Un protocollo di criopulverizzazione per l'elaborazione delle zampe del topo per valutare i percorsi molecolari di infiammazione dei tessuti in un modello di artrite indotta dal collagene

Summary

È stato sviluppato un metodo criogenico di polverizzazione per la trattamento delle zampe murine utilizzando un congelatore liquido congelatore di azoto per migliorare la resa e la qualità dell'RNA o delle proteine estratte dai tessuti e consentire l'analisi dei profili molecolari associati agli infiammatori Risposte.

Abstract

Profilare i cambiamenti molecolari nei tessuti locali è fondamentale per comprendere i meccanismi di azione dei candidati terapeutici in vivo. Nel campo della ricerca sull'artrite, molti studi si concentrano sulle articolazioni infiammate che sono composte da una complessa miscela di ossa, cartilagine, muscoli, cellule stromali e cellule immunitarie. Qui, abbiamo stabilito un metodo meccanico affidabile e robusto per interrompere le zampe di topo infiammate in campioni polverizzati omogenei in un ambiente controllato criogenicamente. Le proteine e i lysati di RNA sono stati elaborati per consentire gli endpoint proteomici e trascrittivi e la caratterizzazione molecolare delle vie di malattia rilevanti nel tessuto locale.

Introduction

L'artrite reumatoide (RA) è una malattia infiammatoria sistemica cronica con sinovite simmetriche persistenti nelle articolazioni e coinvolgimento extra articolare di organi come la pelle, il cuore, i polmoni e gli occhi¹. Anche se le manifestazioni sistemiche della risposta immunitaria sono evidenti nei pazienti umani, uno dei segni distintivi della patologia RA è l'infiltrazione delle cellule immunitarie nel tessuto sinoviale e la proliferazione delle cellule fibroblaste sinoviali².

Simile all'AR umana, il modello di artrite indotta dal collagene di topo (CIA) suscita una forte infiammazione tissutale con risposte immunitarie attive nei tessuti sinoviali e nei compartimenti sistemici. La suscettibilità di diversi ceppi di mouse al modello CIA si collega all'aplotipo del complesso di istocompatibilità maggiore (MHC) e alle interazioni specifiche delle cellule T e delle cellule B^3,4. Inoltre, molte vie patogene nell'AR umana, tra cui la produzione di autoanticorpi, deposizione del complesso immunitario, attivazione delle cellule mieloidi, manifestazioni poliuacolari e formazione di pannus con infiltrazione immunitaria sinoviale, sono anche evidenti in questo modello ^5,6. Gli investigatori hanno impiegato questo modello ben consolidato CIA per studiare gli effetti dei trattamenti citochini antinfiammatori⁷. Molti biologici omologati per le malattie autoimmuni o infiammatorie, come anti-TNF e anti-IL-6, sono trovati per essere efficace nel modello CIA^8,9.

Profilare le interazioni del sistema immunitario nel tessuto sinoviale è fondamentale per chiarire i meccanismi molecolari associati alla patogenesi dell'AR. Nell'ambiente clinico umano, una pratica comune è quella di eseguire biopsie sinoviali dell'ago sotto la guida dell'imaging a ultrasuoni. Negli ambienti preclinici, l'architettura più piccola delle articolazioni murine rende le procedure di biopsia molto più difficili se non impossibili. Recentemente, abbiamo dimostrato l'utilizzo del modello murine CIA per valutare combinazioni di farmaci per influenzare diversi endpoint e risolvere la malattia in un approccio combinatorio¹⁰. È stato utilizzato un metodo di polverizzazione criogenico basato sul mulino a congelatore per elaborare le zampe murine infiammate in polveri fini omogenee e stabilire processi a valle per estrarre RNA e proteine. Questo metodo protegge l'RNA e le proteine dai processi degrativi enzimatici e chimici e ci consente di applicare più metodi analitici a una singola fonte di campione omogenea.

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti secondo le politiche del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) della R&S di Janssen.

1. Metodo di pulverizzazione criogenico basato sul mulino congelatore

1. Al termine dello studio della CIA, sacrificare i topi con 1.5% isoflurane seguiti da lussazione cervicale.
2. Il giorno della lavorazione dei tessuti, preraffreddare tutti gli strumenti (spatole, fiale di macinazione, ecc.) sul ghiaccio secco per un minimo di 10 min. Indossare guanti termici per evitare danni da congelamento.
3. Tagliare le zampe posteriori con una forbice alla linea di pelliccia come raffigurato nella Figura 1A.
4. Trasferire ogni zampa in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml, congelare immediatamente in azoto liquido e conservare le zampe congelate a -80 gradi centigradi. Non tenere i campioni congelati per più di una settimana.
5. Riempire il mulino congelatore con azoto liquido come mostrato nella Figura 1B e lasciare che sia equilibrato per almeno 10 min.
6. Conservare il campione non lavorato sul ghiaccio secco ed evitare cicli di congelamento-scongelamento.
7. Trasferire una zampa posteriore in una grande fiala di macinazione in policarbonato preraffreddata con una spina d'acciaio inferiore, inserire l'impattore in acciaio pre-raffreddato e chiudere la fiala di macinazione in policarbonato con la spina in acciaio superiore pre-raffreddato (Figura 1C).
8. Trasferire grandi fiale di macinazione in policarbonato con i campioni nel congelatore pre-riempito con liquido e chiudere il coperchio con la chiusura di gomma trovata nella parte anteriore dello strumento.
9. Lasciare raffreddare i campioni in azoto liquido per 1 minuto.
10. Impostare il mulino del congelatore sul programma di 1 minuto con 10 cicli al secondo e premere il pulsante di avvio. Attendere che il congelatore completi il ciclo.
    NOT: La macchina emette un suono di batteria mentre l'impatto in acciaio si muove avanti e indietro. Utilizzare tappi per le orecchie per evitare la perdita dell'udito.
11. Aprire il coperchio del congelatore, estrarre la grande fiala di macinazione in policarbonato e metterla in un estrattore come raffigurato nella Figura 1D. Rimuovere la spina di acciaio superiore posizionando la pressione verso il basso sulla maniglia nera fino a quando il tappo in acciaio scivola fuori dal tubo in policarbonato.
12. Trasferire la grande fiala di macinazione in policarbonato aperta sul ghiaccio secco. Rimuovere l'impatto dell'acciaio con pinze pre-raffreddamento.
13. Trasferire la polvere congelata in un tubo conico pre-raffreddato da 50 mL.
14. Peso 30-50 mg di polvere congelata in un tubo di microcentrifuga congelato in tarata da 1,5 mL per l'estrazione dell'RNA e 100-200 mg di polvere congelata per l'estrazione di proteine.
    NOT: La polvere congelata dovrebbe apparire come sabbia fine bianco o rosa chiaro come raffigurato in Figura 1E.
15. Conservare campioni polverizzati a -80 gradi centigradi e procedere all'isolamento di RNA e proteine entro 24 h.

2. Estrazione dell'RNA

1. Aggiungere 10 L di mercaptoetanolo (z-ME) per 1 mL di buffer RLT.
2. Calcolare il volume di RLT Buffer corrispondente a un rapporto di 23,3 mL/mg di tessuto e aggiungere il volume appropriato di RLT Buffer con z-ME al tubo con polvere congelata. Questo rapporto era empiricamente determinato per essere ideale per le zampe dei topi.
3. Vorticare il campione a 3.000 RPM per 10 s.
4. Mescolare bene conilare su e giù 10 volte vigorosamente con un pipettor 1 mL.
5. Vorticare il campione di nuovo a 3.000 RPM per 20 s.
6. Centrifugare il tubo a 13.000 x g per 2 min.
7. Trasferire 700 l di z L dei supernatanti in un tubo fresco e aggiungere 700 lun del 70% di etanolo.
   NOT: Se nel tubo è presente <700 , è accettabile procedere, aggiungendo comunque un volume equivalente del 70% di etanolo.
8. Caricare 700 -L del campione su una colonna di purificazione dell'RNA.
9. Centrifugare il tubo a 10.000 dollari x g per 30 s.
10. Eliminare il flow-through e caricare la parte rimanente del campione nella colonna RNeasy.
11. Centrifugare il tubo a 10.000 dollari x g per 30 s.
12. Scartare il flusso e lavare la colonna aggiungendo 700 luna di tampone RW1 con centrifugazione di 10.000 x g per 30 s. Se si esegue l'opzione di digestione DNASE, viene aggiunto 350 L di RW1 prima del trattamento DNASE.  E dopo il trattamento DNASE vengono aggiunti altri 350 luna di RW1.
13. Facoltativo) Eseguire un passaggio di digestione DNase seguire le istruzioni del produttore.
14. Lavare il tubo due volte aggiungendo 500 L di tampone RPE seguito da centrifugazione a 10.000 dollari x g per 30 s. Scartare il flusso attraverso ogni volta.
15. Asciugare la colonna per centrifugazione a 10.000 dollari x g per 2 min.
16. Elute RNA aggiungendo 50 o più acqua con centrifugazione a 10.000 dollari x g per 2 min. Raccogliere il flusso attraverso e trasferire in un nuovo tubo da 1,5 mL.
17. Determinare la quantità di RNA utilizzando il metodo di scelta del ricercatore e conservare a -80 gradi centigradi prima di ulteriori analisi.

3. Estrazione di proteine

1. Diluire la soluzione di stock di lisi 10x cellule in 1x soluzione di stock di lisi 1x cella utilizzando acqua di grado coltura cellulare.
2. Ricostituire il Protease Inhibitor Cocktail Set I con 1 mL di acqua per fare uno stock di inibitori proteasi 100x.
3. Aggiungere 100 l di inibitore della proteasi a 9,9 mL di lisi 1x Cell per fare una soluzione di stock finale 1x.
4. Aggiungere 4 - L di ghiaccio freddo 1x Cell Lysis Buffer per mg tessuto in polvere (ad esempio, 800 L di lisi tampone a 200 mg di polvere di tessuto).
5. Aggiungere una perlina in acciaio inossidabile di 5 mm al tubo.
6. Vorticare il tubo a 3.000 giri/min per 60 s. Trasferire il tubo sul ghiaccio bagnato e continuare fino al campione successivo.
7. Mettere tutti i tubi campione in una scatola e agitare la scatola di centrifuga su un rocker a 1.000 giri/ hanno 1,000 giri/min, 4 gradi centigradi per 1 h.
   NOT: I ricercatori possono scoprire che il posizionamento della scatola verticale può facilitare una migliore miscelazione con il tallone.
8. Centrifugare i tubi a 10.000 x g e 4 gradi centigradi per 15 min.
9. Trasferire i supernatanti in un tubo fresco ed evitare lo strato di grasso sulla parte superiore.
10. Determinare la concentrazione totale di proteine. Da 10 a 30 volte diluizioni di proteine lisate sono ideali per un test BCA.
11. Aliquota il campione in tubi di microcentrismo da 1,5 ml e conservatelo a -80 gradi centigradi prima di ulteriori analisi.

Representative Results

Qui, mostriamo una visualizzazione dell'immagine gel rappresentativa dell'RNA estratta dalle zampe anteriori dei topi della CIA in Figura 2A. Il rRNA 28S e la banda 18S di rRNA indicano che tutti i campioni hanno una quantità sufficiente di RNA intatto. Successivamente, mostriamo un grafico a dispersione rappresentativa delle concentrazioni totali di proteine sulla base dell'analisi della proteina BCA nella figura 2B. Le concentrazioni totali di proteine da topi ingenui, topi della CIA o topi della CIA in vari trattamenti sono comparabili tra i gruppi. Per determinare le concentrazioni di citochine infiammatorie e chemiochine nell'estratto di proteina, sono state condotte analisi Di Luminex. Mostriamo un grafico a dispersione rappresentativa delle concentrazioni di citochine normalizzate e chemiochine (proteina totale pg/mg) nella Figura 2C. Rispetto ai topi ingenui, diverse citochine sono elevate nei topi della CIA e il trattamento con anticorpo anti-IL17A inibisce significativamente la produzione di diverse citochine. Per valutare i cambiamenti del trascrittoma nella CIA e gli effetti correlati al trattamento, è stata eseguita l'analisi dei microarray. Mostriamo un grafico rappresentativo della mappa di calore dei geni significativamente aumentato nei topi della CIA rispetto ai topi ingenui in Figura 2D.

Figura 1: Attrezzature necessarie per polverizzare le zampe murine. (A) zampe infiammate o non infiammate da CIA o topi ingenui. (B) Azoto liquido Dewar utilizzato per riempire il bagno in acciaio inossidabile del congelatore. (C) Set di tubi del mulino congelatore assemblati. (D) Apri tubi per congelatori. (E) Tessuto polverizzato dalle zampe murine. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Dati rappresentativi sull'analisi di proteine e RNA da zampe di murino polverizzate. (A) Visualizzazione dell'immagine Gel dell'integrità dell'RNA. (B) Concentrazioni proteiche totali di gruppi diversi. (C) Chemokine e citochine espressione (Luminex) da diversi gruppi. (D) Mappa di calore di clustering gerarchico dell'analisi dei microarray da diversi gruppi di trattamento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Anche se c'è una forte logica scientifica per valutare le vie molecolari nei tessuti sinoviali, molte segnalazioni sulla profilazione immunitaria del modello della CIA murina erano focalizzate sul sangue periferico, mentre i dati di analisi delle proteine e dell'RNA delle zampe infiammate sono piuttosto limitati. Ci sono diverse possibili ragioni per questo pregiudizio: le articolazioni della caviglia murina non sono più grandi di 2 cm; le aree colpite sono costituite da tessuti cutanei, ossei e connettivi che sono spesso difficili da omogeneizzare utilizzando metodi tradizionali come smerigliatrici di tessuti, pestinee e malta, perturbazione del tallone di silice, triturazione o digestione enzimatica. Questi metodi in genere provocano un'omogeneizzazione incompleta, una bassa resa di proteine o RNA o una qualità incoerente a causa della degradazione dell'acido proteolitico e nucleico. Il metodo robusto descritto qui fornisce una procedura dettagliata per generare una polvere congelata polverizzata omogenea per consentire sforzi di profilazione proteomica e trascrittivale a valle per stabilire le firme molecolari della malattia da un singolo campione uniforme fonte.

Quando si esegue questo metodo, è necessario considerare diversi passaggi critici. In primo luogo, le zampe murine dovrebbero essere tagliate alla linea di pelliccia durante il raccolto dei tessuti e grandi quantità di capelli dovrebbero essere evitate. L'eccessivo acconciatura dei capelli può intasare le colonne durante l'estrazione dell'RNA e interferire con l'estrazione di proteine. In secondo luogo, tubi, pinze e spatole devono essere tenuti sul ghiaccio secco per tutta la procedura, perché la temperatura elevata nelle polveri tissutali trasformerà rapidamente il materiale in "fango" amorfo e l'integrità delle proteine e dell'RNA sarà compromessa. In terzo luogo, la quantità di polvere tissutale utilizzata per l'estrazione di proteine o RNA deve essere attentamente ottimizzata. Più polvere tissutale può non sempre fornire una maggiore resa, ma può causare ulteriori problemi nell'elaborazione a valle, tra cui intasamento delle colonne di isolamento dell'RNA, alterando il rapporto DNase/DNA (se questo passaggio è impiegato) per prevenire la completa degradazione del DNA. Infine, la normalizzazione dell'input di proteine e RNA dovrebbe essere parte integrante del flusso di lavoro e dell'analisi dei dati. La variabilità nel carico dei tessuti può mascherare significativamente i cambiamenti nei livelli relativi di proteine e RNA. Oltre alla proteina totale o all'RNA totale, l'espressione dei geni delle pulidi può anche essere considerata come ancoraggi per la normalizzazione.

Attraverso un ampio processo di tentativi ed errori, abbiamo identificato alcuni potenziali problemi frequenti per i nuovi utenti di questo metodo. Ci può essere un basso rendimento di RNA. Questo è spesso il risultato del sovraccarico della colonna con troppo estratto di tessuto. La quantità di tessuto per colonna e il rapporto di RLT/polvere sono cruciali per un efficiente isolamento dell'RNA. Abbiamo scoperto che alcuni kit commerciali di estrazione 96 pozzi potrebbero non funzionare per questo processo in quanto i campioni non gireranno attraverso la colonna ad un tasso equivalente, compromettendo così questi campioni nel lavaggio a valle e nei passaggi di eluizione. Nell'analisi Luminex può esserci un'elevata variabilità nella concentrazione di proteine nell'analisi BCA e nelle concentrazioni di citochine. Se non ci sono problemi con il BCA o il processo Luminex, è in genere causato da grasso o altri contaminanti nell'estratto di proteina. È importante evitare lo strato di grasso nella parte superiore o insolubile della materia nella parte inferiore dei tubi di microcentrifuga durante la raccolta per l'estrazione delle proteine. Se necessario, ripetere lo spin e raccogliere i supernatanti per l'analisi a valle.

Poiché questo metodo prevede un congelatore criogenico specializzato e grandi quantità di ghiaccio secco e azoto liquido, dovrebbero essere prese in considerazione misure di sicurezza aggiuntive. Per prevenire potenziali ustioni da congelamento e lesioni dovute all'esplosione, è sempre necessario indossare attrezzature di protezione personale adeguate, tra cui occhiali di sicurezza, camici da laboratorio e guanti criogenici. Anche la generazione di aerosol deve essere ridotta al minimo e si consiglia l'uso di custodie per bilanci eleosi. Infine, analogamente a qualsiasi altro protocollo che tratta i tessuti animali, occorre prestare attenzione a smaltire correttamente tutti i campioni di tessuto inutilizzati, mentre i tubi riutilizzabili devono essere decontaminati prima della pulizia.

Mentre il metodo ha molti vantaggi rispetto ai metodi convenzionali, presenta ancora alcune limitazioni. Il profilo del trascrittoma da una zampa intera murina si sovrappone significativamente al profilo del trascrittoma della biopsia sinoviale umana (dati non mostrati). Ulteriori mRNA da muscolo, pelle e midollo osseo potrebbero diluire i segnali dal tessuto sinoviale. Una soluzione alternativa consiste nel raccogliere il tessuto sinoviale murino attraverso la microdissezione laser, che può essere eseguita sulle articolazioni di topi incorporate nello Strumento di personalizzazione di Office. Tuttavia, la bassa produttività e la quantità relativamente piccola di tessuto limita l'ampia applicazione per la microdissezione laser. Inoltre, anche con l'automazione significativa, questo metodo è ancora piuttosto laborioso. Ci vogliono almeno 8 h per elaborare 30-60 campioni con l'aiuto di 3-4 investigatori. Infine, questo metodo richiede grandi quantità di azoto liquido (10-15 L per la lavorazione di 30-60 campioni).

Nella descrizione del metodo precedente, è stata dimostrata la valutazione delle analisi degli endpoint proteomici e trascrittivi. Tuttavia, un endpoint aggiuntivo, come la lipimamica, la metabolomica e la piccola profilazione dell'RNA potrebbero essere di interesse per la più ampia comunità di ricerca sull'artrite.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mm stainless steel bead	Qiagen	69989
beta-mercaptoethanol	Sigma	M6250	Sample reducing agent that inhibits RNASE enzymes
Bioanalyzer Kit	Agilent	5067-1511	RNA qualification kit
b-mercaptoethanol	Sigma	M6250
Cell Culture Grade Water	Corning	25-055-CI	Water
Cell lysis stock solution	Cell Signaling	9803
Eppendorf Tube	Eppendorf	22363204	Microfuge tubes
Eppendorf tube centrifuge box	Nalgene	5055	Box for holding eppendorf tubes in horizontal tube arrangement
Everlast 247 Variable Speed Rocker	Benchmark Scientific	BR5000
Freezer Mill	Spex Sample Prep	6875	Freezer/Mill for processing paws into pulverized powder
Grinding Vial	Spex Sample Prep	6801	Polycarbonate vial for processing paws into pulverized powder
Pierce BCA kit	Pierce	23225	Kit for Total Protein Quantification
Protease Inhibitor Cocktail set 1	Calbiochem	539131	Protease Inhibitors
Protein BCA Kit	Pierce	23225
Quantigene Kit	Thermofisher	QP1013	bDNA analysis Kit
Refrigerated microcentrifuge	Eppendorf	5417R	Centrifugation
RLT Buffer	Qiagen	79216	RNA extraction buffer
RNeasy mini kit	Qiagen	74104	including RNeasy column, RLT Buffer and RW1 Buffer
Shaker	Benchmark Scientific	BR5000	Rocker/Shaker
Spatula	VWR	10806-412	Spatula for powder transfer
Stainless Steel Bead	Qiagen	69989	Bead for mixing during protein extraction
Tube Extractor	Spex Sample Prep	6884	Extractor for removing the top of grinding vial
Vortexer	VWR	10153-838	Sample mixing