with sickle cell anemia. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 65, 41-50 (2017).
- Steinberg, M. H., Chui, D. H. K., Dover, G. J., Sebastiani, P., Alsultan, A. Fetal hemoglobin in sickle cell anemia: A glass half full. Blood. 123 (4), 481-485 (2014).
- Ballas, S. K., Larner, J., Smith, E. D., Surrey, S., Schwartz, E., Rappaport, E. F. Rheologic predictors of the severity of the painful sickle cell crisis. Blood. 72 (4), 1216-1223 (1988).
- Lande, W. M., et al. The Incidence of Painful Crisis in Homozygous Sickle Cell Disease: Correlation with Red Cell Deformability. Blood. 72 (6), 2056-2059 (1988).
- Lemonne, N., et al. Does increased red blood cell deformability raise the risk for osteonecrosis in sickle cell anemia. Blood. 121 (15), 3054-3057 (2013).
- Ballas, S. K., Smith, E. D. Red blood cell changes during the evolution of the sickle cell painful crisis. Blood. 79 (8), 2154-2163 (1992).
- Telen, M. Cellular adhesion and the endothelium: E-selectin, L-selectin, and pan-selectin inhibitors. Hematology/Oncology Clinics of North America. 28 (2), 341-354 (2014).
- Papageorgiou, D. P., et al. Simultaneous polymerization and adhesion under hypoxia in sickle cell disease. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (38), 201807405 (2018).
- Liu, J., Qiang, Y., Alvarez, O., Du, E. Electrical impedance microflow cytometry with oxygen control for detection of sickle cells. Sensors and Actuators, B: Chemical. 255, 2392-2398 (2018).
- Du, E., Diez-Silva, M., Kato, G. J., Dao, M., Suresh, S. Kinetics of sickle cell biorheology and implications for painful vasoocclusive crisis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (5), 1422-1427 (2015).
- Li, Q., et al. Kinetic assay shows that increasing red cell volume could be a treatment for sickle cell disease. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (5), 689-696 (2017).
- Rab, M. A. E., et al. Rapid and reproducible characterization of sickling during automated deoxygenation in sickle cell disease patients. American Journal of Hematology. 94, February 575-584 (2019).
- Renoux, C., et al. Importance of methodological standardization of ektacytometric measures of red blood cell deformability in sickle cell anemia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 62 (2), 173-179 (2016).
- Parrow, N. L., et al. Measuring Deformability and Red Cell Heterogeneity in Blood by Ektacytometry. Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).
- Bessis, M., Feo, C., Jones, E. Quantitation of red cell deformability during progressive deoxygenation and oxygenation in sickling disorders (the use of an automated Ektacytometer). Blood Cells. 8 (1), 17-28 (1982).
- Sorette, M. P., Lavenant, M. G., Clark, M. R. Ektacytometric measurement of sickle cell deformability as a continuous function of oxygen tension. Blood. 67 (6), 1600-1606 (1987).
- Huang, Z., Hearne, L., Irby, C. E., King, S. B., Ballas, S. K., Kim-Shapiro, D. B. Kinetics of increased deformability of deoxygenated sickle cells upon oxygenation. Biophysical journal. 85 (4), 2374-2383 (2003).
- Antoniani, C., et al. Induction of fetal hemoglobin synthesis by CRISPR/Cas9-mediated editing of the human β-globin locus. Blood. 131 (17), 1960-1973 (2018).
- Abdulmalik, O., et al. Crystallographic analysis of human hemoglobin elucidates the structural basis of the potent and dual antisickling activity of pyridyl derivatives of vanillin. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (12), 1076 (2011).
- Oder, E., Safo, M. K., Abdulmalik, O., Kato, G. J., Discovery, D. New Developments in Anti-Sickling Agents: Can Drugs Directly Prevent the Polymerization of Sickle Haemoglobin In Vivo. British Journal of Haematology. 175 (1), 24-30 (2016).
- Oksenberg, D., et al. GBT440 increases haemoglobin oxygen affinity, reduces sickling and prolongs RBC half-life in a murine model of sickle cell disease. British Journal of Haematology. 175 (1), 141-153 (2016).
- Xu, G. G., et al. Synthesis, and Biological Evaluation of Ester and Ether Derivatives of Antisickling Agent 5-HMF for the Treatment of Sickle Cell Disease. Molecular Pharmaceutics. 14 (10), 3499-3511 (2017).
