Summary
Hier präsentieren wir Sauerstoffgradientenektacytometrie, eine schnelle und reproduzierbare Methode zur Messung der Deformierbarkeit roter Blutkörperchen in Proben von Patienten mit Sichelzellerkrankungen unter kontrollierter Deoxygenierung und Reoxygenierung. Diese Technik bietet eine Möglichkeit, rote Blutkörperchen Sichel zu studieren und Dieelzell-Krankheit Behandlung Wirksamkeit zu überwachen.
Abstract
Bei der Sichelzellerkrankung (SCD) verursacht eine Einzelpunktmutation im Gen, das für Beta-Globin kodiert, die Produktion von abnormalem Hämoglobin S (HbS). Wenn hbS deoxygeniert ist, kann es polymerisieren und starre Hämoglobinstäbe bilden, was zum Sicheln roter Blutkörperchen (RBCs) führt. Diese gekränkten RBCs haben die Verformbarkeit deutlich reduziert und vaso-okklusion verursacht, was zu zahlreichen SCD-bedingten klinischen Komplikationen führt, einschließlich Schmerzen, Schlaganfall und Organschäden. RBC-Deformierbarkeit wird auch durch RBC-Dehydrierung reduziert, was zu dichten roten Blutkörperchen führt, die eher Sichel sind. Bis heute gibt es keinen einzigen allgemein verfügbaren, schnellen und reproduzierbaren Labortest, der in der Lage ist, den Schweregrad der Erkrankung vorherzusagen oder die Behandlungseffekte für neuartige, nicht-fetale Hämoglobin-induzierende Therapien direkt zu überwachen. In dieser Studie beschreiben wir ein Protokoll zur Messung der RBC-Deformierbarkeit als Funktion von pO2, das die Quantifizierung des Sövrierungsverhaltens bei SCD-Patienten ermöglicht. Sauerstoffgradientektacytometrie misst rBC-Deformierbarkeit, ausgedrückt als Dehnungsindex (EI), in Abhängigkeit von pO2. RBCs sind während einer Runde der Deoxygenierung und Reoxygenierung einer festen Scherspannung von 30 Pa ausgesetzt. Es werden sechs Ausleseparameter erstellt. Von diesen ist der Als pO 2 definierter Sövrierungspunkt (PO2), bei dem die maximale EI (EImax)eine Abnahme von 5 % und die minimale EI während der Deoxygenierung (EImin) am informativsten ist und das pO2 eines einzelnen Patienten widerspiegelt, bei dem Die Sichelbildung beginnt und die minimale Verformbarkeit der roten Blutkörperchen eines Patienten. PoS ist mit der Hämoglobinaffinität eines einzelnen Patienten für Sauerstoff verbunden, während EImin eine starke Korrelation mit fetalen Hämoglobinspiegeln zeigt. Wir kommen zu dem Schluss, dass die Sauerstoffgradientenektacytometrie eine vielversprechende Technik zur Überwachung der Behandlung von Patienten mit SCD ist, als Biomarker für Anti-Sickling-Erreger in klinischen und präklinischen Studien und ein wichtiges Werkzeug zur Untersuchung des Sickling-Verhaltens von RBCs von Personen mit SCD- und Sichelzellmerkmalen.
Introduction
In SCD führt eine Einzelpunktmutation zur Produktion von HbS, das bei Deoxygenierung polymerisieren kann. HbS-Polymerisation verursacht Daskling von RBCs und reduziert die RBC-Verformbarkeit. Die Kombination von RBC-Sickling und RBC-Bindung an das Endothel führt zu verschiedenen SCD-Komplikationen, einschließlich vaso-okklusive Krisen (VOC), Schlaganfall, Organschäden und chronische hämolytische Anämie. Selbst bei normoxischen Bedingungen ist die RBC-Deformierbarkeit bei Patienten mit SCD beeinträchtigt. Die Verformbarkeit wird bei niedrigen Sauerstoffkonzentrationen weiter verringert. Schlüsselakteure, die die Verformbarkeit bei Normoxia bestimmen, sind dichte Zellen, irreversibel gesickerte Zellen (ISC) und dehydrierte Zellen, die alle ein verringertes Oberflächen-Volumen-Verhältnishaben 1,2,3.
Ektacytometrie ist eine etablierte Methode zur Messung der RBC-Deformierbarkeit, weit verbreitet für die Diagnose von erblichen hämolytischen Anämien, insbesondere Membranopathien4. Es kann auch verwendet werden, um Hämorheologie5,6,7,8,9zu studieren. Osmottische Gradientektacytometrie, in der Die RBC-Deformierbarkeit während einer kontinuierlichen Veränderung der Osmolalität gemessen wird, wurde verwendet, um SCD seit über einem Jahrzehnt zu untersuchen10,11. Der Anteil des fetalen Hämoglobins (HbF) ist einer der stärksten Inhibitoren der HbS-Polymerisation, da weder HbF noch sein gemischter Hybridtetramer in die DesoxyHbS-Polymerphase12eintreten können. Jüngste Studien deuten darauf hin, dass eine Erhöhung des HbF-Spiegels bei SCD-Patienten zu einem besseren Oberflächen-Volumen-Verhältnis führt, wodurch der Hydratationszustand und damit die Verformbarkeit bei nicht transfundierten Patienten11verbessert wird.
RBC-Deformierbarkeit wurde in der Vergangenheit als Biomarker für SCD-Komplikationen untersucht, jedoch mit widersprüchlichen Ergebnissen. In Studien, die querschnittsvoll und in einem stabilen Zustand durchgeführt wurden, wurden Personen mit höherer RBC-Deformierbarkeit eine höhere Inzidenz von Osteonekrose und mehr Schmerzkrisen13,14,15" festgestellt. Im Gegensatz zu diesen Befunden wurde im Vergleich zu den konstanten Zustandswerten während eines akuten VOC die RBC-Deformierbarkeit in Längsschnittstudien bei denselben Individuen 16 verringert16. Diese Diskrepanz kann das Ergebnis der Untersuchung der RBC-Verformbarkeit unter verschiedenen Bedingungen sein (d. h. während des stationären Zustands im Vergleich zu VOC). Der Anteil der gekränkten Zellen ist zu Beginn eines VOC hoch und die Zellen werden im Verlauf der Krise schnell zerstört, was den Unterschied zwischen den Daten der stationären Querschnittsinzidenz und den während des VOC erhaltenen Längsschnittdaten erklären kann. Andere Faktoren, wie die Adhärenz von RBC-Subpopulationen an der endotheliale Oberfläche, können jedoch auch für das Auftreten von VOC von Bedeutung sein. Bei SCD ist es klinisch relevanter, die Verformbarkeit während der Deoxygenierung zu messen, da Vaso-Okklusion typischerweise in den hypoxischen postkapillaren Venulen auftritt und nicht im weniger hypoxischen Mikrokapillarnetz17. Darüber hinaus kann das Vorhandensein von ISCs die Fähigkeit eines Ektacytometers verändern, die Verformbarkeit bei Normoxia zu messen. Die Verzerrung des Beugungsmusters wird durch ISCs verursacht, die sich aus der Blockfreiheit während des Durchflusses1,2,3ergeben.
Alternative Ansätze zur Untersuchung der Pathophysiologie von VOC umfassen Messungen der RBC-Haftung an einer künstlichen Oberfläche18, einzellige elektrische Impedanz-Mikroflusszytometrie19, mikrofluidische Modelle, die quantitative Messungen der Zellsickling und Unsickling mit einzelliger Rheologie20und laserinduzierter Polymerisation21. Obwohl vielversprechend, sind diese Techniken kostspielig, arbeitsintensiv und erfordern eine umfassende Bedienerschulung. Darüber hinaus fehlt den Morphologie-basierten Assays die Fähigkeit, das zelluläre Verhalten, wie z. B. die Verformbarkeit, als Funktion eines Sauerstoffgradienten zu untersuchen.
In dieser Studie beschreiben wir einen schnellen und reproduzierbaren funktionellen Test, der mit einem Ektacytometer durchgeführt wird. Dies ist eine Ektacytometrie-Messung der nächsten Generation, die die verschiedenen qualitativen Aspekte der RBC-Deformierbarkeit misst, ausgedrückt als EI während der Deoxygenierung (1.300 s) und der schnellen Reoxygenierung (280 s). Diese Zeitintervalle ermöglichen die HbS-Polymerbildung und damit das Auftreten morphologischer Veränderungen und dann die Rückgewinnung. Die Deoxygenierung erfolgt durch die Einführung von Stickstoffgas, das langsam die Sauerstoffspannung in der Blutprobe in der Lücke zwischen dem Bob und dem Becher des Ektacytometers verringert. Die RBC-Verformbarkeit wird kontinuierlich gemessen, während die Sauerstoffspannung alle 20 s mit Hilfe eines kleinenO2-Spotsgemessen wird, der in der Wand des Bechers vorhanden ist. Während des Tests werden ca. 80pO2-Messungen an die in diesem Moment gemessene EI gekoppelt. Der Sauerstoffdruck sinkt während der Deoxygenierung unter 20 mmHg, und die Reoxygenierung wird durch die passive Diffusion der Umgebungsluft erleichtert. Der versuchsweise Aufbau des Ektacytometers und des Moduls Ektacytometrie des Sauerstoffgradienten ist in Abbildung 1 und Abbildung 2beschrieben. Das Prinzip der Ektacytometrie basiert auf der RBC-induzierten Streuung von Licht von einem Laserstrahl. Dies führt zu einem elliptischen Beugungsmuster, wenn gleichzeitig Scherspannung angewendet wird (Abbildung 1).
Protocol
Alle Verfahren wurden von der Ethikkommission des Universitätsklinikums Utrecht (UMCU) und in Übereinstimmung mit der Erklärung von Helsinki genehmigt. Patienten, die am Texas Children es Hematology Center (TCHC) eingeschrieben waren, wurden vom örtlichen IRB und gemäß der Erklärung von Helsinki zugelassen.
1. Allgemeine Erwägungen
- Beginnen Sie mit einer Testmessung, um den Bob und den Pokal aufzuwärmen. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur des Bobs und der Tasse 37 °C beträgt. Dies ist wichtig für eine gute Reproduzierbarkeit.
- Stellen Sie sicher, dass die viskose Polyvinylpyrrolidonlösung (PVP) bei Raumtemperatur (22 °C) die strengen Grenzwerte für Osmolarität (282–286 mOsm/kg), pH(7,35–7,45) und Viskosität (27,5–32,5 MPa) einhalten.
HINWEIS: Der PVP muss bei Raumtemperatur verwendet werden. Wenn Sie bei einer niedrigeren Temperatur gelagert werden, stellen Sie sicher, dass es sich auf Raumtemperatur erwärmt hat, bevor Sie Messungen durchführen.
2. Inbetriebnahme des Ektacytometers
- Schalten Sie den Computer und das Ektacytometer von hinten ein. Starten Sie das Softwareprogramm (Tabelle der Materialien) auf dem Computer.
- Stellen Sie sicher, dass der Stickstoff zur Verfügung steht, um die Probe zu entsimieren, indem Sie die Stickstoffflasche öffnen.
- Senken Sie den Bob in der Tasse und stellen Sie sicher, dass der Becher frei drehen kann. Reinigen Sie den Becher innen und außen mit einem weichen Tuch und destilliertem Wasser, da Schmutz die EI-Messungen behindern kann.
- Wenn das Softwareprogramm läuft, überprüfen Sie die folgende Meldung auf dem Bildschirm:"Stellen Sie sicher, dass das Gasventil geöffnet ist" und klicken Sie auf OK.
- Stellen Sie sicher, dass das Ektacytometer den pO 2-Selbstüberprüfungsprozess startet, der auf dem Bildschirm angezeigt wird. Wählen Sie Start (enter). Wenn dies fehlschlägt, führen Sie die Selbstprüfung erneut aus, indem Sie auf Hardwareprüfung klicken | pO2 | Selbstkontrolle.
HINWEIS: Wenn die Selbstprüfung erneut fehlschlägt, sollten Sie denO2-Punktersetzen. Der O2-Punktwird ersetzt, indem der Fleck mit einer Fingerspitze sanft aus der Innenseite des Bechers herausgeschoben wird. Ein neuer Punkt wird platziert, indem man den Punkt sanft von außen in den Becher schiebt. - Wählen Sie pO2 Scan aus den verschiedenen Tests auf der linken Seite aufgeführt. Wählen Sie Einstellungen rechts auf dem Bildschirm aus, und stellen Sie sicher, dass sie gemäß den in Tabelle 1aufgeführten Parametern festgelegt sind. Behalten Sie die gleichen Einstellungen für jede Messung bei.
- Um diese Einstellungen zu speichern, drücken Sie OK | OK.
HINWEIS: Bevorzugte Einstellungen sind in Tabelle 1 aufgeführt, können jedoch entsprechend den Benutzerpräferenzen und Untersuchungszwecken angepasst werden. Um beispielsweise das Sichlingsverhalten umfassender zu untersuchen, können Deoxygenierungsgeschwindigkeit und -dauer verändert werden.
3. Probenentnahme und -zubereitung
HINWEIS: Zur Validierung der Technik wurde mit Ethylendiamin-Tetraessigsäure (EDTA) behandeltes Blut von 38 SCD-Patienten und 5 gesunden Kontrollen am University Medical Center Utrecht oder texas Children es Hämatology Center in verschiedenen klinischen Studien ( Es wurden anonymisierte Blutproben von Patienten verwendet, die die Ambulanz besuchten oder ins Krankenhaus eingeliefert wurden.
- Sammeln Sie Blutproben durch Venipunkton (mindestens 300 l/Probe) in einem Rohr, das EDTA enthält. Stellen Sie sicher, dass das Blut mindestens 30 min bei 4 °C gelagert wurde, jedoch nicht länger als 24 h.
HINWEIS: Citratphosphat-Dextrose-Adenin (CPDA) oder Heparin kann ebenfalls verwendet werden, aber der Einfluss dieser Reagenzien auf die Probenkonservierung in Bezug auf die Sauerstoffgradientenektacytometrie ist nicht bekannt. - Mischen Sie die Probe sanft durch Inversion, um zu homogenisieren. Schütteln Sie die Probe nicht. Lassen Sie die Probe vor der Messung auf einer Rollbank auf Raumtemperatur erwärmen.
HINWEIS: Ein Probenröhrchen (9–10 ml), das bei 4 °C mehr als 1 h gelagert wird, muss sich 15 min aufwärmen. Bei einer Lagerung von weniger als 1 h bei 4 °C muss er sich 10 min erwärmen. Ein Probenröhrchen (2–6 ml), das bei 4 °C mehr als 1 h gelagert wird, muss sich 10 min erwärmen. Bei einer Lagerung von weniger als 1 h bei 4 °C muss er sich 5 min erwärmen. - Messen Sie den vollständigen Blutbildant an einem Hämatologieanalysator. Nehmen Sie dazu 20–200 L Vollblut in eine Tube, die EDTA enthält. Legen Sie die Aspirationsnadel in das Rohr und drücken Sie die Taste hinter der Nadel des Hämatologieanalysators, um die Messung zu starten.
HINWEIS: Im vollständigen Blutbild wird die RBC-Zahl gemessen, was ein wichtiger Faktor für die Standardisierung der Sauerstoffgradienten-Ektacytometrie-Messungen ist. Die RBC-Anzahl wird aus vorwärts- und seitlicher Streuung durch Strömungszytometrie berechnet. Normale RBC-Anzahl bei gesunden Kontrollen ist 3,7–5,0 x 1012/L für Frauen und 4,2–5,5 x 1012/L für Männer. Die RBC-Anzahl bei Patienten mit SCD ist im Allgemeinen verringert. Einige hämatologische Analysatoren messen auch prozentweise dichte rote Blutkörperchen (% DRBC), die bei der Interpretation einzelner Sauerstoffgradienten-Ektacytometriekurven von zusätzlichem Wert sein können. - Standardisieren Sie die Blutprobe auf eine RBC-Anzahl von 200 x 106 RBCs in 5 ml PVP (200 x 106 RBCs/Vial), indem Sie das Volumen der Probe anpassen, die hinzugefügt wird. Wenn die Gesamtanzahl der RBC weniger als 200 x 106beträgt, sind das Beugungsmuster und die EI betroffen.
- Verwenden Sie die folgende Gleichung, um die Zählung durchzuführen.
4,0/xx (x 1012/L) x 50 = yy l Vollblut/Vial PVP
wobei xx die berechnete RBC-Zahl aus Schritt 3.3 und yy die Menge an Vollblut ist, die für die tatsächliche Messung erforderlich ist. Abhängig vom Grad der Anämie und anderen Faktoren, die die RBC-Anzahl beeinflussen, beträgt die benötigte Menge an Vollblut 40–90 l.
- Verwenden Sie die folgende Gleichung, um die Zählung durchzuführen.
4. Messung der Sauerstoffgradientenektacytometrie
- Pipette das berechnete Probenvolumen (yy l Blut) in PVP, um ein Gesamtvolumen von 5 ml zu erhalten. Die Spitze vorbefeuchten, indem Sie das Blut 3x sanft wieder aufsetzen. Verwenden Sie eine Pipettenspitze mit einer breiten Öffnung, um zusätzliche Belastung der RBCs zu vermeiden. Mischen Sie die Probe vorsichtig manuell durch Inversion, bis sie homogen ist.
HINWEIS: Öffnen Sie die PVP-Durchstechflasche so kurz wie möglich, um Luftkontakt zu vermeiden. - 2,0 ml der Blut/PVP-Mischung langsam in eine 3 ml Spritze ohne Nadel ziehen. Drücken Sie den Kolben, um sichtbare Luftblasen und übermäßige Probenlösung zu entfernen, bis 1,5–1,8 ml in der Spritze verbleiben (je nach Bechervolumen).
- Injizieren Sie das gesamte Probenvolumen langsam und gleichmäßig in den Bob durch den Stecker. Stellen Sie sicher, dass der Füllstand der Probe über dem Sauerstoffsensor (rosa Fleck) und über dem kleinen Saugloch liegt. Lassen Sie keine Probenlösung in der Spritze.
- Klicken Sie auf Neu, und geben Sie die Beispielkennung, die Anmerkungen, das Spendendatum und die Viskosität von PVP ein. Klicken Sie auf OK | Aspirat. Nach 60 s dreht sich der Becher und saugt die Probe für 15 s an. Klicken Sie auf OK, wenn die Drehung stoppt. Schließen Sie den Maschinendeckel. Klicken Sie auf Weiter | Starten Sie jetzt, da die Sauerstoffgradientenektacytometrie mit einer festen Verstärkung durchgeführt wird. Die Messung dauert ca. 28 min.
- Drucken Sie nach der Messung den Bericht, der die Kurve und die Parameter anzeigt, die automatisch von der Software berechnet werden. Stellen Sie sicher, dass die Rohdaten automatisch im angegebenen Ordner in den Einstellungengespeichert werden. Maximale EI (EImax), minimale EI (EImin), pO295%EI (PoS) und Fläche (Fläche unter der Kurve) werden automatisch berechnet und dem gedruckten Bericht und den Rohdaten hinzugefügt.
- Erhalten Sie manuell die EI, indem Sie die Differenz zwischen EImax und EIminberechnen. Berechnen Sie die prozentuale Erholung, indem Sie die Differenz der mittleren EI vor der Deoxygenierung (pO2 100–120 mmHg) und die mittleren EI-Werte während der Reoxygenierung bei 100–120 mmHg berücksichtigen.
5. Reinigung des Ektacytometers
- Entfernen Sie die Probenspritze und ersetzen Sie sie durch eine Spritze, die mit destilliertem Wasser oder entionisiertem Wasser gefüllt ist.
- Drücken Sie Clean, und spülen Sie den Stecker während des Spülens langsam. Achten Sie darauf, in beide Richtungen zu spülen.
- Entfernen Sie die Spritze und heben Sie den Bob an. Den Bob, die Tasse und den Stecker gründlich mit einem weichen Tuch trocknen.
- Verwenden Sie eine große Spritze (10–50 ml), um den Stecker zu spülen, um das in den Rohren und bob verbleibende Wasser zu entfernen. Blockieren Sie den unteren Einlass/Auslass des Bobs, um wieder Druck in die Rohre zu bekommen, wodurch verbleibendes Wasser entfernt wird.
- Senken Sie den Bob im Pokal. Die Maschine ist nun bereit für die nächste Messung.
6. Abschalten der Maschine
- Stellen Sie sicher, dass die Maschine nach der letzten Messung ordnungsgemäß gespült wird, wie oben beschrieben. Stellen Sie sicher, dass sich die richtigen Rohre auf die Reinigungslösung beziehen.
- Schließen Sie die Software, drücken Sie Schließen, und drücken Sie Start, um das End-of-Day-Reinigungsprogramm zu starten.
- Nach Abschluss des gesamten Reinigungsprogramms die Spritze entfernen und den Bob anheben. Spülen Sie den Stecker mit einer großen Spritze.
- Leeren Sie die Abfallflasche und trocknen Sie den Bob und die Tasse mit einem weichen Tuch. Spülen Sie den Stecker, um das in den Rohren verbleibende Wasser zu entfernen und zu bob. Blockieren Sie den unteren Einlass/Auslass des Bobs, um wieder Druck in die Rohre zu bekommen, wodurch das verbleibende Wasser entfernt wird.
- Schließen Sie den Deckel der Maschine. Schließen Sie den Stickstoffzylinder. Schalten Sie den Computer und das Gerät aus.
Representative Results
Sauerstoffgradientektacytometrie kann verwendet werden, um Das Sichelverhalten bei Patienten mit SCD zu charakterisieren. In dieser Studie wurden Blutproben von insgesamt 38 SCD-Patienten und fünf gesunde Kontrollen einbezogen. Bei gesunden Kontrollen ist das Beugungsmuster im Ruhezustand kreisförmig und elliptisch bei höherer Scherspannung4. Aus dem elliptischen Beugungsmuster wird der Dehnungsindex (EI) basierend auf der Höhe und Breite des Beugungsmusters berechnet. In der Sauerstoffgradientenektacytometrie folgt auf die langsame und kontinuierliche Desoxygenierung der Probe durch Stickstoffgas eine schnelle Reoxygenierung durch Umgebungsluft. Unter diesen Bedingungen kann rBC-Sichel unter Deoxygenierung beobachtet werden. Dies führt zu einer Verzerrung des Beugungsmusters, da gekränkte rote Zellen unter der angewendeten Scherspannung nicht richtig ausgerichtet werden. Daher scheinen sie weniger verformbar zu sein als gesunde RBCs (Abbildung 2).
Abbildung 3A zeigt, wie sich Sichel-RBCs bei Deroxygenierung in Ihrer Form verändern, die Bedingungen während der Sauerstoffgradientenektacytometrie nachahmte, während Kontrollsichel-RBCs ohne Deoxygenierung keine Formänderung aufweisen. Dieser Prozess führt zu einer Verzerrung des Beugungsmusters während der Sauerstoffgradientenektacytometrie und damit zu einer Abnahme der EI. Abbildung 3B zeigt die verschiedenen Beugungsmuster, aus denen verschiedene Parameter generiert werden.
Eine repräsentative Kurve, die durch das Ektacytometer erhalten wird, ist in Abbildung 3Cdargestellt. Sechs Parameter spiegeln unterschiedliche Merkmale des Sicklingverhaltens von RBCs wider: EImax ist die maximale EI zu Beginn der Messung vor der Deoxygenierung. Dieser Parameter stellt die Ausgangsposition dar und spiegelt die allgemeine Verformbarkeit der gesamten RBC-Population bei Umgebungsluft wider. EImin ist das minimale EI, das minimale Verformbarkeit nach Deoxygenierung darstellt. Dieser Parameter spiegelt Veränderungen in der Form und Ausrichtung von (Sichel-)RBCs bei Deoxygenierung wider. "EI" ist der Unterschied zwischen EImax und EImin, der angibt, wie viele Zellen sich während einer Deoxygenierungsrunde sichle. 5% Sicklingpunkt (PoS5%) ist der pO2 (mmHg), bei dem eine 5%ige Abnahme von EImax während der Deoxygenierung gemessen wird. Dies stellt die Sauerstoffspannung dar, bei der der Sichlingsprozess beginnt. Die Fläche unter der Kurve spiegelt die Fläche wider, die durch eine integrale Berechnung der EI- undpO2-Messungen zwischen 100 mmHg und pO2min (mmHg) bestimmt wird. Dies ist das Ergebnis der zuvor beschriebenen Parameter EImax, EIminund PoS. Die Wiederherstellung stellt den Unterschied von EI während des letzten Teils der Reoxygenierung im Vergleich zu EI zu Beginn dar. Beide EI-Werte werden mit einem pO2 von 100–120 mmHg gemessen. Dieser Parameter spiegelt die Fähigkeit von RBCs wider, die sich während der Deoxygenierung zu einer Umkehrung des Sicheles während der Reoxygenierung22bewegen. Parameter aus doppelten Messungen wiesen im Allgemeinen einen Variationskoeffizienten (CV) <5% (Median 1,83%) auf. Bei einem CV > 5% wurde eine dritte Messung durchgeführt. Die Parameter EImax und Recovery sind mit medianen CVs <1% am reproduzierbarsten.
Repräsentative Kurven von RBCs gesunder Kontrollen, Patienten mit HbS-Merkmalen (heterozygothb) und einem homozygoten SCD-Patienten sind in Abbildung 4Adargestellt. Die repräsentative Kurve des HbSC-Patienten zeigt eine geringere Genesung, die auf einen anderen Sichlingsprozess hindeuten könnte (Abbildung 4B). Die repräsentativen Kurven der mit Hydroxyharnstoff (HU) und Transfusion behandelten HbSS-Patienten sind in Abbildung 4C und Abbildung 4Ddargestellt. Es liegt auf der Hand, dass es einen großen Unterschied zwischen den repräsentativen Kurven der HS-Merkmale (HbAS-Zellen) und der RBCs von HbSS-Patienten gibt, die mit Transfusion behandelt wurden (bestehend aus einer Mischung aus homozygoter Sichel (HbSS) und homozygoten Normalzellen (HbAA), Abbildung 4A ,D). Die deutlichen Unterschiede in den Kurven des unbehandelten SCD-Patienten und der HU- und transfusionsbehandelten Patienten unterstreichen die Nützlichkeit dieses Assays (Abbildung 4C,D). Die HbF- und HbS-Werte korrelierten signifikant mit EImin und in geringerem Maße mit PoS (Abbildung 5A–D). Dies deutet darauf hin, dass die Laborparameter, die bei der Bewertung des Patienten wichtig sind, auch in der Sauerstoffgradientenektacytometrie widergespiegelt werden. Die Anzahl der gesickerten Zellen bei Normoxia und der Prozentsatz der dichten RBCs (DRBCs) beeinflussen beide die EImax-Werte, da sie signifikant korreliert sind (Abbildung 5E–F), was darauf hindeutet, dass EImax einen weiteren wichtigen Faktor in der Sichelprozess. Diese Ergebnisse zeigen, wie unterschiedliche Merkmale wie %HbS, %HbF, gekränkte Zellen bei Normoxia und %DRBCs unterschiedliche Parameter beeinflussen.
Abbildung 1. Schematische Einrichtung des Ektacytometers. Das Ektacytometer verwendet ein Couette-System, um Scherspannung auf die Zellen anzuwenden. Ein Rotationsaußenzylinder (Cup) und ein statischer Innenzylinder (Bob) werden verwendet, um Scherspannung durch die Erzeugung von laminarem Durchfluss bei 37 °C zu induzieren. Zwischen Bob und Tasse gibt es eine kleine Lücke, in die die Blutsuspension injiziert wird. Ein Laserstrahl leuchtet vom Bob durch die Blutsuspension und wird durch die Anwesenheit von RBCs gestreut. Das Beugungsmuster wird von einer Kamera projiziert und analysiert. Der Dehnungsindex (EI) wird mit der Höhe (a) und der Breite (b) des Beugungsmusters4berechnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Schematische Einrichtung des Ektacytometers mit Sauerstoffgradientektacytometriemodul. Schematische Darstellung des Moduls, das die Desoxygenierung der Blutsuspension langsam mit der Infusion von Stickstoffgas zeigt (N2). Die Sauerstoffspannung wird durch die Menge der Abschreckung des Luminophoresignals gemessen, das von der LED-Faser zumO2-Punktgesendet wird. Bei Deroxygenierung beginnen Sichel-RBCs zu sichle, ihre Verformbarkeit nimmt ab und sie werden sich nicht mehr mit elliptischen RBCs ausrichten. Die gekränkten RBCs verzerren das Beugungsmuster und ändern seine Form von einer Ellipse in eine rhomboide oder diamantähnliche Form. Diese Änderung der Form des Beugungsmusters führt zu einer Abnahme von EI. Messungen von pO2 und EI werden nicht in der gleichen Höhe im Becher durchgeführt. Dies gewährleistet eine bessere Diskriminierung zwischen den Austrocknungs- und Reoxygenierungskurven und damit eine bessere Interpretation der Kurve. Diese Abbildung wurde von Rab et al.22geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. Repräsentative Sauerstoffgradienten-Ektacytometrie-Kurve und Beugungsmuster. (A) Bei Deroxygenierung unter Bedingungen, die der Sauerstoffgradientenektacytometrie ähneln, wurden Sichel-RBCs fixiert. Bei Kontrollsichel-RBCs wurden die gleichen Bedingungen verwendet, jedoch ohne Stickstoffgas. Deoxygenierte Sichel-RBCs zeigen eine Formänderung im Gegensatz zur Kontrolle von RBCs. (B) Bei Deoxygenierung und Scherspannung (30 Pa) ändert sich das Beugungsmuster von einer Ellipse zu einem Rhomboid. (C) Repräsentative Kurve der Sauerstoffgradientenektacytometrie. Der maximale Dehnungsindex (EImax) stellt die Ausgangsposition dar und zeigt eine allgemeine Verformbarkeit der gesamten RBC-Population. Minimum EI (EImin) stellt eine minimale Verformbarkeit dar, die durch die Änderung der Form und Ausrichtung von RBCs bei Deoxygenierung verursacht wird. Die EI (dEI, der Unterschied in der EI zwischen EImax und EImin)zeigt, wie viele Zellen sich während einer Deoxygenierungsrunde sichle. Der Sicklingpunkt (PoS, pO2 bei 5% EI Abnahme) zeigt die Sauerstoffspannung, wenn die ersten RBCs sichle beginnen. Die Fläche unter der Kurve (von pO2min = 100 mmHg) wird im Parameterbereich berechnet. Dies fasst EImax, EIminund PoS zusammen. Die Fähigkeit von gesickerten Zellen, während der Reoxygenierung unsickle, wird im Parameter Recovery (Prozentsatz der EImax, der während der Reoxygenierung erreicht wird) dargestellt. Um die Interpretation zu unterstützen, wurden alle Datenpunkte in jedem einzelnen Experiment durch eine Zeile verbunden, um die Ergebnisse grafisch darzustellen. Diese Abbildung wurde von Rab et al.22geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4. Sauerstoffgradientektacytometrie Parameter korrelieren mit Genotyp und Behandlungsschemata von SCD-Patienten mit SCD. (A) Repräsentatives Diagramm der RBCs von HbS-Trägern (HbS-Eigenschaft) und gesunder Kontrollen in Bezug auf unbehandelte HbSS-Patienten. (B) Repräsentative Grafik der RBCs von Patienten mit Hämoglobin-SC-Krankheit (HbSC) in Bezug auf unbehandelte HbSS-Patienten. (C) Repräsentativer Graph der RBCs von Hydroxyharnstoff behandelten homozygoten SCD-Patienten (HbSS HU) in Bezug auf unbehandelte HbSS-Patienten. (D) Repräsentatives Diagramm der RBCs von HbSS-Patienten, die mit Bluttransfusion (HbSS-Transfusion) in Bezug auf unbehandelte HbSS-Patienten behandelt wurden. Diese Abbildung wurde von Rab et al.22geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5. Sauerstoffgradientenektacytometrieparameter sind %HbF, %HbS, %sickled-Zellen bei Normoxia und %dense RBCs zugeordnet. (A) Lineare Korrelation des Minimaldehnungsindex (EImin) und %HbF von 15 HbSS- oder HbS/-Thalassämie-Patienten ohne Transfusion. (B) Lineare Korrelation von EImin und %HbS. (C) Lineare Korrelation von PoS und %HbF. (D) Lineare Korrelation von PoS und %HbS. (E) Lineare Korrelation von maximal erzahnten EI (EImax) und Prozent der gesickerten Zellen bei Normoxie mit digitaler Mikroskopie gemessen. (F) Lineare Korrelation von EImax und prozentual dichten RBCs (%DRBCs) von 21 Patienten mit HbSS. Diese Abbildung wurde von Rab et al.22geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Einstellungen | ||
| Dateien | Speicherverzeichnis | |
| Allgemeine Optionen | Standard-Mittelviskosität | Viskosität der PVP |
| pO2-Scan | Minimale Aspirationszeit (s) | 60 |
| pO2 Scherspannung (Pa) | 30 | |
| Bestimmen Sie pO2 pro (S) | 20 | |
| Bewegliche Durchschnittsgröße | 2 | |
| pO2-Scanschritt; herausgeben | 0 -OFF; 60 -ON; 1360 –AUS; 1640 -AUS | |
| Cal. Fläche zwischen (mmHg) | 10 und 100 | |
| pO2-Steuerung | Aus (ungeprüft) |
Tabelle 1. Die bevorzugte Einstellung des Ektacytometers.
Discussion
Hier beschreiben wir die Sauerstoffgradientenektacytometrie, eine Methode, die verwendet werden kann, um das Sichelverhalten roter Blutkörperchen von SCD-Patienten unter einer Reihe von Sauerstoffkonzentrationen zu untersuchen (Abbildung 4 und Abbildung 5). Um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen, ist es wichtig, die Faktoren zu identifizieren, die die Ergebnisse beeinflussen. Zum Beispiel hat die Temperatur einen großen Einfluss auf die RBC-Verformbarkeit, vor allem aufgrund ihrer Auswirkungen auf die Dicke der viskosen Lösung (PVP). Wir empfehlen, zu Beginn des Tages eine Testmessung durchzuführen, um die Maschine gründlich auf 37 °C zu erhitzen. Dadurch wird die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse verbessert. Die Osmolarität der viskosen Lösung sollte innerhalb eines engen Bereichs liegen (282–286 mOsm/kg für PVP), da die Osmolarität den Hydratationsstatus beeinflusst, was wiederum die RBC-Deformierbarkeit beeinflusst. Der pH-Wert und die Viskosität von PVP sollten ebenfalls streng reguliert werden. Unterschiede in pH und Temperatur können Kurven dramatisch beeinflussen22. Darüber hinaus kann das verbleibende Wasser im Becher, Bob und Röhren die Lyse von RBCs verursachen, was zu falschen Daten führt, da weniger intakte RBCs im Becher gemessen werden.
Einstellungen zur Durchführung der Sauerstoffgradientenektacytometrie können angepasst werden, um spezifische Prüffragen zu beantworten. Bevorzugte Einstellungen sind in Tabelle 1aufgeführt. Eine Deoxygenierungszeit von 1.300 s wurde auf der Grundlage von Beobachtungen gewählt, die zeigten, dass die Verlängerung der Deoxygenierung bei den meisten Patienten nicht zu einem niedrigerenEI-Min. geführt hat. Im Gegensatz dazu würde eine Verkürzung der Deoxygenierungszeit die Diskriminationskraft der Sauerstoffgradientenektacytometrie behindern. Die Reoxygenierungszeit wurde aufgrund der sich schnell auflösenden HbS-Polymere während der Reoxygenierung auf 280 s und die gleichzeitige Wiederherstellung von EI in Richtung der wertegemessenen Werte vor der Deoxygenierung eingestellt. Die Scherspannung wurde auf 30 Pa eingestellt, was der osmotischen Gradientenektacytometrie entspricht. Das Senken dieses Parameters könnte die Diskriminative Leistung beeinträchtigen. Die Deoxygenierungskontrolle kann verwendet werden, wenn eine Reihe von Deoxygenierungsgeschwindigkeiten auf jede Patientenprobe angewendet wird. In unseren bevorzugten Einstellungen wurde diese Option deaktiviert, da die Deoxygenierungsrate aufgrund der einzigartigen Hämoglobin-Dissoziationskurve patientenspezifisch ist. Daher würde das Einschalten der Deoxygenierungskontrolle diese Eigenschaft aus dem Test eliminieren. Diese Funktion der Sauerstoffgradientenektacytometrie wird jedoch noch untersucht.
Mehrere bekannte Faktoren beeinflussen die Parameter der Sauerstoffgradientenektacytometrie, nämlich pH,, Temperatur und Osmolarität. Ektacytometrie, insbesondere PoS, wird durch 2,3-Diphosphoglycerat (2,3-DPG)22beeinflusst. Außerdem besteht eine klare Korrelation zwischen %HbF und dem EIminund in geringerem Maße PoS (Abbildung 5A–D). EImax ist mit Sichelzellen bei Normoxia assoziiert, was die Beobachtung erklären kann, dass kurz nach einem VOC die RBC-Deformierbarkeit bei Normoxia (EImax)höher ist. Letzteres wird durch die Zerstörung der am meisten gekränkten Zellen verursacht, und damit weniger verformbare RBCs während VOC16. Wie in Abbildung 5Fdargestellt, korrelieren höher %dichte RBCs (definiert als RBCs mit einer Hämoglobinkonzentration >1,11 mg/ml) stark mit einem niedrigeren EImax. Dies deutet darauf hin, dass dichte Zellen ein wichtiger Faktor bei der RBC-Deformierbarkeit bei Normoxia sind, ähnlich wie zuvor gemeldete Ergebnisse1.
Die Standardisierung von Proben ist sehr wichtig, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten und um zwischen verschiedenen Genotypen und Behandlungen zu unterscheiden. Die Korrektur der RBC-Anzahl ist wichtig, da die Anzahl der RBCs die Intensität des Beugungsmusters beeinflusst. Wenn niedrigere RBC-Zahlen in der Lücke zwischen Bob und Cup vorhanden sind, verschiebt sich die Kurve nach oben und nach links. Darüber hinaus schwankt die Kurve, was die genaue Berechnung der Parameter, insbesondere des PoS, erschwert.
Eine Einschränkung dieser Technik besteht darin, dass der EI-Wert einen Durchschnitt aller Zellen darstellt, einschließlich verschiedener Subpopulationen. Die Heterogenität der RBC-Populationen bei SCD-Patienten und ihr Einfluss auf die Ektacytometrie-Messung wurden intensiv untersucht. Dies führte zu einer Standardisierung, bei der die Größe des Beugungsmusters auf einen festen Wert angepasst wird, anstatt für die RBC-Anzahl23,24zu korrigieren. Ob diese Art der Standardisierung auch auf Messungen der Sauerstoffgradientenektacytometrie angewendet werden soll, wird derzeit geprüft.
Mehrere Techniken zur Messung der RBC-Deformierbarkeit unter hypoxischen Bedingungen wurden auf der Grundlage eines Deoxygenierungsschritts entwickelt, der außerhalb des Ektacytometers25,26,27stattfand. Unter diesen Bedingungen wurden keine Unterschiede im zellulären Verhalten zwischen Patienten mit HbS-Merkmalen und gesunden Kontrollen unter physiologischem pH25beobachtet. Die Sauerstoffgradientenektacytometrie zeigt jedoch deutlich ein niedriges, aber offensichtliches PoS bei Personen mit HbS-Merkmalen (Abbildung 4A). Bis heute sind in der klinischen Routinepraxis die einzigen alternativen Methoden zur Messung der Tendenz der RBCs eines einzelnen Patienten zur Sichel in vitro: RbCs werden unter Bedingungen inkubiert, die die HbS-Polymerisation fördern, wie z. B. geringe Sauerstoffspannung oder niedrigen pH-Wert. Nach der Inkubation wird ein Fixativ hinzugefügt und der Prozentsatz der gekränkten Zellen wird manuell oder digital mittels Lichtmikroskopie gezählt. Viele präklinische und frühe Phase pharmakologische Studien verwenden den Sichel-Assay, um eine sekundäre Ergebnisvariable zu generieren, um die klinische Wirksamkeit in SCD28,29,30,31 vorherzusagen ,32. Es ist jedoch zeitaufwändig, die Variabilität ist hoch und die Empfindlichkeit ist gering, die Technik ist nicht automatisiert und daher arbeitsintensiv. Darüber hinaus können morphologische Veränderungen aufgrund von Sicheln nicht gut mit physiologischen Parametern korrelieren, wie z. B. RBC-Deformierbarkeit, da es sich um einen 2-dimensionalen statischen Assay2handelt.
Sauerstoffgradientektacytometrie bietet einen funktionellen Assay des Sichlings, der schnell und reproduzierbar ist. Dies ist ein In-vitro-Test, der die endotheliale Oberfläche nicht berücksichtigt. Jedoch, Es bietet funktionelle Aspekte des Sichling Stuttierverhaltens und RBC-Eigenschaften, so dass es eine vielversprechende Technik für Sichelzellstudien. Zukünftige Anwendungen der Technik umfassen die Überwachung der Behandlungswirksamkeit bei SCD-Patienten, die Als Biomarker für neue Behandlungsstrategien, die Untersuchung des Sichelverhaltens und die Überwachung von Chimären nach der Stammzelltransplantation bei SCD.
Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde zum Teil durch einen Eurostars-Zuschuss estar18105 und durch einen uneingeschränkten Zuschuss von RR Mechatronics unterstützt. Die Autoren danken Sisto Hendriks und Jan de Zoeten für ihre technische Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADVIA 120 Hematology Analyzer | Siemens | 067-A004-14 | Instrument |
| Cell-Dyn Sapphire Hematology Analyzer | Abbott | 8H00-01 | Instrument |
| Lorrca | RR Mechatronics | LORC109230 or LORC109110 | Instrument |
| Lorrca Software version V5.08 | RR Mechatronics | - | Software |
| Nitrogen gas 4.8 or 5.0 | Local | - | |
| O2-spot | RR Mechatronics | PO2S020153 | O2 measurement |
| Oxygenscan module (pO2scan) | RR Mechatronics | PO2S109000 | Add-on |
| Oxy-ISO | RR Mechatronics | QRR 030905 | Viscous solution |
| X-Clean | RR Mechatronics | QRR 010946 | Cleaning solution Lorrca |
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