Summary
En kryogene pulverisering metode for å behandle murine poter ved hjelp av en flytende nitrogen fryser Mill ble utviklet for å forbedre utbyttet og kvaliteten på RNA eller protein utvunnet fra vev og muliggjøre analyse av molekylære profiler forbundet med inflammatoriske Svar.
Abstract
Profilering av molekylære endringer i lokalt vev er avgjørende for å forstå mekanismen (e) av terapeutiske kandidater i vivo. Innen leddgikt forskning, er mange studier fokusert på betente ledd som består av en kompleks blanding av bein, brusk, muskel, stromal celler og immunceller. Her etablerte vi en pålitelig og robust mekanisk metode for å forstyrre betent mus poter i homogene pulverisert prøver i et cryogenically kontrollert miljø. Protein og RNA lysater ble behandlet for å muliggjøre Proteomikk og transcriptional endepunkter og molekylær karakterisering av relevante sykdoms baner i lokalt vev.
Introduction
Revmatoid artritt (RA) er en kronisk systemisk inflammatorisk sykdom med vedvarende symmetrisk synovitt i ledd og ekstra ledd involvering av organer som hud, hjerte, lunger og øyne1. Selv om de systemiske manifestasjoner av immunresponsen er tydelig i menneskelige pasienter, en av kjennetegnene til RA patologi er infiltrasjon av immunceller i synovial vev og spredning av synovial Fibroblast celler2.
I likhet med menneskelig RA, mus kollagen indusert artritt (CIA) modell utløser sterk vev betennelse med aktive immunresponser i synovial vev og systemiske avdelinger. Mottakelighet av ulike mus stammer til CIA-modellen lenker til store histocompatibility kompleks (MHC) haplotype og antigen spesifikke T celle og B celle interaksjoner3,4. I tillegg er mange patogene veier i menneskets RA, inkludert autoantistoff produksjon, immun komplekse deponering, myelogen celle aktivering, polyartikulær manifestasjoner og pannus dannelse med synovial immun infiltrasjon, også tydelig i denne modellen 5,6. Etterforskerne har brukt denne veletablerte CIA-modellen for å undersøke virkningene av anti-inflammatorisk cytokin behandlinger7. Mange biologiske medisiner godkjent for autoimmune eller inflammatoriske sykdommer, slik som anti-TNFα og anti-Il-6, er funnet å være effektiv i CIA modell8,9.
Profilering av interaksjoner i immunsystemet i synovial vev er avgjørende for å belyse molekylære mekanismer knyttet til patogenesen av RA. I den menneskelige kliniske innstillingen, er en vanlig praksis å utføre nål synovial biopsier under veiledning av Ultralyd Imaging. I prekliniske innstillingene, gjør den mindre arkitekturen i murine leddene biopsi prosedyrer mye vanskeligere om ikke umulig. Nylig demonstrerte vi utnyttelsen av murine CIA-modell for å evaluere kombinasjoner av medikamenter for å påvirke ulike sluttpunkter og løse sykdom i en Kombinatorisk tilnærming10. En kryogene fryseboks Mill-basert pulverisering metode ble brukt til å behandle betent murine poter i homogen fint pulver og etablerte nedstrøms prosesser for å trekke ut RNA og proteiner. Denne metoden beskytter RNA og protein fra enzymatisk og kjemiske degrative prosesser og gjør det mulig for oss å anvende flere analytiske metoder til en enkelt homogenisert prøvekilde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyre eksperimenter ble utført i henhold til retningslinjene for den institusjonelle dyre omsorgen og bruks komitéen (IACUC) til Janssen R & D.
1. kryogene fryser Mill-basert pulverisering metode
- Ved opphør av CIA-studien, offer mus med 1,5% isoflurane etterfulgt av cervical forvridning.
- På dagen for vev behandling, pre-chill alle instrumenter (spatler, sliping hetteglass, etc.) på tørr is i minst 10 min. Bruk termiske hansker for å unngå Frostskade.
- Skjær bakbena med en saks på pels linjen som avbildet i figur 1a.
- Overfør hver labb til en 1,5 mL mikrosentrifugen tube, smekk fryse i flytende nitrogen umiddelbart, og oppbevar frosne poter ved-80 ° c. Ikke Oppbevar prøver frosset i mer enn en uke.
- Fyll fryse mølle med flytende nitrogen som vist i figur 1B og la det likevekt i minst 10 min.
- Hold ubehandlet prøve på tørr is og unngå fryse-tine sykluser.
- Overfør en hind labb inn pre-kjølt store polykarbonat sliping hetteglass med en bunn stål plugg, sett pre-kjølt stål nedslaget og lukke polykarbonat sliping hetteglass med pre-kjølt topp stål plugg (figur 1C).
- Overfør store polykarbonat sliping hetteglass med prøvene inn i fryseren Mill forhånd fylt med væske og lukke lokket med gummi låsen funnet på forsiden av instrumentet.
- La prøvene avkjøles i flytende nitrogen i 1 minutt.
- Sett fryseren Mill til 1 minutt program med 10 sykluser per sekund og trykk på Start-knappen. Vent til fryseren Mill å fullføre sin syklus.
Merk: Maskinen gjør en trommelyd som stål nedslaget beveger seg frem og tilbake. Bruk ørepropper for å unngå hørselstap. - Åpne lokket på fryseren mill, ta ut den store polykarbonat sliping hetteglasset og legg den i en Extractor som avbildet i figur 1D. Fjern den øverste stål pluggen ved å plassere press på det svarte håndtaket til stål pluggen glir ut av polykarbonat røret.
- Overfør den åpne store polykarbonat sliping hetteglass på tørr is. Fjern stålet nedslaget med pre-kjølt tang.
- Overfør det frosne pulveret inn i pre-kjølt 50 mL konisk slange.
- Vekt 30-50 mg frossen pulver til en taraveies frossen 1,5 mL mikrosentrifugen slange for RNA-ekstraksjon og 100-200 mg frossen pulver til protein ekstraksjon.
Merk: Den frosne pulveret skal se ut som hvit eller lys rosa fin sand som avbildet i figur 1E. - Lagre pulverisert prøver ved-80 ° c og Fortsett til RNA og protein isolasjoner innen 24 timer.
2. RNA-ekstraksjon
- Tilsett 10 μL av β-mercaptoethanol (β-ME) per 1 mL RLT-buffer.
- Beregn volumet av RLT buffer som tilsvarer et forhold på 23,3 mL/mg av vev og tilsett riktig volum av RLT buffer med β-ME til røret med frosset pulver. Dette forholdet ble empirisk fast bestemt på å være ideell for mus poter.
- Vortex prøven på 3 000 RPM for 10 s.
- Bland godt ved å pipettering opp og ned 10 ganger kraftig med en 1 mL pipettehjelper.
- Vortex prøven på nytt ved 3 000 RPM for 20 s.
- Sentrifuger røret ved 13 000 x g i 2 min.
- Overfør 700 μL av supernatanter til et friskt rør og tilsett 700 μL av 70% etanol.
Merk: Hvis < 700 μL er i røret, er det akseptabelt å fortsette, fortsatt legge tilsvarende volum på 70% etanol. - Last 700 μL av prøven på en RNA rense søyle.
- Sentrifuger røret ved ≥ 10 000 x g for 30 s.
- Forkast flyt gjennom og Last den resterende delen av prøven til RNeasy-kolonnen.
- Sentrifuger røret ved ≥ 10 000 x g for 30 s.
- Kast strømningen gjennom og vask kolonnen ved å tilsette 700 μL av RW1 buffer med sentrifugering på ≥ 10 000 x g for 30 s. Hvis du utfører alternativet DNASE fordøyelse, 350 μL av RW1 tilsettes før DNASE behandling. Og ytterligere 350 μL av RW1 tilsettes etter DNASE behandling.
- Valgfritt) Utfør en DNase fordøyelsen trinn følger produsentens instruksjoner.
- Vask røret to ganger ved å tilsette 500 μL av RPE-buffer etterfulgt av sentrifugering ved ≥ 10 000 x g for 30 s. kast strømmen gjennom hver gang.
- Tørk kolonnen med sentrifugering ved ≥ 10 000 x g i 2 minutter.
- Eluere RNA ved å tilsette 50 μL vann med sentrifugering ved ≥ 10 000 x g i 2 min. samle flyt gjennom og Overfør til et nytt 1,5 ml rør.
- Bestem antall RNA ved hjelp av forsker metoden og oppbevar ved-80 ° c før videre analyse.
3. protein utvinning
- Fortynne 10x cellelyse lagerløsning i 1x cellelyse lagerløsning ved hjelp av cellen kultur grade vann.
- Rekonstituer den protease inhibitor cocktail sett jeg med 1 mL vann for å lage en 100 protease inhibitor lager.
- Tilsett 100 μL av protease hemmere til 9,9 mL 1x Cell lyse for å lage en 1x endelig lagerløsning.
- Tilsett 4 μL iskald 1x Cellelyse Rings buffer per mg vevs pulver (f.eks. 800 μL av lyse Rings buffer til 200 mg vev pulver).
- Tilsett en 5 mm rustfritt stål perle på røret.
- Vortex røret på 3 000 RPM for 60 s. Overfør røret til våt is og Fortsett til neste prøve.
- Legg alle prøve rørene i en eske og rist sentrifuge boksen på en rocker ved 1 000 RPM, 4 ° c i 1 time.
Merk: Forskere kan finne at å plassere boksen vertikale kan tilrettelegge bedre blanding med perle. - Sentrifuger rørene ved 10 000 x g og 4 ° c i 15 min.
- Overfør supernatanter til et friskt rør og unngå fettlaget på toppen.
- Bestem den totale protein konsentrasjonen. 10 til 30-fold fortynninger av protein lysat er ideelle for en BCA test.
- Alikvot prøven inn i 1,5 mL mikrosentrifugen rør og oppbevar ved-80 ° c før videre analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her viser vi en representativ gel bilde visualisering av RNA utvunnet fra fronten poter av CIA-mus i figur 2a. 28S rRNA og 18S rRNA-båndet viser at alle prøvene har tilstrekkelig mengde intakt RNA. Deretter viser vi en representativ scatter plott av totale protein konsentrasjoner basert på protein BCA analyse i figur 2B. Totale protein konsentrasjoner fra naive mus, CIA-mus eller CIA-mus under ulike behandlinger er sammenlignbare på tvers av grupper. For å bestemme konsentrasjonen av inflammatorisk cytokiner og chemokiner i protein ekstrakt ble Luminex analyser utført. Vi viser en representativ scatter plott av konsentrasjonene av normalisert cytokiner og chemokiner (PG/mg totalt protein) i figur 2C. Sammenlignet med naive mus, flere cytokiner er forhøyet i CIA-mus og behandling med anti-IL17A antistoff hemmer betydelig produksjonen av flere cytokiner. For å evaluere transcriptome endringer i CIA og behandlingsrelaterte effekter ble Microarray analyse utført. Vi viser et representativt heatmap plott av gener betydelig økt i CIA-mus sammenlignet med naive mus i figur 2D.
Figur 1: utstyr som trengs for å gjøre murine poter. (A) betent eller uninflamed POTER fra CIA eller naive mus. (B) flytende nitrogen Dewar brukes til å fylle rustfritt stål bad i fryseren mill. (C) montert fryseren Mill tube sett. (D) fryser Mill tube opener. (E) pulverisert vev fra murine poter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representative data om analyse av protein og RNA fra pulverisert murine poter. (A) gel bilde VISUALISERING av RNA integritet. (B) totale protein konsentrasjoner fra ulike grupper. (C) chemokine og cytokin uttrykk (Luminex) fra forskjellige grupper. (D) hierarkisk Clustering heatmap av Microarray analyse fra ulike behandlingsgrupper. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om det er sterk vitenskapelig begrunnelse for å evaluere molekylære trasé i synovial vev, mange rapporter om immun profilering av murine CIA-modellen var fokusert på perifert blod, mens protein og RNA analysedata av betente poter er ganske begrenset. Det er flere mulige årsaker til denne bias: murine ankel leddene er ikke større enn ~ 2 cm; de berørte områdene består av hud, bein og bindevev som ofte er vanskelig å homogenisere ved hjelp av tradisjonelle metoder som vev kverner, morter og mørtel, silica perle avbrudd, trituration eller enzymatisk fordøyelse. Disse metodene resulterer vanligvis i ufullstendig homogenisering, lavt protein-eller RNA-utbytte, eller inkonsekvent kvalitet på grunn av proteolytiske og nukleinsyre yre degradering. Den robuste metoden som er beskrevet her gir en detaljert prosedyre for å generere en homogen pulverisert frosset pulver for å muliggjøre nedstrøms Proteomikk og transcriptional profilering innsats for å etablere molekylære signaturer av sykdom fra en enkelt ensartet prøve Kilde.
Flere kritiske trinn bør vurderes når du utfører denne metoden. For det første bør murine poter kuttes på pelsen linjen under vev innhøsting og store mengder hår bør unngås. Overdreven hår kan tette søyler under RNA utvinning og forstyrre protein utvinning. For det andre, rør, tang og spatler bør holdes på tørr is gjennom hele prosedyren fordi forhøyet temperatur i vev pulver vil raskt snu materialet til amorfe "gjørme" og integriteten til protein og RNA vil bli kompromittert. For det tredje bør mengden av vev pulver brukes til protein eller RNA utvinning være nøye optimalisert. Mer vev pulver kan ikke alltid gi høyere utbytte, men kan føre til ytterligere problemer i nedstrøms behandling inkludert tilstopping RNA isolasjon kolonner, endre DNase/DNA ratio (Hvis dette trinnet er brukt) for å hindre fullstendig DNA degradering. Til slutt bør normalisering av protein og RNA-input være en integrert del av arbeidsflyten og dataanalysen. Variasjon i vevs belastningen kan betydelig maskere endringer i relative protein-og RNA-nivåer. I tillegg til total protein eller total RNA, kan uttrykk for housekeeping gener også betraktes som ankere for normalisering.
Gjennom omfattende prøving og feiling, har vi identifisert noen potensielle hyppige problemer for førstegangsbrukere av denne metoden. Det kan være lav avkastning av RNA. Dette er ofte et resultat av overbelastning kolonnen med for mye vev ekstrakt. Mengden av vevet per kolonne og forholdet mellom RLT/Powder er avgjørende for effektiv RNA-isolasjoner. Vi har funnet at noen kommersielle 96 godt utvinning kits kanskje ikke fungerer for denne prosessen som prøvene ikke vil spinne gjennom kolonnen på en tilsvarende hastighet, og dermed kompromittere disse prøvene i nedstrøms vasking og eluering trinn. Det kan være høy variasjon i proteinkonsentrasjon i BCA analyse og cytokin konsentrasjoner i Luminex analyse. Hvis det ikke er noen problemer med BCA eller Luminex prosessen, er det vanligvis forårsaket av fett eller andre forurensninger i protein ekstrakt. Det er viktig å unngå fettlaget på toppen eller uløselig saken på bunnen av mikrosentrifugen rør når høsting for protein utvinning. Om nødvendig, gjenta spin og samle supernatanter for nedstrøms analyse.
Som denne metoden innebærer en spesialisert kryogene fryser mill og store mengder tørr is og flytende nitrogen, ekstra sikkerhetstiltak bør vurderes. Riktig personlig verneutstyr, inkludert vernebriller, laboratorie frakker og kryogene hansker, bør alltid brukes for å forhindre brannskader og skade på grunn av eksplosjon. Det anbefales også å minimere aerosoler og bruke ventilerte balanse skap. Til slutt, i likhet med andre protokoller som håndterer animalsk vev, bør forsiktighet tas til riktig avhending av alle ubrukte vevsprøver, mens gjenbrukbare rør må dekontaminert før rengjøring.
Mens metoden har mange fordeler fremfor konvensjonelle metoder, er det fortsatt havner noen begrensninger. Det transcriptome profil fra en murine hele pote overlappe viktig med transcriptome profil fra Human synovial biopsi (data ikke vist). Ytterligere mRNA fra muskel, hud og benmarg kunne fortynne signalene fra synovial vev. En alternativ løsning er å samle murine synovial vev gjennom laser microdissection, som kan utføres på OCT innebygde musen leddene. Men lav gjennomstrømming og relativt liten mengde vev begrenser den brede anvendelse for laser microdissection. I tillegg, selv med betydelig automatisering, er denne metoden fortsatt ganske arbeidsintensiv. Det tar minst 8 timer å behandle 30-60 prøver ved hjelp av 3-4 etterforskere. Til slutt, denne metoden krever store mengder flytende nitrogen (~ 10-15 L for prosessering 30-60 prøver).
I den forrige beskrivelsen av metoden ble evalueringen av Proteomikk og transcriptional ende punkts analyser vist. Ekstra endepunkt, for eksempel lipidomic, Plantemetabolomikk og små RNA-profilering, kan imidlertid være av interesse for forskningsmiljøet i større leddgikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne BJ, SH, ML, RM, ML, TO og FS er ansatte i Janssen Research & Development Inc og er aksjonærer i morselskapet, Johnson & Johnson, Inc.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Edith Janssen for den kritiske gjennomgangen av manuskriptet og Navin Rao og Jennifer Towne for deres støtte til utgivelsen av dette manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mm stainless steel bead | Qiagen | 69989 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Sample reducing agent that inhibits RNASE enzymes |
| Bioanalyzer Kit | Agilent | 5067-1511 | RNA qualification kit |
| b-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Cell Culture Grade Water | Corning | 25-055-CI | Water |
| Cell lysis stock solution | Cell Signaling | 9803 | |
| Eppendorf Tube | Eppendorf | 22363204 | Microfuge tubes |
| Eppendorf tube centrifuge box | Nalgene | 5055 | Box for holding eppendorf tubes in horizontal tube arrangement |
| Everlast 247 Variable Speed Rocker | Benchmark Scientific | BR5000 | |
| Freezer Mill | Spex Sample Prep | 6875 | Freezer/Mill for processing paws into pulverized powder |
| Grinding Vial | Spex Sample Prep | 6801 | Polycarbonate vial for processing paws into pulverized powder |
| Pierce BCA kit | Pierce | 23225 | Kit for Total Protein Quantification |
| Protease Inhibitor Cocktail set 1 | Calbiochem | 539131 | Protease Inhibitors |
| Protein BCA Kit | Pierce | 23225 | |
| Quantigene Kit | Thermofisher | QP1013 | bDNA analysis Kit |
| Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | Centrifugation |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | RNA extraction buffer |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | including RNeasy column, RLT Buffer and RW1 Buffer |
| Shaker | Benchmark Scientific | BR5000 | Rocker/Shaker |
| Spatula | VWR | 10806-412 | Spatula for powder transfer |
| Stainless Steel Bead | Qiagen | 69989 | Bead for mixing during protein extraction |
| Tube Extractor | Spex Sample Prep | 6884 | Extractor for removing the top of grinding vial |
| Vortexer | VWR | 10153-838 | Sample mixing |
References
- Firestein, G. S. Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Journal of Clinical Rheumatology. 11, S39-S44 (2005).
- McInnes, I. B., Schett, G. The pathogenesis of rheumatoid arthritis. New England Journal of Medicine. 365, 2205-2219 (2011).
- Ahlqvist, E., Hultqvist, M., Holmdahl, R. The value of animal models in predicting genetic susceptibility to complex diseases such as rheumatoid arthritis. Arthritis Research and Therapy. 11, 226 (2009).
- David, C. S., Taneja, V. Role of major histocompatibility complex genes in murine collagen-induced arthritis: a model for human rheumatoid arthritis. American Journal of the Medical Sciences. 327, 180-187 (2004).
- Tarkowski, A., Holmdahl, R., Klareskog, L. Rheumatoid factors in mice. Monographs in Allergy. 26, 214-229 (1989).
- Schurgers, E., Billiau, A., Matthys, P. Collagen-induced arthritis as an animal model for rheumatoid arthritis: focus on interferon-gamma. Journal of Interferon & Cytokine Research. 31, 917-926 (2011).
- Joosten, L. A., Helsen, M. M., van de Loo, F. A., van den Berg, W. B. Anticytokine treatment of established type II collagen-induced arthritis in DBA/1 mice. A comparative study using anti-TNF alpha anti-IL-1 alpha/beta, and IL-1Ra. Arthritis & Rheumatology. 39, 797-809 (1996).
- Asquith, D. L., Miller, A. M., McInnes, I. B., Liew, F. Y. Animal models of rheumatoid arthritis. European Journal of Immunology. 39, 2040-2044 (2009).
- Williams, R. O. Collagen-induced arthritis as a model for rheumatoid arthritis. Methods in Molecular Medicine. 98, 207-216 (2004).
- Shen, F., et al. Combined Blockade of TNF-alpha and IL-17A Alleviates Progression of Collagen-Induced Arthritis without Causing Serious Infections in Mice. Journal of Immunology. 202, 2017-2026 (2019).
