Summary
Burada, orak hücre hastalığı olan hastalardan alınan örneklerde kontrollü deoksijenasyon ve reoksijenasyon altında kırmızı kan hücresi deformitesini ölçmek için hızlı ve tekrarlanabilir bir yöntem olan oksijen gradyan ektasitattrisi saklıdır. Bu teknik kırmızı kan hücresi orması çalışma ve orak hücre hastalığı tedavi etkinliğini izlemek için bir yol sağlar.
Abstract
Orak hücre hastalığında (SCD), beta-globin için gen kodlamasında tek bir nokta mutasyonu anormal hemoglobin S (HbS) üretimine neden olur. Ne zaman deoxygenated, HbS polimerize olabilir, hemoglobin sert çubuklar oluşturan, kırmızı kan hücrelerinin hastalanması ile sonuçlanan (RBC). Bu hasta RBC'ler deformiteyi önemli ölçüde azaltarak vazo-oklüzyona neden olmuş, bu da ağrı, inme ve organ hasarı gibi SCD'ye bağlı çok sayıda klinik komplikasyona yol açmıştır. RBC deformite deremi de RBC dehidratasyon ile azalır, orak olasılığı daha yoğun kırmızı kan hücreleri ile sonuçlanan. Bugüne kadar, hastalığın şiddetini tahmin etme veya yeni, fetal olmayan hemoglobin indükleyici tedavilerin tedavi etkilerini doğrudan izleyebilen tek bir yaygın, hızlı ve tekrarlanabilir laboratuvar testi yoktur. Bu çalışmada, SCD hastalarında hastalık lı davranışların ölçülmesine olanak tanıyan pO2'nin bir fonksiyonu olarak RBC deformitesini ölçen bir protokol açıklatılmıştır. Oksijen gradyan ektasittometrisi, pO2'ninbir fonksiyonu olarak uzama indeksi (EI) olarak ifade edilen RBC deformitesini ölçer. RBC'ler bir tur deoksijenasyon ve reoksijenasyon sırasında 30 Pa'lık sabit bir kesme stresine maruz kalırlar. Altı okuma parametresi üretilir. Bunlardan, maksimum EI 'nin (EImax)%5 oranında azaldığı pO2 olarak tanımlanan oriling noktası (PoS) ve deoksijenasyon sırasında minimum EI (EImin)en bilgilendirici olan hasta, tek bir hastanın pO2'sini yansıtan hastalanma başlar ve hastanın kırmızı kan hücrelerinin minimal deforme edilebilirlik, sırasıyla. PoS oksijen için bireysel bir hastanın hemoglobin yakınlığı ile ilişkilidir, EImin fetal hemoglobin düzeyleri ile güçlü bir korelasyon gösterir ise. Oksijen gradyan ektasittometrisinin, klinik ve preklinik çalışmalarda hastalık önleyici ajanlar için bir biyomarker olarak SCD'li hastaların tedavisini izlemek için umut verici bir teknik olduğu ve RBC'lerin hastalanma davranışlarını incelemek için önemli bir araç olduğu sonucuna varıyoruz. SCD ve orak hücre özellikleri olan bireyler.
Introduction
SCD'de tek bir nokta mutasyonu HbS üretimiyle sonuçlanır ve bu mutasyon oksijensizleşme üzerine polimerleşebilir. HbS polimerizasyonu RBC'lerin hastalaşmasına neden olur ve RBC deformitülebilirliğini azaltır. RBC hastalanma ve RBC endotel bağlılık kombinasyonu vazo-oklüzif krizler de dahil olmak üzere çeşitli SCD komplikasyonlara yol açar (VOC), inme, organ hasarı, ve kronik hemolitik anemi. Normoksik koşullarda bile SCD'li hastalarda RBC deformitesi tehlikeye girer. Düşük oksijen konsantrasyonlarında deforme edilebilirlik daha da azalır. Normoksia dedeability belirlemek anahtar oyuncular yoğun hücreler, geri dönüşümsüz hasta hücreler (ISC), ve susuz hücreler, hepsi azalmış yüzey-hacim oranı1var,2,3.
Ektasitometri RBC deformite ölçmek için kurulmuş bir yöntemdir, yaygın kalıtsal hemolitik anemi tanısı için kullanılan, özellikle membranopatiler4. Ayrıca hemorheyoloji 5 ,6,7,8,9çalışma için kullanılabilir. Osmotik gradyan ektasitatomi, hangi RBC deformite osmolalite sürekli bir değişim sırasında ölçülür, on yıl içinde SCD çalışması için kullanılmıştır10,11. Fetal hemoglobin (HbF) yüzdesi HbS polimerizasyonunun en güçlü inhibitörlerinden biridir çünkü ne HbF ne de karışık hibrid tetramer (2βSγ) deoksiHbS polimer faz12'yegiremez. Son çalışmalar, SCD hastalarında HbF düzeylerinin artmasının daha iyi bir yüzey-hacim oranına yol açtığını, böylece hidrasyon durumunuve dolayısıyla transaşık olmayan hastalarda deforme edilebilirliği iyileştirdiğini göstermektedir11.
RBC deformite scd komplikasyonlar için bir biyomarker olarak geçmişte çalışılmıştır, ancak çakışan sonuçlar ile. Kesitsel ve sabit bir durumda yapılan çalışmalarda, RBC deformite yüksek düzeyde olan bireylerin osteonekroz ve daha fazla ağrı krizleri daha yüksek bir insidansı olduğu bulunmuştur13,14,15. Bu bulguların aksine, akut VOC sırasında sabit durum değerleri ile karşılaştırıldığında, Aynı bireyler de uzunlamasına çalışmalarda RBC deformite sasürür16. Bu tutarsızlık, farklı koşullar altında RBC deformitesinin incelenmesinin bir sonucu olabilir (yani, VOC'ye karşı sabit durumda). Hasta hücrelerin yüzdesi bir VOC başında yüksek ve hücreler hızla kriz ilerledikçe yok edilir, hangi voc sırasında elde edilen sabit devlet kesitsel insidans verileri ve longitudinal veri arasındaki farkı açıklayabilir. Ancak, RBC alt popülasyonlarının endotel yüzeyine yapışması gibi diğer faktörler de VOC oluşumunda önemli olabilir. SCD'de, vazo-oklüzyon genellikle hipoksik postkapiller venüllerde meydana gelir ve daha az hipoksik mikrokapiller ağ 17 değil, dejenere olma sırasında deformiteölçmek için klinik olarak daha önemlidir17. Ayrıca, ISC'lerin varlığı normoksia deformite ölçmek için bir ektasitometre yeteneğini değiştirebilir. Kırınım deseninin bozulması ISC'lerden kaynaklanır, bu da akışsırasındahizalamazneden olur 1,2,3.
VOC patofizyolojisi çalışma için alternatif yaklaşımlar yapay bir yüzeye RBC bağlılık ölçümleri içerir18, tek hücreli elektrikempedanmikroakış sitometri19, kantitatif birleştiren mikroakışkan tabanlı modeller tek hücreli reoloji ile hasta ve hasta olmayan hücre ölçümleri20, ve lazer kaynaklı polimerizasyon21. Umut verici olmasına rağmen, bu teknikler pahalı, emek yoğun ve kapsamlı operatör eğitimi gerektirir. Buna ek olarak, morfoloji tabanlı tahliller bir oksijen gradyan bir fonksiyonu olarak, deformability gibi hücresel davranış çalışma yeteneği eksikliği.
Bu çalışmada ektasitometre ile yapılan hızlı ve tekrarlanabilir fonksiyonel bir testi tanımladık. Bu, deoksijenasyon (1.300 s) ve hızlı reoksijenasyon (280 s) sırasında EI olarak ifade edilen RBC deformitesinin farklı nitel yönlerini ölçen yeni nesil ektasitometri ölçümüdür. Bu zaman aralıkları HbS polimer oluşumu için izin, ve böylece morfolojik değişikliklerin oluşumu ve daha sonra kurtarma. Deoksijenasyon azot gazı tanıtılarak oluşur, hangi yavaş yavaş ektasitometre bob ve fincan arasındaki boşlukta kan örneğindeki oksijen gerginliği ni azaltır. RBC deforme edilebilirliği sürekli olarak ölçülürken, oksijen gerilimi her 20'de fincanın duvarında bulunan küçük bir O2-noktaile ölçülür. Test sırasında, yaklaşık 80 pO2 ölçümleri o anda ölçülen EI ile birleştiğinde. Oksijen basıncı deoksijenasyon sırasında 20 mmHg'nin altına düşer ve ortam havasının pasif difüzyonu ile oksijenlenme kolaylaştırılır. Ektasitometre ve oksijen gradyan ektasitometri modülünün deneysel kurulumu Şekil 1 ve Şekil 2'deaçıklanmıştır. Ektasitometri prensibi bir lazer ışınından ışığın RBC kaynaklı saçılma dayanmaktadır. Bu durum, kesme gerilimi aynı anda uygulandığında eliptik kırınım deseni ile sonuçlanır (Şekil 1).
Protocol
Tüm prosedürler Utrecht Üniversitesi Tıp Merkezi etik komitesi (UMCU) tarafından helsinki bildirgesi uyarınca onaylanmıştır. Teksas Çocuk Hematoloji Merkezi'ne (TCHC) kayıtlı hastalar yerel IRB tarafından ve Helsinki Bildirgesi'ne uygun olarak onaylandı.
1. Genel hususlar
- Bob ve fincan ısınmak için bir test ölçümü yaparak başlayın. Bob ve fincan sıcaklığının 37 °C olduğundan emin olun. Bu iyi tekrarlanabilirlik için önemlidir.
- Viskoz polivinilpiridone (PVP) çözeltisinin oda sıcaklığında (22 °C) osmolarite (282-286 mOsm/kg), pH (7.35-7.45) ve viskozite (27.5-32.5 MPa) için katı sınırlar içinde olduğundan emin olun.
NOT: PVP oda sıcaklığında kullanılmalıdır. Daha düşük bir sıcaklıkta depolanırsa, herhangi bir ölçüm almadan önce oda sıcaklığına kadar ısındığından emin olun.
2. Ektasitometrenin başlatılması
- Bilgisayarı ve ektasimetreyi arkadan açın. Bilgisayarda yazılım programını(Malzeme Tablosu)başlatın.
- Azot silindirini açarak numuneyi oksijensizleştirmek için azotun kullanılabilir olduğundan emin olun.
- Fincan bob düşürün ve fincan serbestçe açabilirsiniz emin olun. Enkaz EI ölçümlerini aksatabileceğinden, iç ve dış taki kabı yumuşak bir bez ve distile su yla temizleyin.
- Yazılım programı çalışırken, ekranda aşağıdaki iletiyi kontrol edin: "Gaz valfinin açık olduğundan emin olun" ve Tamam'ıtıklatın.
- Ektasitometrenin ekranda görünecek olan pO2 kendi kendini kontrol işlemini başlattığından emin olun. Başlangıç 'ı seçin (girin). Başarısız olursa, Donanım denetimi ne tıklayarak kendi kendine kontrol yeniden | pO2 | Kendi kendini kontrol .
NOT: Kendi kendine kontrol tekrar başarısız olursa, O2-nokta sını değiştirmeyi düşünün. O2-spot yavaşça bir parmak ucu ile fincan içinde nokta dışarı iterek değiştirilir. Yeni bir nokta yavaşça fincan içine dışarıdan nokta iterek yerleştirilir. - Soltarafta listelenen farklı testler pO2 tonu seçin. Ekranın sağındaki Ayarlar'ı seçin ve Tablo 1'delistelenen parametrelere göre ayarlandıklarından emin olun. Her ölçüm için aynı ayarları tutun.
- Bu ayarları kaydetmek için Tamam | Tamam.
NOT: Tercih edilen ayarlar Tablo 1'de listelenir, ancak kullanıcı tercihlerine ve araştırma amaçlarına göre ayarlanabilir. Örneğin, hastalanma davranışını daha kapsamlı incelemek için oksijensizleşme hızı ve süresi değiştirilebilir.
3. Numune toplama ve hazırlama
NOT: Tekniğin doğrulanması için, etilendirmin tetraasetik asit (EDTA) tedavi edilen kan 38 SCD hastası ve 5 sağlıklı kontrol ler Üniversite Tıp Merkezi Utrecht veya Texas Çocuk Hematoloji Merkezi dahil, farklı klinik çalışmalarda ( Hollanda Deneme Kayıt Defteri [NTR] tanımlayıcısı, NTR 6779 ve NTR 6462) yanı sıra polikliniği ziyaret eden veya hastaneye yatırılan hastalardan kalan kan örnekleri kullanıldı.
- EDTA içeren bir tüpte venipuncture (en az 300 μL/örnek) ile kan örnekleri toplayın. Kanın 4 °C'de en az 30 dakika, ancak 24 saatten fazla olmadığından emin olun.
NOT: Sitrat fosfat deksroz adenin (CPDA) veya heparin de kullanılabilir, ancak oksijen gradyan ektasittometri açısından örnek korunması bu reaktiflerin etkisi iyi bilinmemektedir. - Homojenize etmek için inversiyon tarafından numuneyi hafifçe karıştırın. Örneği sallama. Numunenin ölçümden önce rulo tezgahta oda sıcaklığına kadar ısınmasını önleyin.
NOT: 4 °C'de 1 saatten fazla saklanan numune tüpü (9-10 mL) 15 dakika ısınmalıdır. 4 °C'de 1 saatten az bir süre saklandığında 10 dakika ısınmalıdır. 4 °C'de 1 saatten fazla saklanan numune tüpü (2-6 mL) 10 dakika ısınmalıdır. 4 °C'de 1 saatten az bir süre saklandığında 5 dakika ısınmalıdır. - Bir hematoloji analizörü üzerinde tam kan sayımı ölçün. Bunu yapmak için, EDTA içeren bir tüp tam kan 20-200 μL almak. Aspirasyon iğnesini tüpe yerleştirin ve ölçüme başlamak için hematoloji analizörünün iğnesinin arkasındaki düğmeye basın.
NOT: Tam kan sayımında, oksijen gradyan ektasittometri ölçümlerini standartlaştırmak için önemli bir faktör olan RBC sayısı ölçülür. RBC sayısı akış sitometrisi tarafından ileri ve yan dağılımdan hesaplanır. Sağlıklı kontrollerde normal RBC sayısı kadınlarda 3.7-5.0 x10 12/L, erkeklerde 4.2-5.5 x10 12/L'dir. SCD'li hastalarda RBC sayısı genellikle azalır. Bazı hematoloji analizörleri de yüzde yoğun kırmızı kan hücreleri ölçmek istiyorsunuz (DRBC) bireysel oksijen gradyan ektasitatomi eğrileri yorumlanmasında ek değer olabilir. - Eklenecek numunenin hacmini ayarlayarak tüm kan örneğini 5 mL PVP 'de (200 x 106 RBC/şişe) 200 x 106 RBC'lik bir RBC sayısına standartlaştırın. Toplam RBC sayısı 200 x 106'danazsa, kırınım deseni ve EI etkilenir.
- Sayma gerçekleştirmek için aşağıdaki denklemi kullanın.
4.0/xx (x10 12/L) x 50 = yy μL tam kan/şişe PVP
nerede xx adım 3.3 ve yy elde edilen hesaplanan RBC sayısı gerçek ölçüm için gerekli olan tam kan miktarıdır. Anemi derecesine ve RBC sayılarını etkileyen diğer faktörlere bağlı olarak, gerekli tam kan miktarı 40-90 μL'dir.
- Sayma gerçekleştirmek için aşağıdaki denklemi kullanın.
4. Oksijen gradyan ektasitometri ölçümü
- Toplam 5 mL hacim elde etmek için hesaplanan numune hacmini (kanın yy μL'si) PVP'ye getirin. Hafifçe kan 3x resuspend tarafından ucu önceden ıslak. RBC'ler üzerinde ek stresten kaçınmak için geniş açılı bir pipet ucu kullanın.
NOT: Hava temasını önlemek için PVP şişesini mümkün olduğunca kısa bir süre için açın. - Kan/PVP karışımının 2.0 mL'sini iğne olmadan 3 mL şırıngaya yavaşça çekin. 1.5-1.8 mL şırıngada kalana kadar (bardak hacmine bağlı olarak) görünür hava kabarcıklarını ve aşırı numune çözeltisini çıkarmak için pistonu itin.
- Toplam numune hacmini konektörden yavaşça ve eşit olarak enjekte edin. Numunenin seviyesinin oksijen sensörünün (pembe nokta) ve küçük emme deliğinin üzerinde olduğundan emin olun. Şırıngada herhangi bir numune çözeltisi bırakmayın.
- Yeni'yi tıklatın ve PVP'nin örnek tanımlayıcısını, açıklamaları, bağış tarihini ve viskozitesini doldurun. Tamam'ı tıklatın | Aspire. 60 s sonra, fincan döndürmek ve 15 s. rotasyon durduğunda Tamam tıklayın için örnek aspire. Makinenin kapağını kapatın. Devam Et 'e tıklayın | Şimdi başlayın, oksijen gradyan ektasittometri sabit bir kazanç ile yapılır gibi. Ölçüm yaklaşık 28 dakika sürer.
- Ölçümden sonra, yazılım tarafından otomatik olarak hesaplanan eğriyi ve parametreleri gösteren raporu yazdırın. Ham verilerin Ayarlar'dabelirlenen klasörde otomatik olarak depolandığından emin olun. Maksimum EI (EImax),minimum EI (EImin),pO2@%95 EI (PoS) ve alan (eğrinin altındaki alan) otomatik olarak hesaplanır ve yazdırılan rapor ve ham verilere eklenir.
- EImax ve EIminarasındaki farkı hesaplayarak ΔEI'yi el ile elde edin. 100-120 mmHg'de oksijenlenme den önce ortalama EI farkını (pO2 100-120 mmHg) ve ortalama EI değerlerini alarak yüzde geri kazanımını hesaplayın.
5. Ektasitometrenin temizlenmesi
- Numune şırıngayı çıkarın ve distile su veya deiyonize su ile dolu bir şırınga ile değiştirin.
- Temizletuşuna basın, durulama sırasında konektörü yavaşça temizleyin. Her iki yönde de floş emin olun.
- Şırıngayı çıkarın ve bob'u kaldırın. Bob, fincan ve konektör iyice yumuşak bir bez ile kuru.
- Tüplerde ve bob'da kalan suyu çıkarmak için konektörü yıkamak için büyük bir şırınga (10-50 mL) kullanın. Tüplerdeki basıncı geri almak için bob'un alt girişini/çıkışını engelleyin ve kalan suyu kaldırın.
- Bardaktaki bob'u indir. Makine bir sonraki ölçüm için hazır.
6. Makinenin kapatılması
- Yukarıda açıklandığı gibi, makinenin son ölçümden sonra düzgün bir şekilde durulandığından emin olun. Uygun tüplerin temizleme solüsyonuyla ilgili olduğundan emin olun.
- Yazılımı kapatın, Kapat'a basın ve gün sonu temizleme programını başlatmak için Başlat'a basın.
- Tüm temizleme programını tamamladıktan sonra şırıngayı çıkarın ve bob'u kaldırın. Konektörü büyük bir şırıngayla yıkayın.
- Atık şişeyi boşaltın ve bob ve bardağı yumuşak bir bezle kurulayın. Tüplerde kalan suyu ve bob'u çıkarmak için konektörü temizleyin. Tüplerde geri basınç almak için bob alt giriş / çıkış blok, daha sonra kalan su kaldırarak.
- Makinenin kapağını kapatın. Nitrojen silindirini kapatın. Bilgisayarı ve makineyi kapatın.
Representative Results
Oksijen gradyan ektasittometriSCD olan hastalarda hasta davranışı karakterize etmek için kullanılabilir. Bu çalışmada toplam 38 SCD hastasından alınan kan örnekleri ve beş sağlıklı kontrol alındı. Sağlıklı kontrollerde kırınım deseni istirahatte dairesel ve yüksek kesme stresinde eliptiktir4. Eliptik kırınım deseninden uzama indeksi (EI) kırınım deseninin yüksekliği ve genişliğine göre hesaplanır. Oksijen gradyan ektasitatominde, numunenin azot gazı ile yavaş ve sürekli oksijensizlenmesi, ortam havası ile hızlı reoksijenasyon ile takip edilir. Bu koşullar altında, RBC hastalanma deoksijenasyon altında görülebilir. Hasta kırmızı hücreler uygulanan kesme stresi altında düzgün hizalanmaz, çünkü bu kırınım deseni bir bozulmaya neden olur. Bu nedenle, sağlıklı RBC aksine daha az deforme gibi görünüyor(Şekil 2).
Şekil 3A, oksijensiz leşme sırasında koşulları taklit eden orak RBC'lerin şekil değişikliğini gösterirken, deoksijenasyon olmadan kontrol orak RBC'leri şekil değişikliği göstermez. Bu süreç, oksijen gradyan ektasittometrisi sırasında kırınım deseninin bozulmasına ve dolayısıyla EI'de azalmaya neden olur. Şekil 3B, farklı parametrelerin üretildiği farklı kırınım desenlerini gösterir.
Ektasitometre ile elde edilen temsili eğri Şekil 3C'degösterilmiştir. Altı parametre RBC'lerin hastalık davranışının farklı özelliklerini yansıtır: EImax, oksijensizleşmeden önce ölçümün başlangıcındaki maksimum EI'dir. Bu parametre temel konumu temsil eder ve ortam havası toplam RBC popülasyonunun genel deformite yansıtır. EImin minimum EI, deoksijenasyon sonrası minimal deformite temsil eder. Bu parametre, oksijensizleşme üzerine (orak) RBC'lerin şekil ve yönelimindeki değişiklikleri yansıtır. ΔEI EImax ve EIminarasındaki farktır , hangi deoksijenasyon bir tur sırasında kaç hücre orak gösterir. %5 Hastalanma Noktası (PoS%5)deoksijenasyon sırasında EImax%5 azalma ölçülen pO2 (mmHg) noktasıdır. Bu, hastalık işleminin başladığı oksijen gerilimini temsil eder. Alan, 100 mmHg ile pO2dk (mmHg) arasında EI ve pO2 ölçümlerinin ayrılmaz bir hesaplanması ile belirlenen eğrinin altındaki alanı yansıtır. Bu, daha önce açıklanan eimax, EIminve PoS. Recovery, reoksijenasyonun son bölümünde ei farkının taban çizgisinde EI ile karşılaştırıldığında temsil ettiği parametrelerin sonucudur. Her iki EI değeri de 100-120 mmHg'nin pO 2'si ile ölçülür. Bu parametre reoksijenasyon sırasında hastalanma ters deoxygenation sırasında orak RBC kapasitesini yansıtır22. Yinelenen ölçümlerden parametreler genellikle bir varyasyon katsayısına (CV) <%5 (ortanca %1,83) sahipti. CV > %5 alınması durumunda üçüncü bir ölçüm yapıldı. EImax ve Recovery parametreleri medyan CV'ler <%1 ile en çok tekrarlanabilir parametrelerdir.
Sağlıklı kontrollerin RBC'lerinin, HbS özelliği olan hastaların (heterozigot HbS) ve homozigot SCD hastasının temsili eğrileri Şekil 4A'dagösterilmiştir. HbSC hastasının temsili eğrisi daha düşük bir iyileşme gösterir, bu da farklı bir hastalık sürecini gösterebilir(Şekil 4B). Hidroksyure (HU) ve transfüzyon ile tedavi edilen HbSS hastalarının temsili eğrileri Şekil 4C ve Şekil 4D'degösterilmiştir. Açıkça, Transfüzyon ile tedavi edilen HbSS hastalarının HS özelliklerinin (HbAS hücreleri) temsili eğrileri ile RBC'leri arasında büyük bir fark vardır (homozigot orak (HbSS) ve homozigot normal (HbAA) hücrelerinin karışımından oluşan, Şekil 4A ,D). Tedavi edilmeyen SCD hastası ve HU ve transfüzyon tedavisi gören hastaların eğrileri arasındaki net farklılıklar bu talın yararlılığını vurgular (Şekil 4C,D). HbF ve HbS düzeyleri EImin ile ve daha az bir ölçüde PoS ile anlamlı olarak ilişkilidir (Şekil 5A–D). Bu da hastanın değerlendirilmesinde önemli olan laboratuvar parametrelerinin oksijen gradyan ektasitometrisine de yansıdığını göstermektedir. Normoksia'daki hasta hücrelerin sayısı ve yoğun RBC'lerin (DrBC' ler) her ikisi de EImax değerlerini önemli ölçüde ilişkili oldukları ndan(Şekil 5E–F),EImax'ın bir diğer önemli faktörü yansıttığını gösterir. hastalık süreci. Bu sonuçlar, hbs, %HbF, normoksiada hasta hücreler ve %DRBC'lerin farklı parametreleri nasıl etkilediğini göstermektedir.
Şekil 1. Ektasitometrenin şematik kurulumu. Ektasitometre hücrelere kesme stresi uygulamak için bir Couette sistemi kullanır. 37 °C'de laminar akış yaratılarak kesme stresini tetiklemek için bir rotasyon dış silindir (fincan) ve statik bir iç silindir (bob) kullanılır. Bob ve fincan arasında kan süspansiyon enjekte edildiği küçük bir boşluk vardır. Bir lazer ışını bob kan süspansiyon yoluyla parlar ve RBC varlığı ile dağınık. Kırınım deseni bir kamera tarafından yansıtılır ve analiz edilir. Uzama indeksi (EI), kırınım deseninin yüksekliği (a) ve genişliği (b)ile hesaplanır 4. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Oksijen gradyan ektasitometri modülü ile ektasitometre şematik kurulum. Azot gazı infüzyonu ile kan süspansiyonunun yavaş yavaş deoxygenation gösteren modülün şematik diyagramı (N2). Oksijen gerilimi, LED-fiberden O2noktasına gönderilen luminofor sinyalinin söndürme miktarı ile ölçülür. Oksijensiz kalma üzerine orak RBC'ler oraklanmaya başlar, deformiteleri azalır ve artık eliptik RBC'lerle hizalanmaz. Hasta RBC'ler kırınım deseni bozar, şeklini bir elipsten eşkenar dörtgen veya elmas benzeri bir şekle değiştirir. Kırınım deseninin şeklindeki bu değişiklik EI'nin azalmasına neden olur. PO2 ve EI ölçümleri bardakta aynı yükseklikte yapılmaz. Bu deoxygenation ve reoxygenation eğrileri arasında daha iyi ayrımcılık sağlar ve dolayısıyla, eğrinin daha iyi bir yorumu. Bu rakam Rab ve ark.22'dendeğiştirilmiştir.
Şekil 3. Temsili oksijen gradyan ektasitometri eğrisi ve kırınım desenleri. (A) Oksijen gradyan ektasitometrisine benzer koşullarda oksijensizleşme üzerine orak RBC'leri düzeltildi. Kontrol orak RBC' lerde de aynı koşullar kullanıldı, ancak azot gazı yoktu. Oksijensiz orak RBC'ler, RBC'leri kontrol etmek yerine şekil değişikliği gösterir. (B) Oksijensizleşme ve kesme stresi (30 Pa) üzerine, kırınım deseni bir elipsten eşrodoide dönüşür. (C) Oksijen gradyan ektasittometrisinin temsili eğrisi. Maksimum uzama indeksi (EImax)temel konumu temsil eder ve toplam RBC popülasyonunun genel deformitesini gösterir. Minimum EI (EImin)deoksijenasyon üzerine KÇ'lerin şekil ve yönünün değişmesinden kaynaklanan minimal deformiteyi temsil eder. ΔEI (dEI, EImax ve EIminarasındaki EI farkı) bir deoksijenasyon turlarında kaç hücrenin orak olabileceğini gösterir. Orak noktası (PoS, pO2 %5 EI azalma) ilk RBC'ler orak başladığında oksijen gerilimini gösterir. Eğrinin altındaki alan (pO2min = 100 mmHg)parametre alanında hesaplanır. Bu EImaxözetler , EImin, ve PoS. Reoksijenasyon sırasında hasta hücrelerin hastalanma kapasitesi parametre Kurtarma (reoksijenasyon sırasında ulaşılan EImax yüzdesi) temsil edilir. Yoruma yardımcı olmak için, tüm veri noktaları sonuçları grafiksel olarak sunmak için bir satır la her bir deneyde birbirine bağlandı. Bu rakam Rab ve ark.22'dendeğiştirilmiştir.
Şekil 4. Oksijen gradyan ektasitometri parametreleri SCD'li SCD hastalarının genotip ve tedavi rejimleri ile ilişkilidir. (A) HbS taşıyıcılarının RBC'lerinin (HbS özelliği) ve tedavi edilmeyen HbSS hastalarına ilişkin sağlıklı kontrollerin temsili grafiği. (B) Tedavi edilmeyen HbSS hastaları ile ilgili hemoglobin SC Hastalığı (HbSC) hastalarının RBC'lerinin temsili grafiği. (C) Tedavi edilmeyen HbSS hastaları ile ilgili olarak homozigot SCD hastalarının (HbSS HU) tedavi edilen hidroksyurea RBC'lerinin temsili grafiği. (D) Tedavi edilmeyen HbSS hastalarına göre kan transfüzyonu (HbSS transfüzyonu) ile tedavi edilen HbSS hastalarının RBC'lerinin temsili grafiği. Bu rakam Rab ve ark.22'dendeğiştirilmiştir.
Şekil 5. Oksijen gradyan ektasitometri parametreleri %HbF, %HbS, normoksiada %hasta hücreler ve %yoğun RBC ile ilişkilidir. (A) Transfüzyonu olmayan 15 HbSS veya HbS/β-talasemi hastalarının minimum uzama indeksi (EImin)ve %HbF'nin doğrusal korelasyonu. (B) EImin ve %HbS. (C) PoS'un doğrusal korelasyonunu ve %HbF. (D) PoS'un doğrusal korelasyonunu ve %HbS. (E) Maksimum EI (EImax)ile hasta hücrelerin in doğrusal korelasyonunu normoksia dijital mikroskopi ile ölçülür. (F) HbSS'li 21 hastanın EImax ve yüzde yoğun RBC'lerinin (%DRBC) doğrusal korelasyonu. Bu rakam Rab ve ark.22'dendeğiştirilmiştir.
| Ayarlar | ||
| Dosyaları | Depolama dizini | |
| Genel seçenekler | Varsayılan orta viskozite | PVP'nin viskozitesi |
| pO2 tonu | Minimum aspirasyon süresi (ler) | 60 |
| pO2 tmak kesme gerilimi (Pa) | 30 | |
| Her (S) pO2'yi belirleyin | 20 | |
| Hareketli ortalama boyutu | 2 | |
| pO2 tazyik adımı; Düzenle | 0 -KAPALI; 60 -A),; 1360 –KAPALI; 1640 -KAPALI | |
| Cal. Arasındaki Alan (mmHg) | 10 ve 100 | |
| pO2 kontrolü | Kapalı (işaretli değil) |
Tablo 1. Ektasitometrenin tercih edilen ayarı.
Discussion
Burada oksijen gradyan ektasittometri, oksijen konsantrasyonları bir dizi altında SCD hastalarından kırmızı kan hücrelerinin hasta davranışını incelemek için kullanılabilecek bir yöntem(Şekil 4 ve Şekil 5)açıklar. Tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için, sonuçları etkileyen faktörleri belirlemek önemlidir. Örneğin, sıcaklık RBC deformite üzerinde büyük bir etkisi vardır, çoğunlukla viskoz çözelti (PVP) kalınlığı üzerindeki etkileri nedeniyle. Makineyi 37 °C'ye iyice ısıtmak için günün başında bir test ölçümü yapmanızı öneririz. Bu, sonuçların tekrarlanabilirliğini artıracaktır. Viskoz çözeltinin ozmolaritesi dar bir aralıkta olmalıdır (PVP için 282-286 mOsm/kg), çünkü osrüleritasyon durumunu etkiler, bu da RBC deformitesini etkiler. PVP'nin pH ve viskozitesi de sıkı bir şekilde düzenlenmelidir. pH ve sıcaklık farklılıkları eğrileri önemli ölçüde etkileyebilir22. Ayrıca, bardakta kalan su, bob, ve tüpler, RBC'lerin lysis neden olabilir, bu nedenle yanlış veri ile sonuçlanan, fincan mevcut daha az bozulmamış RBC'ler ölçülecektir çünkü.
Oksijen gradyan ektasittometrisi yapmak için ayarlar belirli araştırma sorularını ele alacak şekilde ayarlanabilir. Tercih edilen ayarlar Tablo 1'delistelenmiştir. 1.300 s'lik bir oksijensizleşme süresi, oksijensizleşmenin uzaması birçok hasta için daha düşük bir EImin ile sonuçlanmadığını gösteren gözlemlere dayanarak seçilmiştir. Buna karşılık, deoksijenasyon süresinin kısaltılması oksijen gradyan ektasittometrisinin ayırıcı gücünü engelleyebilir. Reoksijenasyon süresi, reoksijenasyon sırasında hızla çözülen HbS polimerleri ve ei'nin deoksijenasyon dan önce ölçülen değerlere doğru birlikte geri getirilmesi nedeniyle 280 s olarak belirlenmiştir. Kesme gerilimi 30 Pa olarak ayarlandı, bu da ozmotik gradyan ektasitometriye benzer. Bu parametreyi düşürmek ayrımcı gücü engelleyebilir. Her hasta örneğine bir dizi oksijensizasyon hızı uygulanırsa deoksijenasyon kontrolü kullanılabilir. Tercih edilen ayarlarımızda, bu seçenek, benzersiz hemoglobin ayrışma eğrisi nedeniyle oksijensizleşme oranı hastaya özgü olduğu için kapatıldı. Bu nedenle, deoxygenation kontrolü anahtarlama bu karakteristik bağırsak ortadan kaldıracağını. Ancak, oksijen gradyan ektasittometri bu özelliği hala araştırılıyor.
Birçok iyi bilinen faktörler oksijen gradyan ektasittometri parametreleri etkiler, yani pH, sıcaklık, ve ozolarite. Ektasitometri, özellikle PoS, 2,3-difosfogliserin (2,3-DPG)22etkilenir. Ayrıca, %HbF ile EIminarasında açık bir korelasyon vardır ve daha az bir ölçüde PoS(Şekil 5A–D). EImax normoxia orak hücreleri ile ilişkilidir, hangi gözlem açıklayabilir kısa bir VOC sonra, normoksia RBC deformite (EImax),daha yüksektir. İkincisi en hasta hücrelerin imha neden olur, ve dolayısıyla voc sırasında daha az deformable RBC16. Şekil 5F'degösterildiği gibi , daha yüksek %yoğun RBC 'ler (hemoglobin konsantrasyonu >1.11 mg/mL olan RBC'ler olarak tanımlanır) daha düşük EImaxile güçlü bir şekilde ilişkilidir. Bu, daha önce bildirilen sonuçlara benzer şekilde normoksiada yoğun hücrelerin RBC deformitesinde önemli bir faktör olduğunu gösterir1.
Numunelerin standardizasyonu, tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek ve farklı genotipler ile tedaviler arasında ayrım sağlamak için çok önemlidir. RBC sayısı kırınım deseninin yoğunluğunu etkilediğiiçin RBC sayısının düzeltilmesi önemlidir. Bob ve bardak arasındaki boşlukta daha düşük RBC numaraları varsa, eğri yukarı ve sola doğru hareket edecektir. Ayrıca, eğri dalgalanacak ve parametrelerin, özellikle pos'un doğru hesaplanmasını engelleyecektir.
Bu tekniğin bir sınırlama sı, EI değeri farklı alt popülasyonlar da dahil olmak üzere tüm hücrelerin ortalamasını temsil eder. SCD hastalarında RBC popülasyonlarının heterojenliği ve ektasittometri ölçümü üzerindeki etkisi yoğun olarak araştırılmıştır. Bu, kırınım deseninin boyutunun RBC sayısı23,24için düzeltilmiş yerine sabit bir değere ayarlandığı standardizasyonla sonuçlandı. Oksijen gradyan ektasittometri ölçümlerine bu şekilde standardizasyon uygulanıp uygulanmayacağı halen çalışMaktadır.
Hipoksik koşullar altında RBC deformiteölçmek için çeşitli teknikler ektasitometre dışında gerçekleşti bir deoksijenasyon adımı dayalı geliştirilmiştir25,26,27. Bu şartlar altında HbS özelliği olan hastalar ile fizyolojik pH25altında sağlıklı kontroller arasında hücresel davranış farklılıkları gözlenmemiştir. Oksijen gradyan ektasittometrisi, ancak HbS özelliği olan bireylerde düşük ama belirgin PoS gösterir (Şekil 4A). Bugüne kadar, rutin klinik uygulamada, tek bir hastanın RBC'lerinin in vitro orak eğilimini ölçmek için tek alternatif yöntem morfoloji tabanlı hastalanma tetkiki içerir: KBC'ler HbS polimerizasyonunu teşvik eden koşullar altında kuluçkaya yatırılır, örneğin düşük oksijen gerilimi veya düşük pH. Kuluçka sonrası bir fiksatif eklenir ve hasta hücrelerin yüzdesi ışık mikroskobu kullanılarak manuel veya dijital olarak sayılır. Birçok preklinik ve erken faz farmakolojik çalışmalar SCD28klinik etkinliğini tahmin edebilmek için ikincil bir sonuç değişkeni oluşturmak için hasta lık tsay kullanın,29,30,31 ,32. Ancak, zaman alıcı, değişkenlik yüksek ve duyarlılık düşük, teknik otomatik değildir ve bu nedenle, emek yoğun. Ayrıca, hastalık nedeniyle morfolojik değişiklikler, 2 boyutlu statik bir analiz2olduğu için, RBC deformite gibi fizyolojik parametreleri ile iyi ilişkili olmayabilir.
Oksijen gradyan ektasittometri hızlı ve tekrarlanabilir hastalık fonksiyonel bir töz sağlar. Bu endotel yüzeyi dikkate almaz bir in vitro testtir. Ancak, orak hücre çalışmaları için umut verici bir teknik yapma, hasta davranışı ve RBC özellikleri fonksiyonel yönlerini sağlar. Tekniğin gelecekteki uygulamaları arasında SCD hastalarında tedavi etkinliğinin izlenmesi, yeni tedavi stratejileri için biyomarker görevi gören, hastalık davranışının incelenmesi ve SCD'de kök hücre nakli sonrası kimerizmin izlenmesi yer almaktadır.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları beyan.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen Eurostars hibe estar18105 ve RR Mekatronik tarafından sağlanan sınırsız bir hibe tarafından desteklenmiştir. Yazarlar teknik destek için Sisto Hendriks ve Jan de Zoeten teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADVIA 120 Hematology Analyzer | Siemens | 067-A004-14 | Instrument |
| Cell-Dyn Sapphire Hematology Analyzer | Abbott | 8H00-01 | Instrument |
| Lorrca | RR Mechatronics | LORC109230 or LORC109110 | Instrument |
| Lorrca Software version V5.08 | RR Mechatronics | - | Software |
| Nitrogen gas 4.8 or 5.0 | Local | - | |
| O2-spot | RR Mechatronics | PO2S020153 | O2 measurement |
| Oxygenscan module (pO2scan) | RR Mechatronics | PO2S109000 | Add-on |
| Oxy-ISO | RR Mechatronics | QRR 030905 | Viscous solution |
| X-Clean | RR Mechatronics | QRR 010946 | Cleaning solution Lorrca |
References
- Clark, M. R., Mohandas, N., Shohet, S. B. Deformability of oxygenated irreversibly sickled cells. Journal of Clinical Investigation. 65 (1), 189-196 (1980).
- Smith, C., Kuettner, J., Tukey, D., White, J. Variable Deformability of Irreversibly Sickled Erythrocytes. Blood. 58 (1), 71-78 (1981).
- Clark, M., Mohandas, N., Embury, S., Lubin, B. A simple laboratory alternative to irreversibly sickled (ISC) counts. Blood. 60 (3), 659-663 (1982).
- DaCosta, L., et al. Diagnostic tool for red blood cell membrane disorders Assessment of a new generation ektacytometer. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 56 (1), 9-22 (2016).
- Rabai, M., et al. Deformability analysis of sickle blood using ektacytometry. Biorheology. 51 (2-3), 159-170 (2014).
- Ballas, S. K., Mohandas, N. Sickle red cell microrheology and sickle blood rheology. Microcirculation. 11 (2), 209-225 (2004).
- Connes, P., Alexy, T., Detterich, J., Romana, M., Hardy-Dessources, M. D., Ballas, S. K. The role of blood rheology in sickle cell disease. Blood Reviews. 30 (2), 111-118 (2015).
- Hierso, R., et al. Effects of oxidative stress on red blood cell rheology in sickle cell patients. British Journal of Haematology. 166 (4), 601-606 (2014).
- Mozar, A., et al. Red blood cell nitric oxide synthase modulates red blood cell deformabilityin sickle cell anemia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 64 (1), 47-53 (2016).
- Clark, M. R., Mohandas, N., Shohet, S. B. Osmotic Gradient Ektacytometry: Comprehensive Characterization of Red Cell Volume and Surface Maintenance. Blood. 61 (5), 899-911 (1983).
- Parrow, N. L., et al. Measurements of red cell deformability and hydration reflect HbF and HbA2in blood from patients with sickle cell anemia. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 65, 41-50 (2017).
- Steinberg, M. H., Chui, D. H. K., Dover, G. J., Sebastiani, P., Alsultan, A. Fetal hemoglobin in sickle cell anemia: A glass half full. Blood. 123 (4), 481-485 (2014).
- Ballas, S. K., Larner, J., Smith, E. D., Surrey, S., Schwartz, E., Rappaport, E. F. Rheologic predictors of the severity of the painful sickle cell crisis. Blood. 72 (4), 1216-1223 (1988).
- Lande, W. M., et al. The Incidence of Painful Crisis in Homozygous Sickle Cell Disease: Correlation with Red Cell Deformability. Blood. 72 (6), 2056-2059 (1988).
- Lemonne, N., et al. Does increased red blood cell deformability raise the risk for osteonecrosis in sickle cell anemia. Blood. 121 (15), 3054-3057 (2013).
- Ballas, S. K., Smith, E. D. Red blood cell changes during the evolution of the sickle cell painful crisis. Blood. 79 (8), 2154-2163 (1992).
- Telen, M. Cellular adhesion and the endothelium: E-selectin, L-selectin, and pan-selectin inhibitors. Hematology/Oncology Clinics of North America. 28 (2), 341-354 (2014).
- Papageorgiou, D. P., et al. Simultaneous polymerization and adhesion under hypoxia in sickle cell disease. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (38), 201807405 (2018).
- Liu, J., Qiang, Y., Alvarez, O., Du, E. Electrical impedance microflow cytometry with oxygen control for detection of sickle cells. Sensors and Actuators, B: Chemical. 255, 2392-2398 (2018).
- Du, E., Diez-Silva, M., Kato, G. J., Dao, M., Suresh, S. Kinetics of sickle cell biorheology and implications for painful vasoocclusive crisis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (5), 1422-1427 (2015).
- Li, Q., et al. Kinetic assay shows that increasing red cell volume could be a treatment for sickle cell disease. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (5), 689-696 (2017).
- Rab, M. A. E., et al. Rapid and reproducible characterization of sickling during automated deoxygenation in sickle cell disease patients. American Journal of Hematology. 94, February 575-584 (2019).
- Renoux, C., et al. Importance of methodological standardization of ektacytometric measures of red blood cell deformability in sickle cell anemia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 62 (2), 173-179 (2016).
- Parrow, N. L., et al. Measuring Deformability and Red Cell Heterogeneity in Blood by Ektacytometry. Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).
- Bessis, M., Feo, C., Jones, E. Quantitation of red cell deformability during progressive deoxygenation and oxygenation in sickling disorders (the use of an automated Ektacytometer). Blood Cells. 8 (1), 17-28 (1982).
- Sorette, M. P., Lavenant, M. G., Clark, M. R. Ektacytometric measurement of sickle cell deformability as a continuous function of oxygen tension. Blood. 67 (6), 1600-1606 (1987).
- Huang, Z., Hearne, L., Irby, C. E., King, S. B., Ballas, S. K., Kim-Shapiro, D. B. Kinetics of increased deformability of deoxygenated sickle cells upon oxygenation. Biophysical journal. 85 (4), 2374-2383 (2003).
- Antoniani, C., et al. Induction of fetal hemoglobin synthesis by CRISPR/Cas9-mediated editing of the human β-globin locus. Blood. 131 (17), 1960-1973 (2018).
- Abdulmalik, O., et al. Crystallographic analysis of human hemoglobin elucidates the structural basis of the potent and dual antisickling activity of pyridyl derivatives of vanillin. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (12), 1076 (2011).
- Oder, E., Safo, M. K., Abdulmalik, O., Kato, G. J., Discovery, D. New Developments in Anti-Sickling Agents: Can Drugs Directly Prevent the Polymerization of Sickle Haemoglobin In Vivo. British Journal of Haematology. 175 (1), 24-30 (2016).
- Oksenberg, D., et al. GBT440 increases haemoglobin oxygen affinity, reduces sickling and prolongs RBC half-life in a murine model of sickle cell disease. British Journal of Haematology. 175 (1), 141-153 (2016).
- Xu, G. G., et al. Synthesis, and Biological Evaluation of Ester and Ether Derivatives of Antisickling Agent 5-HMF for the Treatment of Sickle Cell Disease. Molecular Pharmaceutics. 14 (10), 3499-3511 (2017).
