En Cryo-pulverisering protokoll för bearbetning mus tassar att utvärdera molekylära vägar av vävnad inflammation i en kollagen inducerad artrit modell

Summary

En kryogen pulveriseringsmetod för att bearbeta murina tassar med hjälp av ett flytande kväve frys kvarn utvecklades för att förbättra avkastningen och kvaliteten på RNA eller protein som utvinns ur vävnaderna och möjliggöra analys av molekylära profiler i samband med inflammatoriska Svaren.

Abstract

Profilering molekylära förändringar i lokala vävnader är avgörande för att förstå mekanismen (s) åtgärder av terapeutiska kandidater in vivo. Inom området artrit forskning, många studier är inriktade på inflammerade leder som består av en komplex blandning av ben, brosk, muskler, stromaceller och immunceller. Här har vi etablerat en pålitlig och robust mekanisk metod för att störa inflammerade mus tassar i homogena pulveriserade prover i en kryogeniskt kontrollerad miljö. Protein och RNA-lysater bearbetades för att möjliggöra proteomiska och transkriptionella endpoints och molekylär karakterisering av relevanta sjukdoms vägar i lokal vävnad.

Introduction

Reumatoid artrit (RA) är en kronisk systemisk inflammatorisk sjukdom med ihållande symmetrisk synovit i lederna och extra artikulär inblandning av organ såsom hud, hjärta, lungor och ögon¹. Även om de systemiska manifestationerna av immunförsvaret är uppenbara hos mänskliga patienter, en av kännetecknen för ra patologi är infiltration av immunceller i led vävnad och spridning av LED fibroblast celler².

Liknar Human ra, mus kollagen inducerad artrit (CIA) modell framkallar stark vävnad inflammation med aktiva immunsvar i led vävnader och systemiska fack. Känsligheten hos olika mus stammar till CIA-modell länkar till större histocompatibility complex (MHC) haplotyp och antigen specifik T-cell och B-cellinteraktioner^3,4. Dessutom, många patogena vägar i human ra, inklusive autoantikropp produktion, immunkomplex deposition, myeloisk cell aktivering, polyartikulär manifestationer och pannus formation med LED immun infiltration, är också tydligt i denna modell ^5,6. Utredare har anställt denna väletablerade CIA-modell för att undersöka effekterna av anti-inflammatoriska cytokin behandlingar⁷. Många biologiska läkemedel som godkänts för autoimmuna eller inflammatoriska sjukdomar, såsom anti-TNFα och anti-Il-6, befinns vara effektiva i CIA-modellen^8,9.

Profilering av samspelet mellan immunsystemet i led vävnad är avgörande för att belysa molekylära mekanismer i samband med patogenesen av ra. I den humana kliniska inställningen, en vanlig metod är att utföra nål LED biopsier under ledning av ultraljud Imaging. I de prekliniska inställningarna, den mindre arkitekturen i murina lederna gör biopsi förfaranden mycket svårare om inte omöjligt. Nyligen visade vi utnyttjandet av murina CIA-modellen för att utvärdera kombinationer av läkemedel för att påverka olika slutpunkter och lösa sjukdomen i en kombinatorisk strategi¹⁰. En kryogen fryskvarn-baserad pulverisering metod användes för att bearbeta inflammerade murina tassar i homogena fina pulver och etablerade nedströms processer för att extrahera RNA och proteiner. Denna metod skyddar RNA och protein från enzymatiska och kemiska degrativa processer och gör det möjligt för oss att tillämpa flera analytiska metoder på en enda homogeniserad provkälla.

Protocol

Alla djurförsök utfördes i enlighet med den politik som bedrivs av den institutionella djur omsorgs-och användnings kommittén (IACUC) i Janssen R & D.

1. kryogen Fryskvarn-baserad Pulveriseringsmetod

1. Vid uppsägning av CIA-studien, offra möss med 1,5% isofluran följt av cervikal dislokation.
2. På dagen för vävnads behandling, pre-Chill alla instrument (spatlar, slipning flaskor, etc.) på torris i minst 10 min. Använd Termohandskar för att undvika frysskador.
3. Skär Hind tassar med en sax på päls linjen som avbildas i figur 1a.
4. Överför varje tass till en 1,5 mL microcentrifug tub, snap frysa i flytande kväve omedelbart, och förvara frysta tassar vid-80 ° c. Förvara inte prover frysta i mer än en vecka.
5. Fyll frys kvarn med flytande kväve som visas i figur 1B och låt det jämvikt i minst 10 min.
6. Håll obearbetat prov på torris och Undvik frys-Tina cykler.
7. Överför en baktass till förkyld stor polykarbonatslipflaska med en botten stål plugg, sätt in den förkylda stål Impaktorn och Stäng injektionsflaskan med polykarbonatslipning med den förkylda topp stål pluggen (figur 1C).
8. Överför stora polykarbonatslipflaskor med proverna i fryskvarnen som är förfyllda med vätska och Stäng locket med gummi spänne som finns på framsidan av instrumentet.
9. Låt proverna svalna i flytande kväve i 1 minut.
10. Ställ in fryskvarnen till 1 minut program med 10 cykler per sekund och tryck på Start-knappen. Vänta tills fryskvarnen har slutfört sin cykel.
    Anmärkning: Maskinen gör ett trumma ljud som stål kollisionsblocket rör sig fram och tillbaka. Använd öronproppar för att undvika hörselnedsättning.
11. Öppna locket på frysen, ta ut den stora injektionsflaskan med polykarbonatslipning och placera den i en extraktionsapparat som avbildas i figur 1D. Ta bort den övre stål pluggen genom att placera tryck nedåt på det svarta handtaget tills stål pluggen glider ut ur polykarbonatröret.
12. Överför den öppna stora polykarbonatslipflaskan på torris. Ta bort stål impacorn med förkylda pinkoppar.
13. Överför det frysta pulvret till förkyld 50 mL koniskt rör.
14. Vikt 30-50 mg fryst pulver till ett tarerats fryst 1,5 ml microcentrifug rör för RNA extraktion och 100-200 mg fryst pulver för protein utvinning.
    Anmärkning: Det frysta pulvret ska se ut som vit eller ljusrosa fin sand som avbildas i figur 1E.
15. Förvara pulveriserade prover vid-80 ° c och fortsätt till RNA och proteinisoleringar inom 24 timmar.

2. RNA-extraktion

1. Tillsätt 10 μL β-merkaptoetanol (β-ME) per 1 mL RLT-buffert.
2. Beräkna volymen av RLT-buffert som motsvarar ett förhållande på 23,3 mL/mg vävnad och Tillsätt lämplig volym RLT buffert med β-ME till röret med fryst pulver. Detta förhållande var empiriskt fast beslutna att vara idealisk för mus tassar.
3. Vortexblanda provet med 3 000 RPM i 10 s.
4. Blanda väl genom att Pipettera upp och ned 10 gånger kraftigt med en 1 mL pipettor.
5. Vortex provet igen vid 3 000 RPM för 20 s.
6. Centrifugera röret vid 13 000 x g i 2 min.
7. Överför 700 μL av supernatanterna till ett nytt rör och tillsätt 700 μL 70% etanol.
   Anmärkning: Om < 700 μL är i röret, är det acceptabelt att fortsätta, fortfarande lägga motsvarande volym 70% etanol.
8. Fyll 700 μL av provet på en RNA-renings kolumn.
9. Centrifugera röret med ≥ 10 000 x g i 30 s.
10. Kassera flödet och Läs in den resterande delen av provet i kolumnen RNeasy.
11. Centrifugera röret med ≥ 10 000 x g i 30 s.
12. Kassera flödet genom och Tvätta kolonnen genom att tillsätta 700 μL RW1 buffert med centrifugering på ≥ 10 000 x g i 30 s. Om du utför alternativ DNASE matsmältning, 350 μL av RW1 tillsätts före DNASE behandling.  Och ytterligare 350 μL av RW1 tillsätts efter behandling med DNASE.
13. Valfritt) utför en DASE-digestionssteg följ tillverkarens instruktioner.
14. Tvätta röret två gånger genom att tillsätta 500 μL RPE-buffert följt av centrifugering vid ≥ 10 000 x g för 30 s. Kassera flödet genom varje gång.
15. Torka kolonnen genom centrifugering vid ≥ 10 000 x g i 2 min.
16. Eluera RNA genom att tillsätta 50 μL vatten med centrifugering vid ≥ 10 000 x g i 2 min. samla flödet genom och överför till ett nytt 1,5 ml-rör.
17. Bestäm mängden RNA med hjälp av forskarens metod att välja och förvara vid-80 ° c innan vidare analys.

3. protein utvinning

1. Späd 10X cell Lys stamlösning i 1x cell Lys stamlösning med hjälp av cellkultur grade vatten.
2. Rekonstituera proteashämmaren cocktail set I med 1 mL vatten för att göra en 100x proteashämmare lager.
3. Tillsätt 100 μL proteashämmare till 9,9 mL 1x Celllys för att göra en 1x slutlig stamlösning.
4. Tillsätt 4 μL iskall 1x Celllysbuffert per mg vävnads pulver (t. ex. 800 μL lyseringsbuffert till 200 mg vävnads pulver).
5. Tillsätt en 5 mm rostfrittstål pärla till röret.
6. Vortex röret vid 3 000 RPM för 60 s. överför röret till våt is och fortsätt till nästa prov.
7. Placera alla provrör i en låda och skaka centrifugerboxen på en rocker vid 1 000 RPM, 4 ° c i 1 h.
   Anmärkning: Forskare kan finna att placera rutan vertikala kan underlätta bättre blandning med pärlan.
8. Centrifugera rören vid 10 000 x g och 4 ° c i 15 min.
9. Överför supernatanterna till ett nytt rör och Undvik fettlagret på toppen.
10. Bestämma den totala protein koncentrationen. 10 till 30-faldig utspädningar av proteinlysat är idealiska för ett BCA-test.
11. Alikvot provet i 1,5 mL mikrocentrifugrör och förvara vid-80 ° c före vidare analys.

Representative Results

Här visar vi en representativ gel bild visualisering av RNA som utvinns från främre tassar av CIA-möss i figur 2a. Den 28S rRNA och 18S rRNA bandet indikerar alla prover har tillräcklig mängd intakt RNA. Därefter visar vi ett representativt spridningsdiagram av totala proteinkoncentrationer baserade på PROTEINBCA-analys i figur 2B. Totala proteinkoncentrationer från naiva möss, CIA-möss eller CIA-möss under olika behandlingar är jämförbara mellan grupper. För att bestämma koncentrationerna av inflammatoriska cytokiner och chemokiner i protein extraktet utfördes Luminex-analyser. Vi visar ett representativt spridningsdiagram av koncentrationerna av normaliserade cytokiner och chemokiner (PG/mg totalt protein) i figur 2C. Jämfört med naiva möss är flera cytokiner förhöjda i CIA-möss och behandling med anti-IL17A antikroppar hämmar signifikant produktionen av flera cytokiner. För att utvärdera transkripome förändringar i CIA och behandlingsrelaterade effekter, Microarray analys utfördes. Vi visar en representativ heatmap-Plot av gener ökade signifikant hos CIA-möss jämfört med naiva möss i figur 2D.

Figur 1: utrustning som behövs för att pulverisera murina tassar. A) inflammerade eller oinflammerade tassar från CIA eller naiva möss. B) flytande kväve Dewar som används för att fylla fryskvarnen i rostfrittstål. (C) monterade rör set för frys fabrik. D) rör öppnare för frys fabrik. (E) pulveriserad vävnad från murina tassar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: representativa data om analys av protein och RNA från pulveriserade murina tassar. (A) gel bild visualisering av RNA-integritet. B) totala proteinkoncentrationer från olika grupper. C) Chemokine-och Cytokinuttryck (Luminex) från olika grupper. (D) hierarkisk klustring heatmap av Microarray analys från olika behandlingsgrupper. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Även om det finns starka vetenskapliga motiv för att utvärdera molekylära vägar i led vävnader, många rapporter om immun profilering av murina CIA-modellen var inriktad på perifert blod, medan protein och RNA analysdata av inflammerade tassar är ganska begränsade. Det finns flera möjliga orsaker till denna bias: murina vristfogar är inte större än ~ 2 cm; de drabbade områdena består av hud, ben och bindväv som ofta är svåra att homogenisera med traditionella metoder som Tissue slipmaskiner, mortelstöt och murbruk, kisel pärla störningar, sönderdelning eller enzymatisk matsmältning. Dessa metoder resulterar vanligen i ofullständig homogenisering, låg protein-eller RNA-avkastning, eller inkonsekvent kvalitet på grund av proteolytisk och nukleinsyrafdegradering. Den robusta metod som beskrivs häri ger ett detaljerat förfarande för att generera ett homogent pulveriserat fryst pulver för att möjliggöra nedströms proteomiska och transkriptionell reglering profilering insatser för att fastställa molekylära signaturer av sjukdom från ett enda enhetligt prov Källkod.

Flera kritiska steg bör övervägas när du utför den här metoden. För det första bör murina tassar skäras vid päls linjen under vävnads skörd och stora mängder hår bör undvikas. Överdriven hår kan täppa kolumner under RNA-extraktion och störa protein utvinning. För det andra, rör, pinkoppar och spatlar bör hållas på torris under hela förfarandet eftersom förhöjd temperatur i vävnad pulver kommer snabbt att förvandla materialet till amorfa "lera" och integriteten av protein och RNA kommer att äventyras. För det tredje bör mängden vävnads pulver som används för protein-eller RNA-extraktion noggrant optimeras. Mer vävnads pulver kan inte alltid ge högre avkastning, men kan orsaka ytterligare problem i nedströms bearbetning inklusive igensättning RNA isolering kolumner, ändra DNase/DNA-kvoten (om detta steg är anställd) för att förhindra fullständig DNA-nedbrytning. Slutligen bör normalisering av protein-och RNA-indata vara en integrerad del av arbetsflödet och dataanalysen. Variationer i vävnads belastningen kan avsevärt maskera förändringar i relativa protein-och RNA-nivåer. Förutom totalt protein eller totalt RNA, uttryck av städning gener kan också betraktas som ankare för normalisering.

Genom omfattande försök och fel process, har vi identifierat några potentiella frekventa problem för första gången användare av denna metod. Det kan finnas låg avkastning på RNA. Detta är ofta ett resultat av överbelastning av kolonnen med för mycket vävnads extrakt. Mängden vävnad per kolonn och förhållandet mellan RLT/pulver är avgörande för effektiva RNA-isoleringar. Vi har funnit att vissa kommersiella 96 väl utvinning Kit kanske inte fungerar för denna process som proverna inte kommer att snurra genom kolonnen i motsvarande takt, vilket äventyrar dessa prover i efterföljande tvättning och eluering steg. Det kan finnas hög variation i protein koncentrationen i BCA analys och cytokinkoncentrationer i Luminex analys. Om det inte finns några problem med BCA eller Luminex processen, det är vanligtvis orsakas av fett eller andra föroreningar i protein extraktet. Det är viktigt att undvika fettskiktet på toppen eller olöslig materia på botten av mikrocentrifug rören när skörd för protein utvinning. Om det behövs upprepar du snurrande och samlar samman supernatanterna för nedströms analys.

Eftersom denna metod omfattar en specialiserad kryogen frys kvarn och stora mängder torris och flytande kväve, bör ytterligare säkerhetsåtgärder övervägas. Ordentlig personlig skyddsutrustning inklusive skyddsglasögon, labb kappor och kryogena handskar ska alltid bäras för att förhindra eventuella frostskador och skador på grund av explosion. Generering av aerosoler bör också minimeras och användning av ventilerade balans höljen rekommenderas. Slutligen, i likhet med andra protokoll som hanterar djurvävnader, bör försiktighet iakttas för att korrekt avyttra alla oanvända vävnadsprover, medan återanvändbara rör måste dekontamineras före rengöring.

Medan metoden har många fördelar jämfört med konventionella metoder, hamnar det fortfarande vissa begränsningar. Den transkriptome profil från en murina hela Paw överlappar avsevärt med transkriptome profil från mänskliga LED biopsi (data som inte visas). Ytterligare mRNA från muskler, hud och benmärg kan späda ut signalerna från LED vävnad. En alternativ lösning är att samla in murina LED vävnad genom laser microdissection, som kan utföras på Oct inbäddade mus fogar. Men låg genomströmning och relativt liten mängd vävnad begränsar den breda tillämpningen för laser microdissection. Dessutom, även med betydande automatisering, är denna metod fortfarande ganska arbetsintensiva. Det tar minst 8 h att bearbeta 30-60 prover med hjälp av 3-4 utredare. Slutligen, denna metod kräver stora mängder flytande kväve (~ 10-15 L för bearbetning 30-60 prover).

I den föregående metodbeskrivningen visades utvärderingen av proteomiska och transkriptionella Endpoint-analyser. Emellertid, ytterligare Endpoint, såsom lipidomic, metabolomik och små RNA profilering kan vara av intresse för den bredare artrit forskarsamhället.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mm stainless steel bead	Qiagen	69989
beta-mercaptoethanol	Sigma	M6250	Sample reducing agent that inhibits RNASE enzymes
Bioanalyzer Kit	Agilent	5067-1511	RNA qualification kit
b-mercaptoethanol	Sigma	M6250
Cell Culture Grade Water	Corning	25-055-CI	Water
Cell lysis stock solution	Cell Signaling	9803
Eppendorf Tube	Eppendorf	22363204	Microfuge tubes
Eppendorf tube centrifuge box	Nalgene	5055	Box for holding eppendorf tubes in horizontal tube arrangement
Everlast 247 Variable Speed Rocker	Benchmark Scientific	BR5000
Freezer Mill	Spex Sample Prep	6875	Freezer/Mill for processing paws into pulverized powder
Grinding Vial	Spex Sample Prep	6801	Polycarbonate vial for processing paws into pulverized powder
Pierce BCA kit	Pierce	23225	Kit for Total Protein Quantification
Protease Inhibitor Cocktail set 1	Calbiochem	539131	Protease Inhibitors
Protein BCA Kit	Pierce	23225
Quantigene Kit	Thermofisher	QP1013	bDNA analysis Kit
Refrigerated microcentrifuge	Eppendorf	5417R	Centrifugation
RLT Buffer	Qiagen	79216	RNA extraction buffer
RNeasy mini kit	Qiagen	74104	including RNeasy column, RLT Buffer and RW1 Buffer
Shaker	Benchmark Scientific	BR5000	Rocker/Shaker
Spatula	VWR	10806-412	Spatula for powder transfer
Stainless Steel Bead	Qiagen	69989	Bead for mixing during protein extraction
Tube Extractor	Spex Sample Prep	6884	Extractor for removing the top of grinding vial
Vortexer	VWR	10153-838	Sample mixing