Summary
Qui, presentiamo ektacytometry gradiente di ossigeno, un metodo rapido e riproducibile per misurare la deformabilità dei globuli rossi in campioni da pazienti con malattia delle cellule falciformi sotto deossigenazione controllata e riossigenazione. Questa tecnica fornisce un modo per studiare la falce dei globuli rossi e per monitorare l'efficacia del trattamento della malattia delle falciformi.
Abstract
Nella malattia delle cellule falciformi (SCD), una mutazione a singolo punto nella codifica del gene per la beta-globina provoca la produzione di emoglobina anormale S (HbS). Quando deossigenato, HbS può polimerizzare, formando aste rigide di emoglobina, causando il falciare dei globuli rossi (RBC). Questi RBC malaticci hanno ridotto significativamente la deformabilità, causando vaso-occlusione, che porta a numerose complicazioni cliniche legate sCD, tra cui dolore, ictus, e danni agli organi. Deformabilità RBC è anche ridotta da disidratazione RBC, con conseguente globuli rossi densi che hanno maggiori probabilità di falciare. Ad oggi, non esiste un singolo saggio di laboratorio ampiamente disponibile, rapido e riproducibile in grado di prevedere la gravità della malattia o di monitorare direttamente gli effetti del trattamento per nuove terapie che inducono emoglobina non fetali. In questo studio, descriviamo un protocollo per misurare la deformabilità di RBC in funzione del pO2 che consente la quantificazione del comportamento di falciamento nei pazienti affetti da SCD. Il gradiente di ossigeno ektacytometria misura la deformabilità rBC, espressa come indice di allungamento (EI), in funzione di pO2. Gli RBC sono esposti a uno stress fisso di taglio di 30 Pa durante un ciclo di deossigenazione e di riossigenazione. Vengono prodotti sei parametri di lettura. Di questi, il punto di malattia (PoS), definito come pO2 in cui l'EI massimo (EImax) mostra una diminuzione del 5%, e l'IE minimo durante la deossigenazione (EImin) sono i più informativi, riflettendo pO2 di un singolo paziente in cui iniziano e la deformabilità minima dei globuli rossi di un paziente, rispettivamente. La poS è associata all'affinità di emoglobina di un singolo paziente per l'ossigeno, mentre EImin mostra una forte correlazione con i livelli di emoglobina fetale. Concludiamo che l'ectacytometria del gradiente di ossigeno è una tecnica promettente per monitorare il trattamento dei pazienti con SCD, come biomarcatore per agenti anti-malattia negli studi clinici e preclinici, e un importante strumento per studiare il comportamento nauseante delle RBC individui con tratti SCD e falciformi.
Introduction
Nella SCD, una mutazione a singolo punto si traduce nella produzione di HbS, che può polimerizzare dopo la deossigenazione. La polimerizzazione HbS causa nauseamento degli RBC e riduce la deformabilità della RBC. La combinazione di sickling RBC e aderenza RBC all'endotelio porta a varie complicazioni SCD, tra cui crisi vaso-occlusive (VOC), ictus, danno d'organo, e anemia emolitica cronica. Anche in condizioni di norma, deformabilità RBC è compromessa in pazienti con SCD. La deformabilità è ulteriormente diminuita a basse concentrazioni di ossigeno. I fattori chiave che determinano la deformabilità alla normsia sono cellule dense, cellule irrorabilmente ammalati (ISC) e cellule disidratate, tutte con un rapporto superficie-volume diminuito1,2,3.
L'ectacytometria è un metodo consolidato per misurare la deformabilità della RBC, ampiamente utilizzato per la diagnosi di anemie emolitiche ereditarie, in particolare membranopatie4. Può anche essere utilizzato per studiare emorologia5,6,7,8,9. Gradiente osmotico ektacytometria, in cui la deformabilità RBC viene misurata durante un continuo cambiamento di osmolalità, è stato utilizzato per studiare SCD per oltre un decennio10,11. La percentuale di emoglobina fetale (HbF) è uno dei più forti inibitori della polimerizzazione HbS perché né l'HbF né il suo tetramero ibrido misto (2s) possono entrare nella fase12del polimero deossicoHbS. Studi recenti suggeriscono che l'aumento dei livelli di HbF nei pazienti affetti da SCD porta a un migliore rapporto superficie-volume, migliorando così lo stato di idratazione e quindi la deformabilità nei pazienti non transfusi11.
Deformabilità RBC è stato studiato in passato come un biomarcatore per le complicanze SCD, ma con risultati contrastanti. Negli studi effettuati trasversalmente e in uno stato stabile, gli individui con livelli più elevati di deformabilità RBC sono stati trovati per avere una maggiore incidenza di osteonecrosi e più crisi di dolore13,14,15. A differenza di questi risultati, rispetto ai valori di stato costante durante un VOC acuto, deformabilità RBC è stata diminuita in studi longitudinali all'interno degli stessi individui16. Questa discrepanza può essere il risultato dello studio della deformabilità RBC in condizioni diverse (cioè durante lo stato stabile rispetto al VOC). La percentuale di cellule falciate è alta all'inizio di un VOC e le cellule vengono rapidamente distrutte con il progredire della crisi, il che può spiegare la differenza tra i dati di incidenza trasversale dello stato costante e i dati longitudinali ottenuti durante il VOC. Tuttavia, altri fattori, come l'aderenza delle sottopopolazioni RBC alla superficie endoteliale, possono anche essere importanti nella comparsa del COV. In SCD, è più clinicamente rilevante misurare la deformabilità durante la deossigenazione, perché vaso-occlusione si verifica tipicamente nelle venule postcapillariiiiche ipossiche e non nella rete microcapillare meno ipossica17. Inoltre, la presenza di ISC può alterare la capacità di un ektacytometer di misurare la deformabilità alla normoxia. La distorsione del modello di diffrazione è causata dagli ISC, che risultano dal non allineamento durante il flusso1,2,3.
Gli approcci alternativi per studiare la fisiofisiologia del VOC includono misurazioni dell'aderenza rBC a una superficie artificiale18, impedimento elettrico a singola cellula citometria del microflusso19, modelli a base microfluidica che combinano quantitativa misurazioni della falce cellulare e del malessere con la reologia a cella singola20e la polimerizzazione indotta dal laser21. Sebbene promettenti, queste tecniche sono costose, laboriose e richiedono un'ampia formazione da parte dell'operatore. Inoltre, i saggi che sono basati sulla morfologia non hanno la capacità di studiare il comportamento cellulare, come la deformabilità, in funzione di un gradiente di ossigeno.
In questo studio, descriviamo un saggio funzionale rapido e riproducibile eseguito con un ektacytometer. Si tratta di una misura ektacytometry di nuova generazione che misura i diversi aspetti qualitativi della deformabilità della RBC espressi come EI durante la deossigenazione (1.300 s) e la rapida riosssigenazione (280 s). Questi intervalli di tempo consentono la formazione di polimeri HbS, e quindi il verificarsi di cambiamenti morfologici e quindi il recupero. La deossigenazione si verifica introducendo gas di azoto, che diminuisce lentamente la tensione di ossigeno nel campione di sangue nel divario tra il bob e la tazza dell'ektacytometer. La deformabilità rBC viene continuamente misurata mentre la tensione di ossigeno viene misurata ogni 20 s per mezzo di un piccolo O2-spotpresente nella parete della tazza. Durante il test, circa 80 pO2 misurazioni sono accoppiate all'EI misurato in quel momento. La pressione dell'ossigeno scende al di sotto di 20 mmHg durante la deossigenazione e la riossigenazione è facilitata dalla diffusione passiva dell'aria ambiente. La configurazione sperimentale del modulo ektacytometer e gradiente di ossigeno ektacytometry è descritta nella Figura 1 e Figura 2. Il principio di ektacytometria si basa sulla dispersione di luce indotta da RBC da un fascio laser. Il risultato è un modello di diffrazione ellittico quando la sollecitazione di taglio viene applicata contemporaneamente (Figura 1).
Protocol
Tutte le procedure sono state approvate dal comitato etico dell'University Medical Center Utrecht (UMCU) e in conformità alla Dichiarazione di Helsinki. I pazienti arruolati presso il Texas Children's Hematology Center (TCHC) sono stati approvati dall'IRB locale e in conformità con la Dichiarazione di Helsinki.
1. Considerazioni generali
- Iniziare eseguendo una misurazione di prova per riscaldare il bob e la tazza. Assicurarsi che la temperatura del bob e della tazza sia di 37 gradi centigradi. Questo è importante per una buona riproducibilità.
- Assicurarsi che la soluzione viscosa polivilpyrrolidone (PVP) rientri nei limiti rigorosi per l'osmolarità (282-286 mOsm/kg), pH (7,35–7,45) e viscosità (27,5–32,5 MPa) a temperatura ambiente (22 gradi centigradi).
NOTA: il PVP deve essere utilizzato a temperatura ambiente. Se conservato a una temperatura inferiore, assicurarsi che si sia riscaldato fino a temperatura ambiente prima di effettuare misurazioni.
2. Avvio dell'ektacytometer
- Accendere il computer e l'ektacytometer dal retro. Avviare il programma software (Tabella dei materiali) sul computer.
- Assicurarsi che l'azoto sia disponibile per deossigenare il campione aprendo il cilindro di azoto.
- Abbassare il bob nella tazza e assicurarsi che la tazza può girare liberamente. Pulire la tazza all'interno e all'esterno con un panno morbido e acqua distillata, perché i detriti possono ostacolare le misurazioni EI.
- Quando il programma software è in esecuzione, verificare la presenza del seguente messaggio sullo schermo:"Assicurarsi che la valvola del gas sia aperta" e fare clic su OK.
- Assicurarsi che l'ektacytometer avvii il processo di autocontrollo pO2 che apparirà sullo schermo. Selezionare Start (immettere). In caso di errore, eseguire nuovamente l'autocontrollo facendo clic su Controllo hardware proprietà pO2 . Controllo automatico.
NOTA: se l'autocontrollo non riescedi nuovo, prendere in considerazione la sostituzione del o 2-spot. Il O2-spot viene sostituito spingendo delicatamente il punto fuori dall'interno della tazza con una punta delle dita. Un nuovo punto viene posizionato spingendo delicatamente il punto dall'esterno nella tazza. - Scegliere pO2 scan dai diversi test elencati a sinistra. Scegliere Impostazioni a destra dello schermo e assicurarsi che siano impostate in base ai parametri elencati nella tabella 1. Mantenere le stesse impostazioni per ogni misurazione.
- Per salvare queste impostazioni, premere OK OK.
NOTA: le impostazioni preferite sono elencate nella tabella 1, ma possono essere regolate in base alle preferenze dell'utente e agli scopi investigativi. Ad esempio, per studiare il comportamento del malato in modo più esteso, la velocità e la durata di deossigenazione possono essere alterate.
3. Raccolta e preparazione dei campioni
NOTA: per la convalida della tecnica, il sangue trattato con acido tetraacetico etileneamina (EDTA) da 38 pazienti affetti da SCD e 5 controlli sani inclusi presso l'University Medical Center Utrecht o il Texas Children's Hematology Center, in diversi studi clinici ( Sono stati utilizzati campioni di sangue resimi anonimi dei paesi bassi provenienti da pazienti che hanno visitato la clinica ambulatoriale o sono stati ricoverati in ospedale.
- Raccogliere campioni di sangue mediante venipuntura (un minimo di 300 l/campione) in un tubo contenente EDTA. Assicurarsi che il sangue sia stato conservato per almeno 30 min a 4 gradi centigradi, ma non più di 24 h.
NOTA: Può essere utilizzato anche il tipo di fosfato citrato detorò adenino (CPDA) o l'eparina, ma l'influenza di questi reagenti sulla conservazione del campione rispetto all'ektacytometria del gradiente di ossigeno non è nota. - Mescolare delicatamente il campione per inversione per omogeneizzare. Non scuotere il campione. Lasciare il campione riscaldare fino a temperatura ambiente su un banco a rulli prima della misurazione.
NOTA: Un tubo campione (9-10 mL) che viene conservato per più di 1 h a 4 gradi centigradi deve riscaldarsi per 15 min. Quando conservato per meno di 1 h a 4 gradi centigradi, deve riscaldarsi per 10 min. Un tubo campione (2-6 mL) che viene conservato per più di 1 h a 4 gradi centigradi deve riscaldarsi per 10 min. Quando conservato per meno di 1 h a 4 gradi centigradi, deve riscaldarsi per 5 min. - Misurare il conteggio completo del sangue su un analizzatore di ematologia. Per farlo, prendere 20-200 litri di sangue intero in un tubo contenente EDTA. Posizionare l'ago di aspirazione nel tubo e premere sul pulsante dietro l'ago dell'analizzatore di ematologia per iniziare la misurazione.
NOTA: Nel conteggio completo del sangue, viene misurato il numero RBC, che è un fattore importante per la standardizzazione delle misurazioni di ektacytometry del gradiente di ossigeno. Il numero di RBC viene calcolato dalla dispersione in avanti e laterale in base alla citometria di flusso. Il numero di RBC normale nei controlli sani è 3,7–5,0 x 1012/L per le femmine e 4,2–5,5 x 1012/L per i maschi. Il numero di RBC nei pazienti con SCD è generalmente diminuito. Alcuni analizzatori di ematologia misureranno anche la percentuale di globuli rossi densi (% DRBC) che può essere di valore aggiuntivo nell'interpretazione delle singole curve di ektacytometria del gradiente di ossigeno. - Standardizzare l'intero campione di sangue in un numero di RBC di 200 x 106 RBC in PVP 5 mL (200 x 106 RBC/flacone) regolando il volume del campione che verrà aggiunto. Se il numero totale di RBC è inferiore a 200 x 106, il modello di diffrazione e l'EI saranno influenzati.
- Utilizzare l'equazione seguente per eseguire il conteggio.
4.0/xx (x 1012/L) x 50 x yy -L intero sangue/pvP
dove xx è il numero di RBC calcolato ottenuto dal passaggio 3.3 e yy è la quantità di sangue intero necessaria per la misurazione effettiva. A seconda del grado di anemia e di altri fattori che influenzano i conteggi di RBC, la quantità di sangue intero richiesta è di 40-90.
- Utilizzare l'equazione seguente per eseguire il conteggio.
4. Misurazione ektacytometria del gradiente di ossigeno
- Pipette il volume del campione calcolato (yy -L di sangue) in PVP per ottenere un volume totale di 5 mL. Precedere la punta rispendendo delicatamente il sangue 3x. Utilizzare una punta di pipetta con un'apertura ampia per evitare ulteriori sollecitazioni sugli RBC.
NOTA: Aprire la fiala PVP per un tempo il più breve possibile per evitare il contatto con l'aria. - Disegnare lentamente 2,0 mL della miscela sangue/PVP in una siringa da 3 mL senza l'ago. Spingere lo stantuffo per rimuovere eventuali bolle d'aria visibili e una soluzione di campionamento eccessiva fino a 1,5–1,8 mL viene lasciata nella siringa (a seconda del volume della tazza).
- Iniettare il volume totale del campione lentamente e uniformemente nel bob attraverso il connettore. Assicurarsi che il livello del campione sia al di sopra del sensore di ossigeno (punto rosa) e al di sopra del piccolo foro di aspirazione. Non lasciare alcuna soluzione di esempio nella siringa.
- Fai clic su Nuovo e inserisci l'identificatore di esempio, le osservazioni, la data di donazione e la viscosità del PVP. Fare clic su OK . Aspirate. Dopo 60 s, la coppa ruoterà e aspira il campione per 15 s. Fare clic su OK quando la rotazione si interrompe. Chiudere il coperchio della macchina. Fare clic su Continua . Inizia ora, come gradiente di ossigeno ektacytometry è fatto con un guadagno fisso. La misurazione avrà circa 28 min.
- Dopo la misurazione, stampare il report che mostra la curva e i parametri calcolati automaticamente dal software. Assicurarsi che i dati non elaborati vengano memorizzati automaticamente nella cartella designata in Impostazioni. L'IA massima (EImax),l'IE minimo (EImin),il pO295%EI (PoS) e l'area (area sotto la curva) vengono calcolati automaticamente e aggiunti al report stampato e ai dati non elaborati.
- Ottenere manualmente la sè calcolando la differenza tra EImax e EImin. Calcolare il recupero percentuale prendendo la differenza in Media EI prima della deossigenazione (pO2 100–120 mmHg) e i valori medi di EI durante la riossigenazione a 100-120 mmHg.
5. Pulizia dell'ektacytometer
- Rimuovere la siringa campione e sostituirla con una siringa riempita con acqua distillata o acqua deionizzata.
- Premere Pulisci, scaricando lentamente il connettore durante il risciacquo. Assicurarsi di lavare in entrambe le direzioni.
- Togliere la siringa e sollevare il bob. Asciugare accuratamente il bob, la tazza e il connettore con un panno morbido.
- Utilizzare una siringa di grandi dimensioni (10-50 mL) per lavare il connettore al fine di rimuovere l'acqua rimanente nei tubi e bob. Bloccare l'uscita inferiore del bob per ottenere indietro la pressione nei tubi, rimuovendo così l'acqua rimanente.
- Abbassa il bob nella tazza. La macchina è ora pronta per la misurazione successiva.
6. Arresto della macchina
- Assicurarsi che la macchina sia correttamente sciacquata dopo l'ultima misurazione, come descritto in precedenza. Assicurarsi che i tubi appropriati siano correlati alla soluzione di pulizia.
- Chiudere il software, premere Chiudi e start per avviare il programma di pulizia di fine giornata.
- Dopo aver completato l'intero programma di pulizia, rimuovere la siringa e sollevare il bob. Sciacquare il connettore con una grande siringa.
- Svuotare la bottiglia di scarto e asciugare il bob e la tazza con un panno morbido. Sciacquare il connettore per rimuovere l'acqua residua nei tubi e bob. Bloccare l'uscita inferiore del bob per ottenere indietro la pressione nei tubi, rimuovendo così l'acqua rimanente.
- Chiudere il coperchio della macchina. Chiudere il cilindro di azoto. Spegnere il computer e la macchina.
Representative Results
L'ektacytometria del gradiente di ossigeno può essere utilizzata per caratterizzare il comportamento malato nei pazienti con SCD. In questo studio sono inclusi campioni di sangue provenienti da un totale di 38 pazienti affetti da SCD e cinque controlli sani. Nei controlli sani, il modello di diffrazione è circolare a riposo ed ellittico a maggiore sollecitazione di taglio4. Dal modello di diffrazione ellittico, l'indice di allungamento (EI) viene calcolato in base all'altezza e alla larghezza del modello di diffrazione. Nella ektacytometria del gradiente di ossigeno, la deossigenazione lenta e continua del campione da gas azoto è seguita da una rapida riossigenazione da parte dell'aria ambiente. In queste condizioni, il malato RBC può essere osservato sotto deossigenazione. Ciò causerà una distorsione del modello di diffrazione perché le celle rosse falciate non si allineeranno correttamente sotto lo stress di taglio applicato. Di conseguenza, sembrano essere meno deformabili rispetto ai CBC sani (Figura 2).
La figura 3A mostra come le RBC falciformi cambiano forma dopo la deossigenazione, che imitava le condizioni durante l'ektacytometria del gradiente di ossigeno, mentre gli RBC a falce di controllo senza deossigenazione non mostrano alcun cambiamento di forma. Questo processo si traduce in distorsione del modello di diffrazione durante l'ektacytometria del gradiente di ossigeno, e quindi in una diminuzione dell'EI. Figura 3B mostra i diversi modelli di diffrazione da cui vengono generati diversi parametri.
Una curva rappresentativa ottenuta dall'ektacytometer è illustrata nella figura 3C. Sei parametri riflettono diverse caratteristiche del comportamento falciforme delle RBC: EImax è l'EI massimo all'inizio della misurazione prima della deossigenazione. Questo parametro rappresenta la posizione di base e riflette la deformabilità complessiva della popolazione RBC totale all'aria ambiente. EImin è l'EI minimo, che rappresenta la deformabilità minima dopo la deossigenazione. Questo parametro riflette le modifiche nella forma e nell'orientamento degli RBC (falciati) al momento della deossigenazione. L'EI è la differenza tra EImax e EImin, che indica quante cellule possono falciare durante un giro di deossigenazione. 5% Point of Sickling (PoS5%) è il pO2 (mmHg) a cui viene misurata una diminuzione del 5% delmassimo EI durante la deossigenazione. Questo rappresenta la tensione di ossigeno dove inizia il processo di malattia. L'area riflette l'area sotto la curva, che è determinata da un calcolo integrale delle misurazioni EI e pO2 tra 100 mmHg e pO2min (mmHg). Questo è il risultato dei parametri descritti in precedenza EImax, EImine PoS. Recovery rappresenta la differenza di EI durante la parte finale della riossigenazione rispetto all'EI al basale. Entrambi i valori EI sono misurati a un pO2 di 100-120 mmHg. Questo parametro riflette la capacità degli RRPC che falciano durante la deossigenazione di invertire la sickling durante la riossigenazione22. I parametri delle misurazioni duplicate presentavano in genere un coefficiente di variazione (CV) <5% (mediana 1,83%). Nel caso in cui sia stato ottenuto un CV > 5%, è stata eseguita una terza misurazione. I parametri EImax e Recovery sono i più riproducibili con CV mediani <1%.
Le curve rappresentative delle RBC dei controlli sani, i pazienti con tratti HbS (HbS eterodozigous) e un paziente Omozygous SCD sono mostrati nella Figura 4A. La curva rappresentativa del paziente HbSC mostra un recupero inferiore, che potrebbe indicare un diverso processo di sickling (Figura 4B). Le curve rappresentative dei pazienti HbSS trattati con idrossirea (HU) e trasfusione sono mostrate nella Figura 4C e nella Figura 4D. Chiaramente, c'è una grande differenza tra le curve rappresentative dei tratti HS (cellule HbAS) e gli RBC dei pazienti HbSS trattati con trasfusione (costituita da una miscela di cellule omozino (HbSS) e omozygous normal (HbAA), Figura 4A ,D). Le chiare differenze nelle curve del paziente SCD non trattato e dei pazienti trattati con HU e trasfusionale evidenziano l'utilità di questo saggio (Figura 4C,D). I livelli di HbF e HbS sono correlati in modo significativo con EImin e, in misura minore, con PoS (Figura 5A–D). Ciò indica che i parametri di laboratorio che sono importanti nella valutazione del paziente si riflettono anche nel gradiente di ossigeno ektacytometry. Il numero di cellule falciate in corrispondenza della normsia e la percentuale di RBC densi (DCC) influenzano entrambi i valori EImax, in quanto sono significativamente correlati (Figura 5E–F), il che indica che EImax riflette un altro fattore importante processo di nauseazione. Questi risultati mostrano come le diverse caratteristiche di tali caratteristiche abbiano %HbS, %HbF, cellule falciate a normoxia e %DRBC influenzano parametri diversi.
Figura 1. Impostazione schematica dell'ektacytometer. L'ektacytometer utilizza un sistema Couette per applicare lo stress di taglio sulle cellule. Un cilindro esterno a rotazione (tazza) e un cilindro interno statico (bob) vengono utilizzati per indurre la sollecitazione di taglio mediante la creazione di flusso laminare a 37 gradi centigradi. Tra il bob e la coppa c'è un piccolo spazio in cui viene iniettata la sospensione del sangue. Un raggio laser risplende dal bob attraverso la sospensione del sangue ed è disperso dalla presenza di RBC. Il modello di diffrazione viene proiettato e analizzato da una telecamera. L'indice di allungamento (EI) viene calcolato con l'altezza (a) e la larghezza (b) del modello di diffrazione4. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Impostazione schematica dell'ektacytometer con modulo ektacytometry a gradiente di ossigeno. Diagramma schematico del modulo che mostra la deossigenazione della sospensione del sangue lentamente con l'infusione di gas di azoto (N2). La tensione di ossigeno è misurata dalla quantità di spegnimento del segnale luminoforo inviato dalla fibra LED allo spot O2. Dopo la deossigenazione, le RBC falciformi inizieranno a falciare, la loro deformabilità diminuirà e non si allineeranno più con gli RBC ellittici. Gli RBC malati distorcono il modello di diffrazione, cambiandola da un'ellisse a una forma romboide o rombidista. Questo cambiamento nella forma del modello di diffrazione si traduce in una diminuzione di EI. Le misurazioni di pO2 ed EI non vengono eseguite alla stessa altezza nella tazza. Ciò garantisce una migliore discriminazione tra le curve di deossigenazione e di reossigenazione e, di conseguenza, una migliore interpretazione della curva. Questa cifra è stata modificata da Rab et al.22Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Rappresentativa curva ektacytometry e modelli di diffrazione. (A) Al momento della deossigenazione in condizioni simili al gradiente di ossigeno ektacytometry, sono stati fissati RBC falciformi. Nel controllo delle RBC falciate, sono state utilizzate le stesse condizioni, ma senza gas di azoto. Gli RBC di falce dissigenata mostrano un cambiamento di forma a differenza degli RBC di controllo. (B) Al momento della deossigenazione e dello stress da taglio (30 Pa), il modello di diffrazione cambia da un'ellisse a un romboide. (C) Curva rappresentativa di gradiente di ossigeno ektacytometry. L'indice massimo di allungamento (EImax) rappresenta la posizione di base e mostra una deformabilità complessiva della popolazione RBC totale. L'EI minimo (EImin)rappresenta una deformabilità minima, causata dal cambiamento di forma e orientamento delle RBC in seguito alla deossigenazione. L'EI (dEI, la differenza nell'EI tra EImax e EImin) mostra quante cellule possono falciare durante un giro di deossigenazione. Il punto di malattia (PoS, pO2 al 5% di diminuzione EI) mostra la tensione di ossigeno quando i primi RBC iniziano a falciare. L'area sotto la curva (da pO2min - 100 mmHg) viene calcolata nell'area del parametro. Questo riassume EImax, EImin, e PoS. La capacità delle cellule malate di non ammalarsi durante la riossigenazione è rappresentata nel parametro Recupero (percentuale di EImax raggiunta durante la riossigenazione). Per facilitare l'interpretazione, tutti i punti dati sono stati collegati in ogni singolo esperimento da una linea per presentare graficamente i risultati. Questa cifra è stata modificata da Rab et al.22Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. I parametri di ektacytometria del gradiente di ossigeno sono correlati al genotipo e ai regimi di trattamento dei pazienti affetti da SCD con SCD. (A) Grafico rappresentativo delle RBC dei vettori HbS (tratto HbS) e dei controlli sani in relazione ai pazienti hbSS non trattati. (B) Grafico rappresentativo delle RBC dei pazienti con malattia emoglobina SC (HbSC) in relazione ai pazienti HbSS non trattati. (C) Grafico rappresentativo delle RBC dei pazienti con SCD omozigous trattati con idrossige (HbSS HU) in relazione ai pazienti hbSS non trattati. (D) Grafico rappresentativo delle RBC dei pazienti affetti da HbSS trattati con trasfusione di sangue (trasfusione HbSS) in relazione a pazienti HbSS non trattati. Questa cifra è stata modificata da Rab et al.22Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. I parametri di ektacytometria del gradiente di ossigeno sono associati a %HbF, %HbS, %cellule con falciature in corrispondenza di normossia e RBC con densa. (A) Correlazione lineare dell'indice minimo di allungamento (EImin)e %HbF di 15 pazienti hbSS o HbS/x-talassemia senza trasfusione. (B) Correlazione lineare di EImin e %HbS. (C) Correlazione lineare di PoS e %HbF. (D) Correlazione lineare di PoS e %HbS. (E) Correlazione lineare del numero massimo di EI (EImax)e percentuale di cellule falciate a normossia misurata con microscopia digitale. (F) Correlazione lineare delle RBCmassimi e percentuali dense di RBC (%DRBC) di 21 pazienti con HbSS. Questa cifra è stata modificata da Rab et al.22Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Impostazioni | ||
| file | Directory di archiviazione | |
| Opzioni generali | Viscosità media di default | Viscosità del PVP |
| scansione pO2 | Tempo minimo di aspirazione (s) | 60 |
| pO2 stress da taglio di scansione (Pa) | 30 | |
| Determinare pO2 ogni (S) | 20 | |
| Dimensioni medie mobili | 2 | |
| passaggio di scansione pO2; curare | 0 -OFF; 60 -ON; 1360 –OFF; 1640 -DISATTIVATO | |
| Area compresa tra (mmHg) | 10 e 100 | |
| controllo pO2 | Disattivato (non selezionato) |
Tabella 1. L'impostazione preferita dell'ektacytometer.
Discussion
Qui descriviamo il gradiente di ossigeno ektacytometry, un metodo che può essere utilizzato per studiare il comportamento malato dei globuli rossi da pazienti SCD in una gamma di concentrazioni di ossigeno (Figura 4 e Figura 5). Per ottenere risultati riproducibili, è importante identificare i fattori che influenzano i risultati. Ad esempio, la temperatura ha un grande impatto sulla deformabilità di RBC, principalmente a causa dei suoi effetti sullo spessore della soluzione viscosa (PVP). Si consiglia di eseguire una misurazione di prova all'inizio della giornata per riscaldare accuratamente la macchina a 37 gradi centigradi. Ciò migliorerà la riproducibilità dei risultati. L'osmolarità della soluzione viscosa dovrebbe essere all'interno di una gamma ristretta (282-286 mOsm/kg per PVP), perché l'osmolarità influenza lo stato di idratazione, che a sua volta influisce sulla deformabilità della RBC. Anche il pH e la viscosità del PVP dovrebbero essere strettamente regolamentati. Le differenze di pH e temperatura possono influenzare drammaticamente le curve22. Inoltre, l'acqua rimanente nella tazza, nel bob e nei tubi può causare il lisi degli RBC, con conseguente dati errati, perché verranno misurati meno RBC intatti presenti nella tazza.
Le impostazioni per eseguire l'ektacytometry del gradiente di ossigeno possono essere regolate per rispondere a domande investigative specifiche. Le impostazioni preferite sono elencate nella tabella 1. È stato scelto un tempo di deossigenazione di 1.300 s sulla base di osservazioni che mostrano che l'estensione della deossigenazione non ha comportato un eImin più basso per la maggior parte dei pazienti. Al contrario, l'accorciamento del tempo di deossigenazione ostacolerebbe il potere discriminatorio del gradiente di ossigeno ektacytometry. Il tempo di riossigenazione è stato fissato a 280 s a causa della rapida risoluzione dei polimeri HbS durante la riossigenazione e del ripristino concomitante dell'EI verso valori misurati prima della deossigenazione. Lo stress da taglio è stato impostato su 30 Pa, che è analogo al gradiente osmotico ektacytometry. La riduzione di questo parametro potrebbe ostacolare la potenza discriminante. Il controllo della deossigenazione può essere utilizzato se a ogni campione di paziente viene applicata una serie di velocità di deossigenazione. Nelle nostre impostazioni preferite, questa opzione è stata disattivata perché il tasso di deossigenazione è specifico del paziente a causa dell'unica curva di dissociazione dell'emoglobina. Quindi, accendere il controllo della deossigenazione eliminerebbe questa caratteristica dal saggio. Tuttavia, questa caratteristica di ektacytometria gradiente di ossigeno è ancora sotto inchiesta.
Diversi fattori ben noti influenzano i parametri di ektacytometria del gradiente di ossigeno, vale a dire pH, temperatura e osmolarità. L'ektacytometria, in particolare il PoS, è influenzata da 2,3 diphosphoglycerate (2,3-DPG)22. Inoltre, esiste una chiara correlazione tra %HbF e EImin, e in misura minore PoS (Figura 5A–D). EImax è associato con cellule falciformi a normossia, che può spiegare l'osservazione che poco dopo un VOC, deformabilità RBC a normoxia (EImax), è superiore. Quest'ultimo è causato dalla distruzione delle cellule più malati, e quindi meno rapmalmassi deformabili durante il VOC16. Come illustrato nella Figura 5F, RBC più densamente %denso (definito come RBC con una concentrazione di emoglobina >1,11 mg/mL) sono fortemente correlati con unmassimodi EI inferiore. Ciò indica che le cellule dense sono un fattore importante nella deformabilità di RBC alla normossia, simile ai risultati precedentemente riportati1.
La standardizzazione dei campioni è molto importante per ottenere risultati riproducibili e per distinguere tra genotipi e trattamenti diversi. La correzione del numero di RBC è importante, poiché il numero di CBC influenza l'intensità del modello di diffrazione. Se sono presenti numeri RBC inferiori nello spazio tra il bob e la coppa, la curva si sposterà verso l'alto e verso sinistra. Inoltre, la curva fluttuerà, ostacolando il calcolo accurato dei parametri, in particolare il PoS.
Una limitazione di questa tecnica è che il valore EI rappresenta una media di tutte le cellule, comprese le diverse sottopopolazioni. L'eterogeneità delle popolazioni di RBC nei pazienti affetti da SCD e la sua influenza sulla misurazione dell'ectacytometria sono state studiate intensamente. Ciò ha portato alla standardizzazione in cui la dimensione del modello di diffrazione viene regolata su un valore fisso invece di corretto per il conteggio RBC23,24. È attualmente in fase di studio se questo modo di standardizzazione debba essere applicato o meno anche alle misurazioni di ektacytometria del gradiente di ossigeno.
Diverse tecniche per misurare la deformabilità della RBC in condizioni ipossiche sono state sviluppate sulla base di una fase di deossigenazione che ha avuto luogo al di fuori dell'ektacytometer25,26,27. In queste condizioni, le differenze nel comportamento cellulare non sono state osservate tra pazienti con tratti HbS e controlli sani sotto pH fisiologico25. Ektacytometria gradiente di ossigeno, tuttavia, mostra chiaramente un PoS basso ma evidente in individui con tratti HbS (Figura 4A). Ad oggi, nella pratica clinica di routine, gli unici metodi alternativi per misurare la tendenza delle RBC di un singolo paziente a falciare in vitro includono un test di mmorologia basata sulla falce: le RBC vengono incubate in condizioni che promuovono la polimerizzazione HbS, come bassa tensione di ossigeno o basso pH. Un fissativo viene aggiunto dopo l'incubazione e la percentuale di cellule falciate viene conteggiata manualmente o digitalmente utilizzando la microscopia leggera. Molti studi farmacologici preclinici e in fase iniziale utilizzano il saggio di malattia per generare una variabile di esito secondario per essere in grado di prevedere l'efficacia clinica in SCD28,29,30,31 ,32. Tuttavia, è dispendioso in termini di tempo, la variabilità è elevata e la sensibilità è bassa, la tecnica non è automatizzata e, quindi, laboriosa. Inoltre, i cambiamenti morfologici dovuti alla falciatura potrebbero non correlare bene con i parametri fisiologici, come la deformabilità della RBC, perché è un analisi statico bidimensionale2.
L'ektacytometria del gradiente di ossigeno fornisce un saggio funzionale di falciare che è rapido e riproducibile. Si tratta di un test in vitro che non considera la superficie endoteliale. Tuttavia, fornisce aspetti funzionali del comportamento nauseante e caratteristiche Di RBC, rendendolo una tecnica promettente per gli studi sulle cellule falciformi. Le future applicazioni della tecnica includono il monitoraggio dell'efficacia del trattamento nei pazienti affetti da SCD, che funge da biomarcatore per nuove strategie di trattamento, lo studio del comportamento da malato e il monitoraggio del chimerismo dopo il trapianto di cellule staminali nella SCD.
Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una sovvenzione Eurostars estar18105 e da una sovvenzione illimitata fornita da RR Mechatronics. Gli autori ringraziano Sisto Hendriks e Jan de zoeten per il loro supporto tecnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADVIA 120 Hematology Analyzer | Siemens | 067-A004-14 | Instrument |
| Cell-Dyn Sapphire Hematology Analyzer | Abbott | 8H00-01 | Instrument |
| Lorrca | RR Mechatronics | LORC109230 or LORC109110 | Instrument |
| Lorrca Software version V5.08 | RR Mechatronics | - | Software |
| Nitrogen gas 4.8 or 5.0 | Local | - | |
| O2-spot | RR Mechatronics | PO2S020153 | O2 measurement |
| Oxygenscan module (pO2scan) | RR Mechatronics | PO2S109000 | Add-on |
| Oxy-ISO | RR Mechatronics | QRR 030905 | Viscous solution |
| X-Clean | RR Mechatronics | QRR 010946 | Cleaning solution Lorrca |
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