Summary
एक तरल नाइट्रोजन फ्रीजर मिल का उपयोग कर murine पंजे प्रक्रिया करने के लिए एक क्रायोजेनिक pulverization विधि की उपज और आरएनए या ऊतकों से निकाले प्रोटीन की गुणवत्ता में सुधार और भड़काऊ के साथ जुड़े आणविक प्रोफाइल के विश्लेषण को सक्षम करने के लिए विकसित किया गया था जवाब.
Abstract
स्थानीय ऊतकों में आणविक परिवर्तन ों की रूपरेखा विवो में चिकित्सीय उम्मीदवारों की कार्रवाई के तंत्र (ओं) को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। गठिया अनुसंधान के क्षेत्र में, कई अध्ययनों सूजन जोड़ों कि हड्डी का एक जटिल मिश्रण से बना रहे हैं पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं, उपास्थि, मांसपेशियों, stromal कोशिकाओं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं. यहाँ, हम एक cryogenicly नियंत्रित वातावरण में सजातीय pulverized नमूनों में सूजन माउस पंजे को बाधित करने के लिए एक विश्वसनीय और मजबूत यांत्रिक विधि की स्थापना की. प्रोटीन और आरएनए lysates proteomic और प्रतिलेखनीय समापन बिंदु और स्थानीय ऊतक में प्रासंगिक रोग रास्ते के आणविक लक्षण को सक्षम करने के लिए संसाधित किया गया.
Introduction
रूमेटोइड गठिया (आरए) जोड़ों में लगातार सममित synovitis और त्वचा, दिल, फेफड़े, और आंखों1जैसे अंगों की अतिरिक्त संधि की भागीदारी के साथ एक पुरानी प्रणालीगत सूजन रोग है। हालांकि प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के प्रणालीगत अभिव्यक्तियों मानव रोगियों में स्पष्ट कर रहे हैं, आरए पैथोलॉजी की पहचान में से एक synovial ऊतक में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की घुसपैठ और synovial फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं के प्रसार2है.
मानव आरए के समान, माउस कोलेजन प्रेरित गठिया (सीआईए) मॉडल synovial ऊतकों और प्रणालीगत डिब्बों में सक्रिय प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के साथ मजबूत ऊतक सूजन प्रकाश में लाता है। सी.आई.ए. मॉडल के लिए अलग-अलग माउस उपभेदों की संवेदनशीलता मेजर हिस्टोकॉम्बिलिटी कॉम्प्लेक्स (एमएचसी) हैप्लोटाइप और एंटीजन विशिष्ट टी सेल और बी सेल बातचीत3,4से संबंधित है। इसके अलावा, मानव आरए में कई रोगजनक रास्ते, ऑटोएंटीबॉडी उत्पादन, प्रतिरक्षा जटिल जमाव, माइलॉयड सेल सक्रियण, पॉलीआर्टिकुलर अभिव्यक्तियों और पैनस गठन सहित, इस मॉडल में भी स्पष्ट हैं 5,6. जांचकर्ताओं विरोधी भड़काऊ साइटोकिन उपचार7के प्रभाव की जांच करने के लिए इस अच्छी तरह से स्थापित सीआईए मॉडल कार्यरत है. ऑटोम्यून्यून या भड़काऊ रोगों के लिए अनुमोदित कई जीवविज्ञान, जैसे कि एंटी-टीएनएफ जेड और एंटी-आईएल-6, सीआईए मॉडल8,9में प्रभावशाली पाए गए हैं।
synovial ऊतक में प्रतिरक्षा प्रणाली की बातचीत का पता लगाने आरए के रोगजनन के साथ जुड़े आणविक तंत्र स्पष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण है। मानव नैदानिक सेटिंग में, एक आम अभ्यास अल्ट्रासाउंड इमेजिंग के मार्गदर्शन में सुई synovial बायोप्सी प्रदर्शन करने के लिए है। पूर्व नैदानिक सेटिंग्स में, murine जोड़ों के छोटे वास्तुकला बायोप्सी प्रक्रियाओं और अधिक कठिन अगर असंभव नहीं बनाता है। हाल ही में, हमने अलग-अलग एंड-पॉइंट को प्रभावित करने और एक संयोजी दृष्टिकोण10में रोग को हल करने के लिए दवाओं के संयोजन का मूल्यांकन करने के लिए murine CIA मॉडल के उपयोग का प्रदर्शन किया। एक क्रायोजेनिक फ्रीजर मिल आधारित pulverization विधि सजातीय ठीक पाउडर में सूजन murine पंजे की प्रक्रिया और आरएनए और प्रोटीन निकालने के लिए बहाव प्रक्रियाओं की स्थापना की नियोजित किया गया था। यह विधि आरएनए और प्रोटीन को एंजाइमी और रासायनिक अपमानजनक प्रक्रियाओं से बचाती है और हमें एकल समरूपनमूना स्रोत के लिए कई विश्लेषणात्मक विधियों को लागू करने में सक्षम बनाती है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
सभी पशु प्रयोगों Janssen अनुसंधान एवं विकास के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) की नीतियों के अनुसार आयोजित किया गया.
1. क्रायोजेनिक फ्रीजर मिल आधारित Pulverization विधि
- सीआईए अध्ययन की समाप्ति पर, 1.5% isoflurane के साथ बलिदान चूहों गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद.
- ऊतक प्रसंस्करण के दिन, सभी उपकरणों (स्पैचुला, पीस शीशियों, आदि) के दिन कम से कम 10 मिनट के लिए सूखी बर्फ पर थर्मल दस्ताने पहनें फ्रीज क्षति से बचने के लिए।
- चित्र 1कमें दर्शाए अनुसार फर रेखा पर कैंची से पिछले पंजे को काटें .
- प्रत्येक पंजा को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, तरल नाइट्रोजन में तुरंत फ्रीज करें, और जमे हुए पंजे को -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें। एक सप्ताह से अधिक समय तक जमे हुए नमूनों को न रखें।
- तरल नाइट्रोजन के साथ फ्रीजर मिल भरें जैसा कि चित्र 1ठ में दिखाया गया है और इसे कम से कम 10 मिनट के लिए बराबर होने दें।
- सूखी बर्फ पर unprocessed नमूना रखें और फ्रीज-थॉव चक्र से बचें।
- एक नीचे स्टील प्लग के साथ पूर्व ठंडा बड़े पॉलीकार्बोनेट पीसने शीशी में एक पिछले पंजा स्थानांतरण, पूर्व ठंडा स्टील प्रभावक डालने और पूर्व ठंडा शीर्ष स्टील प्लग के साथ पॉलीकार्बोनेट पीसने शीशी बंद (चित्र 1सी)।
- तरल के साथ पहले से भरे फ्रीजर मिल में नमूने के साथ बड़े पॉलीकार्बोनेट पीस शीशियों स्थानांतरण और साधन के सामने पाया रबर clasp के साथ ढक्कन बंद करें।
- नमूने 1 मिनट के लिए तरल नाइट्रोजन में ठंडा करते हैं।
- प्रति सेकंड 10 चक्र के साथ 1 मिनट के कार्यक्रम के लिए फ्रीजर मिल सेट और शुरू बटन दबाएँ. अपने चक्र को पूरा करने के लिए फ्रीजर मिल के लिए प्रतीक्षा करें।
नोट: इस्पात प्रभावक आगे और पीछे चलता है के रूप में मशीन एक ढोल ध्वनि बनाता है। सुनवाई हानि से बचने के लिए कान प्लग का प्रयोग करें. - फ्रीजर मिल का ढक्कन खोलो, बड़े पॉलीकार्बोनेट पीस नेशीश को बाहर निकालें और इसे एक चिमटा में रखें जैसा कि चित्र 1डीमें दर्शायागया है। पॉलीकार्बोनेट ट्यूब से बाहर स्टील प्लग स्लाइड जब तक काले संभाल पर नीचे दबाव रखकर शीर्ष स्टील प्लग निकालें.
- सूखी बर्फ पर खोला बड़े पॉलीकार्बोनेट पीसने शीशी स्थानांतरण। पूर्व ठंडा forceps के साथ इस्पात प्रभावक निकालें.
- जमे हुए पाउडर को पूर्व-चिल्ड 50 एमएल शंकु ट्यूब में स्थानांतरित करें।
- वजन 30-50 एक टार्ड जमे हुए 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में आरएनए निष्कर्षण के लिए और प्रोटीन निष्कर्षण के लिए जमे हुए पाउडर के 100-200 मिलीग्राम में जमे हुए पाउडर की मिलीग्राम।
नोट: जमे हुए पाउडर सफेद या हल्के गुलाबी ठीक रेत की तरह दिखना चाहिए जैसा कि चित्र 1ई में दर्शाया गयाहै. - -80 डिग्री सेल्सियस पर चूर्णित नमूनों को स्टोर करें और 24 घंटे के भीतर आरएनए और प्रोटीन आइसोलेशन पर जाएं।
2. आरएनए निष्कर्षण
- आरएलटी बफर के प्रति 1 एमएल के अनुसार $-मेरकैप्टोथेनोल (जेड-एमई) का 10 डिग्री सेल्सियस जोड़ें।
- ऊतक के 23.3 एमएल/मिलीग्राम के अनुपात के संगत RLT बफर की मात्रा की गणना करें और जमे हुए पाउडर के साथ ट्यूब में RLT बफर की उपयुक्त मात्रा को $-ME के साथ जोड़ें। यह अनुपात अनुभवजन्य रूप से माउस पंजे के लिए आदर्श होने के लिए निर्धारित किया गया था।
- भंवर 10 s के लिए 3,000 RPM पर नमूना.
- ऊपर और नीचे 10 बार एक 1 एमएल पाइपेटर के साथ तेजी से pipeting द्वारा अच्छी तरह से मिक्स.
- भंवर नमूना फिर से 3,000 RPM पर 20 s के लिए.
- 2 मिनट के लिए 13,000 x ग्राम पर ट्यूब सेंट्रीफ्यूज।
- एक ताजा ट्यूब के लिए supernatants के 700 $L स्थानांतरण और 70% इथेनॉल के 700 $L जोड़ें।
नोट: यदि ]lt;700 $L ट्यूब में है, यह आगे बढ़ना स्वीकार्य है, अभी भी 70% इथेनॉल के बराबर मात्रा जोड़ने. - नमूने का 700 डिग्री सेल्सियस आरएनए शोधन स्तंभ पर लोड करें।
- 30 s के लिए 10,000 x ग्राम पर ट्यूब सेंट्रीफ्यूज.
- प्रवाह के माध्यम से छोड़ें और RNeasy स्तंभ के लिए नमूने के शेष भाग लोड।
- 30 s के लिए 10,000 x ग्राम पर ट्यूब सेंट्रीफ्यूज.
- प्रवाह को त्यागें और 30 s के लिए $10,000 x g के सेंट्रीफ्यूगेशन के साथ RW1 बफर के 700 $L जोड़कर कॉलम को धो लें। यदि प्रदर्शन विकल्प DNASE पाचन, RW1 के 350 $L DNASE उपचार से पहले जोड़ा जाता है. और एक अतिरिक्त 350 $L RW1 के DNASE उपचार के बाद जोड़ा जाता है.
- वैकल्पिक) एक DNase पाचन कदम प्रदर्शन निर्माता के निर्देशों का पालन करें.
- आरपीई बफर के 500 डिग्री सेल्सियस जोड़कर ट्यूब को दो बार धो लें और उसके बाद 30 s के लिए $10,000 x g पर सेंट्रीफ्यूगेशन किया गया। हर बार प्रवाह को त्यागें।
- 2 मिनट के लिए $ 10,000 x ग्राम पर अपकेंद्रण द्वारा कॉलम सूखी.
- एल्यूट आरएनए 2 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूगेशन के साथ 50 डिग्री एल पानी जोड़कर, के माध्यम से प्रवाह एकत्र करें और एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
- आगे के विश्लेषण से पहले शोधकर्ता की पसंद की विधि का उपयोग करके आरएनए की मात्रा निर्धारित करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
3. प्रोटीन निष्कर्षण
- सेल संस्कृति ग्रेड पानी का उपयोग कर 1x सेल lysis शेयर समाधान में 10x सेल lysis शेयर समाधान को पतला.
- एक 100x protease अवरोध करनेवाला शेयर बनाने के लिए पानी की 1 एमएल के साथ Protease अवरोधक कॉकटेल सेट मैं पुनर्गठन।
- एक 1x अंतिम स्टॉक समाधान बनाने के लिए 1x सेल lysis के 9.9 एमएल करने के लिए प्रोटीज़ अवरोधक के 100 $L जोड़ें।
- 4 डिग्री सेल्सियस बर्फ ठंड 1x सेल Lysis बफर प्रति मिलीग्राम ऊतक पाउडर जोड़ें (उदा., 800 $L lysis बफर के लिए 200 ऊतक पाउडर की मिलीग्राम).
- ट्यूब के लिए एक 5 मिमी स्टेनलेस स्टील मनका जोड़ें.
- 60 s. के लिए 3,000 RPM पर ट्यूब भंवर गीला बर्फ के लिए ट्यूब स्थानांतरण और अगले नमूने के लिए जारी है.
- एक बॉक्स में सभी नमूना ट्यूब ों रखें और 1,000 RPM, 1 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रॉकर पर अपकेंद्रित्र बॉक्स हिला।
नोट: शोधकर्ताओं ने पाया जा सकता है कि बॉक्स ऊर्ध्वाधर रखने से मनका के साथ बेहतर मिश्रण की सुविधा मिल सकती है। - 15 मिनट के लिए 10,000 x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें।
- एक ताजा ट्यूब में supernatants स्थानांतरण और शीर्ष पर वसा परत से बचें.
- कुल प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण. प्रोटीन lysate के 10 से 30 गुना कमजोर पड़ने एक बीसीए परीक्षण के लिए आदर्श होते हैं.
- अलीकोट नमूना 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में और आगे के विश्लेषण से पहले -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
यहाँ, हम चित्र 2एमें सीआईए चूहों के सामने पंजे से निकाले आरएनए के एक प्रतिनिधि जेल छवि दृश्य दिखा। 28S rRNA और 18S rRNA बैंड से संकेत मिलता है कि सभी नमूनों बरकरार आरएनए की पर्याप्त मात्रा है. इसके बाद, हम चित्र 2खमें प्रोटीन बीसीए विश्लेषण के आधार पर कुल प्रोटीन सांद्रताओं का एक प्रतिनिधि तितर बितर आलेख दिखाते हैं। विभिन्न उपचार के तहत भोले चूहों, सीआईए चूहों या सीआईए चूहों से कुल प्रोटीन सांद्रता समूहों में तुलनीय हैं. प्रोटीन निकालने में सूजन साइटोकिन्स और chemokines की सांद्रता निर्धारित करने के लिए, Luminex विश्लेषण आयोजित किए गए. हम चित्र 2गमें सामान्यीकृत साइटोकिन्स और कीमोकिन्स (पीजी/मिलीग्राम कुल प्रोटीन) की सांद्रता के एक प्रतिनिधि तितर बितर आलेख दिखाते हैं। भोले चूहों की तुलना में, कई cytokines सीआईए चूहों और विरोधी IL17A एंटीबॉडी के साथ उपचार में ऊंचा कर रहे हैं काफी कई cytokines के उत्पादन को रोकता है. सीआईए और उपचार से संबंधित प्रभावों में ट्रांसक्रिप्टोम परिवर्तनों का मूल्यांकन करने के लिए, माइक्रोरेयर विश्लेषण किया गया था। हम यह दर्शाते हैं कि चित्र 2ड में भोले चूहों की तुलना में सीआईए चूहों में जीनों के एक प्रतिनिधि हीटमैप प्लॉट में काफी वृद्धि हुईहै.
चित्रा 1: उपकरण murine पंजे pulverize करने के लिए आवश्यक है। (ए) सीआईए या भोले चूहों से सूजन या uninflamed पंजे. (बी) तरल नाइट्रोजन देवर फ्रीजर मिल के स्टेनलेस स्टील स्नान को भरने के लिए इस्तेमाल किया। (सी) इकट्ठे फ्रीजर मिल ट्यूब सेट. (डी) फ्रीजर मिल ट्यूब खोलने वाला। (ई) murine पंजे से pulverized ऊतक. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: pulverized murine पंजे से प्रोटीन और आरएनए के विश्लेषण पर प्रतिनिधि डेटा. ((ए) आरएनए अखंडता के जेल छवि दृश्य। (बी)विभिन्न समूहों से कुल प्रोटीन सांद्रता। (सी) विभिन्न समूहों से चेमोकीन और साइटोकीन अभिव्यक्ति (लुमिनेक्स)। (घ)विभिन्न उपचार समूहों से माइक्रोरेरे विश्लेषण का पदानुक्रमिक गुच्छन हीटमैप। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
हालांकि वहाँ मजबूत वैज्ञानिक तर्क synovial ऊतकों में आणविक रास्ते का मूल्यांकन करने के लिए है, murine सीआईए मॉडल की प्रतिरक्षा रूपरेखा पर कई रिपोर्टों परिधीय रक्त पर ध्यान केंद्रित किया गया, जबकि प्रोटीन और प्रोटीन और प्रोटीन और आरएनए विश्लेषण डेटा सूजन पंजे के बजाय सीमित हैं. इस पूर्वाग्रह के लिए कई संभावित कारण हैं: murine टखने जोड़ों से बड़ा नहीं कर रहे हैं $2 सेमी; प्रभावित क्षेत्रों में त्वचा, हड्डी और संयोजी ऊतक होते हैं जो अक्सर ऊतक ग्राइंडर, मूसल और मोर्टार, सिलिका मनका व्यवधान, ट्रिटेशन या एंजाइमी पाचन जैसे पारंपरिक तरीकों का उपयोग करके homogenize करने के लिए मुश्किल होते हैं। इन तरीकों आम तौर पर अधूरा homogenization में परिणाम, कम प्रोटीन या आरएनए उपज, या proteolytic और न्यूक्लिक एसिड गिरावट के कारण असंगत गुणवत्ता. यहां वर्णित मजबूत विधि एक समान नमूने से बीमारी के आणविक हस्ताक्षर स्थापित करने के लिए डाउनस्ट्रीम प्रोटीओमिक और ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइलिंग प्रयासों को सक्षम करने के लिए एक सजातीय चूर्णीकृत जमे हुए पाउडर उत्पन्न करने के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया प्रदान करती है स्रोत.
इस विधि को करते समय कई महत्वपूर्ण चरणों पर विचार किया जाना चाहिए। सबसे पहले, ऊतक फसल के दौरान फर लाइन पर murine पंजे काटा जाना चाहिए और बालों की बड़ी मात्रा से बचा जाना चाहिए। अत्यधिक बाल आरएनए निष्कर्षण के दौरान कॉलम रोकना और प्रोटीन निष्कर्षण के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं। दूसरे, ट्यूब, संदंश और spatulas प्रक्रिया के दौरान सूखी बर्फ पर रखा जाना चाहिए क्योंकि ऊतक पाउडर में ऊंचा तापमान जल्दी से अक्रिस्टलीय "मूड" में सामग्री बदल जाएगा और प्रोटीन और आरएनए की अखंडता समझौता किया जाएगा. तीसरे, प्रोटीन या आरएनए निष्कर्षण के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले ऊतक पाउडर की मात्रा सावधानी से अनुकूलित की जानी चाहिए। अधिक ऊतक पाउडर हमेशा उच्च उपज प्रदान नहीं कर सकते हैं, लेकिन आरएनए अलगाव कॉलम clogging सहित बहाव प्रसंस्करण में अतिरिक्त समस्याओं का कारण बन सकता है, DNase/डीएनए अनुपात बदलने (यदि इस कदम कार्यरत है) पूरा डीएनए गिरावट को रोकने के लिए. अंत में, प्रोटीन और आरएनए इनपुट का सामान्यीकरण कार्यप्रवाह और डेटा विश्लेषण का एक अभिन्न हिस्सा होना चाहिए। ऊतक लोड में भिन्नता काफी सापेक्ष प्रोटीन और आरएनए के स्तर में परिवर्तन मुखौटा कर सकते हैं. कुल प्रोटीन या कुल आरएनए के अलावा, हाउसकीपिंग जीन की अभिव्यक्ति को सामान्यीकरण के लिए एंकर के रूप में भी माना जा सकता है।
व्यापक परीक्षण और त्रुटि प्रक्रिया के माध्यम से, हम इस विधि के पहली बार उपयोगकर्ताओं के लिए कुछ संभावित अक्सर मुद्दों की पहचान की है. आरएनए की कम उपज हो सकती है। यह अक्सर बहुत अधिक ऊतक निकालने के साथ स्तंभ overloading का एक परिणाम है. प्रति कॉलम ऊतक की मात्रा और RLT/powder के अनुपात कुशल आरएनए अलगाव के लिए महत्वपूर्ण हैं। हमने पाया है कि कुछ वाणिज्यिक 96 अच्छी तरह से निष्कर्षण किट इस प्रक्रिया के लिए काम नहीं कर सकते के रूप में नमूने एक बराबर दर पर स्तंभ के माध्यम से स्पिन नहीं होगा, इस प्रकार बहाव धोने और elution कदम में इन नमूनों समझौता. Luminex विश्लेषण में बीसीए विश्लेषण और साइटोकिन सांद्रता में प्रोटीन एकाग्रता में उच्च परिवर्तनशीलता हो सकती है। यदि बीसीए या Luminex प्रक्रिया के साथ कोई समस्या नहीं हैं, यह आम तौर पर वसा या प्रोटीन निकालने में अन्य contaminants के कारण होता है. प्रोटीन निष्कर्षण के लिए कटाई करते समय माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों के तल पर शीर्ष या अघुलनशील पदार्थ में वसा परत से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। यदि आवश्यक हो, स्पिन दोहराने और बहाव विश्लेषण के लिए supernatants इकट्ठा.
चूंकि इस विधि में एक विशेष क्रायोजेनिक फ्रीजर मिल और सूखी बर्फ और तरल नाइट्रोजन की बड़ी मात्रा शामिल है, अतिरिक्त सुरक्षा उपायों पर विचार किया जाना चाहिए। सुरक्षा चश्मा, प्रयोगशाला कोट और क्रायोजेनिक दस्ताने सहित उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण हमेशा विस्फोट के कारण संभावित फ्रीज जलने और चोट को रोकने के लिए पहना जाना चाहिए। एयरोसोल के उत्पादन को भी कम से कम किया जाना चाहिए और वेंटेड बैलेंस बाड़ों का उपयोग करने की सलाह दी जाती है। अंत में, पशु ऊतकों से निपटने के किसी भी अन्य प्रोटोकॉल के समान, देखभाल ठीक से सभी अप्रयुक्त ऊतक नमूनों के निपटान के लिए लिया जाना चाहिए, जबकि पुन: प्रयोज्य ट्यूबों सफाई से पहले decontaminated होने की जरूरत है.
जबकि विधि पारंपरिक तरीकों पर कई फायदे हैं, यह अभी भी कुछ सीमाओं बंदरगाह. एक murine पूरे पंजा से transcriptome प्रोफ़ाइल काफी मानव synovial बायोप्सी से transcriptome प्रोफ़ाइल के साथ ओवरलैप (डेटा नहीं दिखाया). मांसपेशियों, त्वचा और अस्थि मज्जा से अतिरिक्त MRNA synovial ऊतक से संकेतों को पतला कर सकता है. एक वैकल्पिक समाधान लेजर microdissection, जो OCT एम्बेडेड माउस जोड़ों पर किया जा सकता है के माध्यम से murine synovial ऊतक इकट्ठा करने के लिए है. हालांकि, कम थ्रूपुट और ऊतक की अपेक्षाकृत छोटी मात्रा लेजर microdissection के लिए व्यापक आवेदन को सीमित करता है। इसके अतिरिक्त, यहां तक कि महत्वपूर्ण स्वचालन के साथ, इस विधि अभी भी काफी श्रम गहन है. यह 3-4 जांचकर्ताओं की मदद से 30-60 नमूनों की प्रक्रिया के लिए कम से कम 8 एच लेता है। अंत में, इस विधि के लिए बड़ी मात्रा में तरल नाइट्रोजन ($10-15 एल 30-60 नमूने संसाधित करने के लिए) की आवश्यकता होती है।
पिछले विधि विवरण में, प्रोटीओमिक और ट्रांसक्रिप्शनल एंडपॉइंट विश्लेषणों का मूल्यांकन प्रदर्शित किया गया था। हालांकि, अतिरिक्त समापन बिंदु, जैसे लिपिडोमिक, चयापचय और छोटे आरएनए प्रोफाइलिंग व्यापक गठिया अनुसंधान समुदाय के लिए ब्याज की हो सकती है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखक बीजे, एसएच, एमएल, आरएम, एमएल, टू और एफएस जेन्सेन रिसर्च एंड डेवलपमेंट इंक के कर्मचारी हैं और मूल कंपनी, जॉनसन एंड जॉनसन, इंक में शेयरधारक हैं।
Acknowledgments
लेखक इस पांडुलिपि और नवीन राव और जेनिफर टाउन की महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए Edith Janssen इस पांडुलिपि के प्रकाशन के समर्थन के लिए धन्यवाद देना चाहता हूँ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mm stainless steel bead | Qiagen | 69989 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Sample reducing agent that inhibits RNASE enzymes |
| Bioanalyzer Kit | Agilent | 5067-1511 | RNA qualification kit |
| b-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Cell Culture Grade Water | Corning | 25-055-CI | Water |
| Cell lysis stock solution | Cell Signaling | 9803 | |
| Eppendorf Tube | Eppendorf | 22363204 | Microfuge tubes |
| Eppendorf tube centrifuge box | Nalgene | 5055 | Box for holding eppendorf tubes in horizontal tube arrangement |
| Everlast 247 Variable Speed Rocker | Benchmark Scientific | BR5000 | |
| Freezer Mill | Spex Sample Prep | 6875 | Freezer/Mill for processing paws into pulverized powder |
| Grinding Vial | Spex Sample Prep | 6801 | Polycarbonate vial for processing paws into pulverized powder |
| Pierce BCA kit | Pierce | 23225 | Kit for Total Protein Quantification |
| Protease Inhibitor Cocktail set 1 | Calbiochem | 539131 | Protease Inhibitors |
| Protein BCA Kit | Pierce | 23225 | |
| Quantigene Kit | Thermofisher | QP1013 | bDNA analysis Kit |
| Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | Centrifugation |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | RNA extraction buffer |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | including RNeasy column, RLT Buffer and RW1 Buffer |
| Shaker | Benchmark Scientific | BR5000 | Rocker/Shaker |
| Spatula | VWR | 10806-412 | Spatula for powder transfer |
| Stainless Steel Bead | Qiagen | 69989 | Bead for mixing during protein extraction |
| Tube Extractor | Spex Sample Prep | 6884 | Extractor for removing the top of grinding vial |
| Vortexer | VWR | 10153-838 | Sample mixing |
References
- Firestein, G. S. Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Journal of Clinical Rheumatology. 11, S39-S44 (2005).
- McInnes, I. B., Schett, G. The pathogenesis of rheumatoid arthritis. New England Journal of Medicine. 365, 2205-2219 (2011).
- Ahlqvist, E., Hultqvist, M., Holmdahl, R. The value of animal models in predicting genetic susceptibility to complex diseases such as rheumatoid arthritis. Arthritis Research and Therapy. 11, 226 (2009).
- David, C. S., Taneja, V. Role of major histocompatibility complex genes in murine collagen-induced arthritis: a model for human rheumatoid arthritis. American Journal of the Medical Sciences. 327, 180-187 (2004).
- Tarkowski, A., Holmdahl, R., Klareskog, L. Rheumatoid factors in mice. Monographs in Allergy. 26, 214-229 (1989).
- Schurgers, E., Billiau, A., Matthys, P. Collagen-induced arthritis as an animal model for rheumatoid arthritis: focus on interferon-gamma. Journal of Interferon & Cytokine Research. 31, 917-926 (2011).
- Joosten, L. A., Helsen, M. M., van de Loo, F. A., van den Berg, W. B. Anticytokine treatment of established type II collagen-induced arthritis in DBA/1 mice. A comparative study using anti-TNF alpha anti-IL-1 alpha/beta, and IL-1Ra. Arthritis & Rheumatology. 39, 797-809 (1996).
- Asquith, D. L., Miller, A. M., McInnes, I. B., Liew, F. Y. Animal models of rheumatoid arthritis. European Journal of Immunology. 39, 2040-2044 (2009).
- Williams, R. O. Collagen-induced arthritis as a model for rheumatoid arthritis. Methods in Molecular Medicine. 98, 207-216 (2004).
- Shen, F., et al. Combined Blockade of TNF-alpha and IL-17A Alleviates Progression of Collagen-Induced Arthritis without Causing Serious Infections in Mice. Journal of Immunology. 202, 2017-2026 (2019).
