Summary
Une méthode cryogénique de pulvérisation pour traiter les pattes murines à l'aide d'une usine de congélation à azote liquide a été mise au point pour améliorer le rendement et la qualité de l'ARN ou des protéines extraits des tissus et permettre l'analyse des profils moléculaires associés aux Réponses.
Abstract
Le profilage des changements moléculaires dans les tissus locaux est crucial pour comprendre le mécanisme d'action des candidats thérapeutiques in vivo. Dans le domaine de la recherche sur l'arthrite, de nombreuses études sont axées sur les articulations enflammées qui sont composées d'un mélange complexe d'os, de cartilage, de muscle, de cellules stromales et de cellules immunitaires. Ici, nous avons établi une méthode mécanique fiable et robuste pour perturber les pattes de souris enflammées en échantillons pulvérisés homogènes dans un environnement cryogéniquement contrôlé. Des lysates de protéine et d'ARN ont été traités pour permettre des paramètres protéomiques et transcriptionnels et la caractérisation moléculaire des voies pertinentes de la maladie dans les tissus locaux.
Introduction
La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie inflammatoire systémique chronique avec une synovite symétrique persistante dans les articulations et une implication articulaire supplémentaire d'organes tels que la peau, le cœur, les poumons et les yeux1. Bien que les manifestations systémiques de la réponse immunitaire soient évidentes dans les patients humains, une des caractéristiques de la pathologie de RA est l'infiltration des cellules immunitaires dans le tissu synovial et la prolifération des cellules synovials de fibroblaste2.
Semblable à la RA humaine, le modèle induit par l'arthrite de collagène de souris (CIA) suscite l'inflammation forte de tissu avec des réponses immunitaires actives dans les tissus synovials et les compartiments systémiques. La susceptibilité des différentes souches de souris aux liens de modèle de CIA au complexe d'histocompatibilité majeure (MHC) haplotype et antigène spécifiques interactions de cellules T et b de cellules3,4. En outre, beaucoup de voies pathogènes dans la RA humaine, y compris la production d'autoantibody, le dépôt complexe immunisé, l'activation de cellules myéloïdes, les manifestations polyarticulaires et la formation pannus avec l'infiltration immunisée synovial, sont également évidentes dans ce modèle 5,6. Les enquêteurs ont utilisé ce modèle bien établi de la CIA pour étudier les effets des traitements anti-inflammatoires cytokine7. Beaucoup de produits biologiques approuvés pour les maladies auto-immunes ou inflammatoires, tels que l'anti-TNF et anti-IL-6, se sont avérés efficaces dans le modèle de la CIA8,9.
Le profilage des interactions du système immunitaire dans le tissu synovial est crucial pour élucider les mécanismes moléculaires associés à la pathogénie de la polyarthrite rhumatoïde. Dans le cadre clinique humain, une pratique courante est d'effectuer des biopsies synoviales d'aiguille sous la conduite de l'imagerie par ultrasons. Dans les milieux précliniques, la plus petite architecture des articulations murines rend les procédures de biopsie beaucoup plus difficiles, voire impossibles. Récemment, nous avons démontré l'utilisation du modèle de la CIA murine pour évaluer les combinaisons de médicaments pour avoir un impact sur les points finaux disparates et résoudre la maladie dans une approche combinatoire10. Une méthode cryogénique de pulvérisation à base de moulin de congélation a été employée pour transformer les pattes murine enflammées en poudres fines homogènes et les processus établis en aval pour extraire l'ARN et les protéines. Cette méthode protège l'ARN et les protéines contre les processus de dégrativement enzymatiques et chimiques et nous permet d'appliquer plusieurs méthodes analytiques à une seule source d'échantillon homogénéisée.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément aux politiques du Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de Janssen R-D.
1. Méthode de pulvérisation cryogénique à base de moulin à congélateur
- À la fin de l'étude de CIA, sacrifiez des souris avec 1.5% d'isoflurane suivi de la dislocation cervicale.
- Le jour du traitement des tissus, pré-réfrigérer tous les instruments (spatules, flacons de broyage, etc.) sur de la glace sèche pendant au moins 10 min. Portez des gants thermiques pour éviter les dommages causés par le gel.
- Couper les pattes postérieures avec un ciseaux à la ligne de fourrure tel qu'il est représenté dans la figure 1A.
- Transférer chaque patte dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml, congeler immédiatement l'azote liquide et conserver les pattes congelées à -80 oC. Ne conservez pas les échantillons congelés pendant plus d'une semaine.
- Remplissez l'usine de congélation d'azote liquide comme le montre la figure 1B et laissez-le récalcitrerper pendant au moins 10 min.
- Conservez l'échantillon non transformé sur la glace sèche et évitez les cycles de gel et de dégel.
- Transférer une patte postérieure dans une grosse fiole de broyage en polycarbonate préréfrigérée à l'aide d'un bouchon en acier de fond, insérer l'impacteur d'acier préréfrigéré et fermer le flacon de broyage en polycarbonate avec la prise en acier supérieure préréfrigérée (Figure 1C).
- Transférer de grosses flacons de broyage en polycarbonate avec les échantillons dans le congélateur prérempli de liquide et fermer le couvercle avec le fermoir en caoutchouc trouvé à l'avant de l'instrument.
- Laisser refroidir les échantillons dans l'azote liquide pendant 1 minute.
- Placez le congélateur au programme de 1 minute avec 10 cycles par seconde et appuyez sur le bouton de démarrage. Attendez que le congélateur termine son cycle.
REMARQUE: La machine émet un son de tambour au fur et à mesure que l'impacteur d'acier se déplace d'avant en arrière. Utilisez des bouchons d'oreille pour éviter la perte auditive. - Ouvrez le couvercle du congélateur, retirez le gros flacon de broyage en polycarbonate et placez-le dans un extracteur tel qu'il est représenté dans la figure 1D. Retirez le bouchon en acier supérieur en exerçant une pression vers le bas sur la poignée noire jusqu'à ce que la fiche en acier glisse hors du tube de polycarbonate.
- Transférer le gros flacon de broyage en polycarbonate ouvert sur la glace sèche. Retirez l'impacteur en acier avec des forceps préréfrigérés.
- Transférer la poudre congelée dans un tube conique préréfrigéré de 50 ml.
- Poids 30-50 mg de poudre congelée dans un tube de microcentrifuge congelé de 1,5 ml pour l'extraction d'ARN et 100-200 mg de poudre congelée pour l'extraction de protéine.
REMARQUE: La poudre congelée doit ressembler à du sable fin blanc ou rose clair tel qu'il est représenté dans la figure 1E. - Entreposer les échantillons pulvérisés à -80 oC et procéder à l'isolement de l'ARN et des protéines dans un délai de 24 h.
2. Extraction d'ARN
- Ajouter 10 l'un de mercaptoéthanol par 1 ml de tampon RLT.
- Calculez le volume de tampon RLT correspondant à un rapport de 23,3 ml/mg de tissu et ajoutez le volume approprié de tampon RLT avec le tube avec de la poudre congelée. Ce rapport a été empiriquement déterminé pour être idéal pour des pattes de souris.
- Vortex l'échantillon à 3000 tr/min pour 10 s.
- Bien mélanger en faisant monter et descendre 10 fois vigoureusement avec un pipettor de 1 ml.
- Vortex l'échantillon à nouveau à 3.000 tr/min pour 20 s.
- Centrifuger le tube à 13 000 x g pendant 2 min.
- Transférer 700 l des supernatants dans un tube frais et ajouter 700 l d'éthanol à 70 %.
REMARQUE: Si le tube est dans le tube, il est acceptable de procéder, en ajoutant tout en même temps un volume équivalent de 70 % d'éthanol. - Chargez 700 ll de l'échantillon sur une colonne de purification de l'ARN.
- Centrifuger le tube à 10 000 x g pour 30 s.
- Jetez le flux et chargez la partie restante de l'échantillon sur la colonne RNeasy.
- Centrifuger le tube à 10 000 x g pour 30 s.
- Jetez le flux à travers et laver la colonne en ajoutant 700 L de tampon RW1 avec centrifugation de 10 000 x g pour 30 s. Si l'option d'exécution de la digestion DNASE, 350 L de RW1 est ajoutée avant le traitement DNASE. Et 350 L supplémentaires de RW1 sont ajoutés après le traitement DNASE.
- Facultatif) Effectuer une étape de digestion DNase suivre les instructions du fabricant.
- Laver le tube deux fois en ajoutant 500 l de tampon RPE suivi d'une centrifugation à 10 000 x g pour 30 s. Jeter le flux à travers chaque fois.
- Séchez la colonne par centrifugation à 10 000 x g pendant 2 min.
- L'ARN d'Elute en ajoutant 50 l d'eau avec centrifugation à 10 000 x g pendant 2 min. Recueillir le débit et le transférer dans un nouveau tube de 1,5 ml.
- Déterminer la quantité d'ARN à l'aide de la méthode de choix du chercheur et les stocker à -80 oC avant d'être analysé plus avant d'être analysé.
3. Extraction de protéines
- Diluer la solution de stock de lyse cellulaire 10x dans la solution de stock de lyse de 1x cellules à l'aide de l'eau de qualité de culture cellulaire.
- Reconstituer le Protease Inhibitor Cocktail Set I avec 1 ml d'eau pour faire un stock d'inhibiteur de protéase 100x.
- Ajouter 100 l d'inhibiteur de protéase à 9,9 ml de lyse cellulaire 1x pour faire une solution de stock final 1x.
- Ajouter 4 ll de froid glacé 1x Cell Lysis Buffer par mg de poudre de tissu (par exemple, 800 l de tampon de lyse à 200 mg de poudre de tissu).
- Ajouter une perle en acier inoxydable de 5 mm au tube.
- Vortex le tube à 3 000 tr/min pour 60 s. Transférer le tube à la glace humide et continuer à l'échantillon suivant.
- Placer tous les tubes d'échantillon dans une boîte et secouer la boîte de centrifugeuse sur un rocker à 1 000 tr/min, 4 oC pour 1 h.
REMARQUE: Les chercheurs peuvent constater que le placement de la boîte verticale peut faciliter un meilleur mélange avec la perle. - Centrifuger les tubes à 10 000 x g et 4 oC pendant 15 min.
- Transférer les supernatants dans un tube frais et éviter la couche de graisse sur le dessus.
- Déterminer la concentration totale de protéines. Les dilutions de 10 à 30 fois de lysate protéique sont idéales pour un test BCA.
- Aliquot l'échantillon dans 1,5 mL de tubes microcentrifugeets et stocker à -80 oC avant une analyse plus approfondie.
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Representative Results
Ici, nous montrons une visualisation d'image de gel représentatif de l'ARN extrait des pattes avant des souris de CIA dans la figure 2A. Le rRNA 28S et la bande de rRNA 18S indiquent que tous les échantillons ont une quantité suffisante d'ARN intact. Ensuite, nous montrons une parcelle de dispersion représentative des concentrations totales de protéines basées sur l'analyse des protéines BCA à la figure 2B. Les concentrations totales de protéines provenant de souris naïves, de souris de la CIA ou de souris de la CIA dans le cadre de divers traitements sont comparables d'un groupe à l'autre. Pour déterminer les concentrations de cytokines inflammatoires et de chemokines dans l'extrait de protéine, des analyses de Luminex ont été conduites. Nous montrons une parcelle de dispersion représentative des concentrations de cytokines et de chimiokines normalisées (protéines totales de pg/mg) dans la figure 2C. Comparé aux souris naïves, plusieurs cytokines sont élevés chez les souris de CIA et le traitement avec l'anticorps anti-IL17A inhibe de manière significative la production de plusieurs cytokines. Pour évaluer les changements de transcriptome dans CIA et les effets liés au traitement, l'analyse de microarray a été exécutée. Nous montrons une parcelle représentative de cartes thermiques de gènes significativement augmenté chez les souris de la CIA par rapport aux souris naïves dans la figure 2D.
Figure 1 : Équipement nécessaire pour pulvériser les pattes murines. (A) Pattes enflammées ou non enflammées de souris de la CIA ou naïves. (B) L'azote liquide Dewar utilisé pour remplir le bain en acier inoxydable de l'usine de congélation. (C) Ensemble de tube de moulin de congélateur assemblé. (D) Ouvre-tube de moulin de congélation. (E) Tissu pulvérisé des pattes murines. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Données représentatives sur l'analyse des protéines et de l'ARN des pattes murines pulvérisées. (A) Visualisation d'image de gel de l'intégrité d'ARN. (B) Concentrations totales de protéines de différents groupes. (C) Chemokine et cytokine (Luminex) de différents groupes. (D) Carte thermique hiérarchique de microarray de différents groupes de traitement. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Bien qu'il existe une forte justification scientifique pour évaluer les voies moléculaires dans les tissus synovials, de nombreux rapports sur le profilage immunitaire du modèle de la CIA maurine ont été axés sur le sang périphérique, tandis que les données d'analyse des protéines et de l'ARN des pattes enflammées sont plutôt limitées. Il y a plusieurs raisons possibles à ce biais : les articulations de la cheville murine ne sont pas plus grandes que 2 cm; les zones touchées sont constituées de tissus cutanés, osseux et conjonctifs qui sont souvent difficiles à homogénéiser à l'aide de méthodes traditionnelles comme les broyeurs de tissus, le pilon et le mortier, la perturbation des perles de silice, la trituration ou la digestion enzymatique. Ces méthodes ont généralement comme conséquence l'homogénéisation incomplète, le faible rendement de protéine ou d'ARN, ou la qualité incohérente due à la dégradation protéolytique et nucléique d'acide. La méthode robuste décrite ci-première fournit une procédure détaillée pour générer une poudre congelée pulvérisée homogène pour permettre aux efforts de profilage protéomique et transcriptionnel en aval d'établir des signatures moléculaires de la maladie à partir d'un seul échantillon uniforme source.
Plusieurs étapes critiques doivent être prises en compte lors de l'exécution de cette méthode. Tout d'abord, les pattes de murine doivent être coupées à la ligne de fourrure pendant la récolte des tissus et de grandes quantités de cheveux doivent être évitées. Les cheveux excessifs peuvent obstruer des colonnes pendant l'extraction d'ARN et interférer avec l'extraction de protéine. Deuxièmement, les tubes, les forceps et les spatules doivent être conservés sur la glace sèche tout au long de la procédure parce que la température élevée dans les poudres de tissu transformera rapidement le matériau en « boue » amorphe et l'intégrité des protéines et de l'ARN sera compromise. Troisièmement, la quantité de poudre de tissu utilisée pour l'extraction de protéines ou d'ARN doit être soigneusement optimisée. Plus de poudre de tissu peut ne pas toujours fournir un rendement plus élevé, mais peut causer des problèmes supplémentaires dans le traitement en aval, y compris obstruer les colonnes d'isolement de l'ARN, modifier le rapport DNase / ADN (si cette étape est utilisée) pour prévenir la dégradation complète de l'ADN. Enfin, la normalisation des apports en protéines et en ARN devrait faire partie intégrante du flux de travail et de l'analyse des données. La variabilité de la charge tissulaire peut masquer de manière significative les changements dans les niveaux relatifs de protéines et d'ARN. En plus de la protéine totale ou de l'ARN total, l'expression des gènes d'entretien ménager peut également être considérée comme des points d'ancrage pour la normalisation.
Grâce à un vaste processus d'essais et d'erreurs, nous avons identifié certains problèmes fréquents potentiels pour les utilisateurs de cette méthode pour la première fois. Il peut y avoir un faible rendement de l'ARN. Ceci est souvent le résultat de la surcharge de la colonne avec trop d'extrait de tissu. La quantité de tissu par colonne et le rapport de RLT/poudre sont cruciaux pour des isolements efficaces d'ARN. Nous avons constaté que certains kits commerciaux d'extraction de puits 96 peuvent ne pas fonctionner pour ce processus, car les échantillons ne tourneront pas à travers la colonne à un taux équivalent, compromettant ainsi ces échantillons dans les étapes de lavage et d'élution en aval. Il peut y avoir une grande variabilité de la concentration de protéines dans l'analyse BCA et les concentrations de cytokine dans l'analyse Luminex. S'il n'y a aucun problème avec le BCA ou le procédé De Luminex, il est généralement causé par la graisse ou d'autres contaminants dans l'extrait de protéine. Il est important d'éviter la couche de graisse au sommet ou la matière insoluble au fond des tubes de microcentrifuge lors de la récolte pour l'extraction de protéines. Si nécessaire, répétez le spin et collectez les supernatants pour l'analyse en aval.
Comme cette méthode comprend une usine de congélation cryogénique spécialisée et de grandes quantités de glace sèche et d'azote liquide, des mesures de sécurité supplémentaires devraient être envisagées. Un équipement de protection personnelle approprié, y compris des lunettes de sécurité, des blouses de laboratoire et des gants cryogéniques, doit toujours être porté pour prévenir les brûlures et les blessures causées par l'explosion. La production d'aérosols devrait également être réduite au minimum et l'utilisation d'enceintes d'équilibre ventilés est conseillée. Enfin, comme tout autre protocole de manipulation des tissus animaux, il faut prendre soin de se débarrasser correctement de tous les échantillons de tissus inutilisés, tandis que les tubes réutilisables doivent être décontaminés avant le nettoyage.
Bien que la méthode présente de nombreux avantages par rapport aux méthodes conventionnelles, elle comporte encore certaines limites. Le profil transcriptome d'une patte entière murine chevauche de manière significative avec le profil transcriptome de la biopsie synoviale humaine (données non montrées). L'ARNm supplémentaire du muscle, de la peau et de la moelle osseuse pourrait diluer les signaux du tissu synovial. Une solution alternative consiste à recueillir le tissu synovial murine par microdissection laser, qui peut être effectuée sur les joints de souris intégrés OCT. Cependant, un faible débit et la quantité relativement faible de tissu limite l'application large pour la microdissection laser. En outre, même avec une automatisation significative, cette méthode est encore assez laborieux. Il faut au moins 8 h pour traiter 30-60 échantillons avec l'aide de 3-4 enquêteurs. Enfin, cette méthode nécessite de grandes quantités d'azote liquide (10-15 L pour le traitement de 30-60 échantillons).
Dans la description de méthode précédente, l'évaluation des analyses protéomiques et transcriptionnelles de point de terminaison a été démontrée. Cependant, un autre point de terminaison, comme les lipidomiques, les métabolomiques et le profilage des petits ARN, pourrait intéresser l'ensemble de la communauté de recherche sur l'arthrite.
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Disclosures
Les auteurs BJ, SH, ML, RM, ML, TO et FS sont des employés de Janssen Research and Development Inc et sont actionnaires de la société mère, Johnson et Johnson, Inc.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Edith Janssen pour la critique du manuscrit et Navin Rao et Jennifer Towne pour leur soutien à la publication de ce manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mm stainless steel bead | Qiagen | 69989 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Sample reducing agent that inhibits RNASE enzymes |
| Bioanalyzer Kit | Agilent | 5067-1511 | RNA qualification kit |
| b-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Cell Culture Grade Water | Corning | 25-055-CI | Water |
| Cell lysis stock solution | Cell Signaling | 9803 | |
| Eppendorf Tube | Eppendorf | 22363204 | Microfuge tubes |
| Eppendorf tube centrifuge box | Nalgene | 5055 | Box for holding eppendorf tubes in horizontal tube arrangement |
| Everlast 247 Variable Speed Rocker | Benchmark Scientific | BR5000 | |
| Freezer Mill | Spex Sample Prep | 6875 | Freezer/Mill for processing paws into pulverized powder |
| Grinding Vial | Spex Sample Prep | 6801 | Polycarbonate vial for processing paws into pulverized powder |
| Pierce BCA kit | Pierce | 23225 | Kit for Total Protein Quantification |
| Protease Inhibitor Cocktail set 1 | Calbiochem | 539131 | Protease Inhibitors |
| Protein BCA Kit | Pierce | 23225 | |
| Quantigene Kit | Thermofisher | QP1013 | bDNA analysis Kit |
| Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | Centrifugation |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | RNA extraction buffer |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | including RNeasy column, RLT Buffer and RW1 Buffer |
| Shaker | Benchmark Scientific | BR5000 | Rocker/Shaker |
| Spatula | VWR | 10806-412 | Spatula for powder transfer |
| Stainless Steel Bead | Qiagen | 69989 | Bead for mixing during protein extraction |
| Tube Extractor | Spex Sample Prep | 6884 | Extractor for removing the top of grinding vial |
| Vortexer | VWR | 10153-838 | Sample mixing |
References
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