コラーゲン誘発性関節炎モデルにおける組織炎症の分子経路を評価するためのマウス足処理のためのクライオ粉砕プロトコル

Summary

液体窒素冷凍庫ミルを用いてマウス足を処理する極低温粉砕法を開発し、組織から抽出されたRNAまたはタンパク質の収率と品質を向上させ、炎症に関連する分子プロファイルの解析を可能にした。応答。

Abstract

局所組織における分子変化のプロファイリングは、生体内における治療候補の作用のメカニズムを理解するために重要である。関節炎の研究の分野では、多くの研究は、骨、軟骨、筋肉、間質細胞および免疫細胞の複雑な混合物で構成される炎症性関節に焦点を当てています。ここでは、炎症を起こしたマウスの足を極低温で制御された環境で均質な粉砕サンプルに破壊する信頼性と堅牢な機械的方法を確立しました。タンパク質およびRNAリサートは、局所組織におけるプロテオミクスおよび転写エンドポイントおよび関連する疾患経路の分子特性評価を可能にするために処理された。

Introduction

関節リウマチ(RA)は、関節に持続性対称性腺炎を有し、皮膚、心臓、肺、^眼1などの器官の余分な関節関与を有する慢性全身性炎症性疾患である。免疫応答の全身症状はヒト患者において明らかであるが、RA病理の特徴の1つは、静脈組織における免疫細胞の浸潤およびスイノビアル線維芽細胞^{の増殖である2}である。

ヒトRAと同様に、マウスコラーゲン誘発関節炎(CIA)モデルは、滑膜組織および全身コンパートメントにおける活性免疫応答を有する強い組織炎症を引き起こす。CIAモデルに対する異なるマウス株の感受性は、主要組織適合性複合体(MHC)ハプロタイプおよび抗原特異的T細胞およびB細胞^{相互作用3、4}にリンクする。さらに、自己抗体産生、免疫複合体沈着、骨髄細胞活性化、多関節状症状および眼窩免疫浸潤を伴うパンヌス形成を含むヒトRAにおける多くの病原性経路も、このモデルで明らかである。^5、6.研究者は、抗炎症サイトカイン治療の効果を調査するために、この確立されたCIAモデルを採用しています^7.抗TNFαおよび抗IL-6のような自己免疫または炎症性疾患に対して承認された多くの生物学的製剤は、CIA^{モデル8、9}において有効であることが見出される。

静脈組織における免疫系の相互作用をプロファイリングすることは、RAの病因に関連する分子機構を解明するために重要である。人間の臨床環境では、超音波画像診断の指導の下で針の静脈生検を行うことが一般的です。前臨床の設定では、マウス関節の小さなアーキテクチャは、不可能でない場合、生検手順がはるかに困難になります。最近、異なる終点に影響を与える薬物の組み合わせを評価し、組み合わせ^{アプローチ10}で疾患を解決するために、マウスCIAモデルの利用を実証した。炎症を起こしたマウスの足を均質な微粉末に処理し、RNAとタンパク質を抽出する下流プロセスを確立するために、極低温冷凍ミルベースの粉砕法が採用されました。この方法は、RNAとタンパク質を酵素的および化学的な分解プロセスから保護し、単一の均質化されたサンプルソースに複数の分析方法を適用することを可能にします。

Protocol

すべての動物実験は、ヤンセンR&Dの制度動物ケア利用委員会(IACUC)の方針に従って行われました。

1. 極低温冷凍ミルベースの粉砕法

1. CIAの研究の終了時に、1.5%のイソフルランでマウスを犠牲にし、続いて子宮頸部脱臼を行った。
2. 組織処理の日には、すべての器具(スパチュラ、粉砕バイアルなど)をドライアイスで10分間冷やし、凍結損傷を避けるためにサーマルグローブを着用してください。
3. 図 1Aに示すように、ファーラインでハサミで後足をカットします。
4. 各足を1本の1.5 mLマイクロ遠心管に移し、すぐに液体窒素で凍結し、冷凍足を-80°Cで保存します。サンプルを1週間以上凍結したままにしないでください。
5. 図1Bに示すように、冷凍庫ミルに液体窒素を充填し、少なくとも10分間平衡化させます。
6. 未処理のサンプルをドライアイスに保管し、凍結融解サイクルを避けてください。
7. ボトムスチールプラグで予冷した大型ポリカーボネート研削バイアルに1つのヒンドプを移し、予冷したスチールインパシエータを挿入し、予冷したトップスチールプラグでポリカーボネート研削バイアルを閉じます(図1C)。
8. サンプルと一緒に大きなポリカーボネート粉砕バイアルを液体で事前に充填された冷凍庫に移し、器具の前面にあるゴム留め金で蓋を閉じます。
9. 液体窒素中で1分間冷やします。
10. 1秒あたり10サイクルで1分のプログラムに冷凍ミルを設定し、スタートボタンを押します。冷凍工場がサイクルを完了するのを待ちます。
    注:スチールインモークターが前後に移動すると、機械は太鼓の音を出します。耳栓を使用して難聴を避けてください。
11. 冷凍ミルの蓋を開き、大きなポリカーボネート粉砕バイアルを取り出し、図1Dに示すように抽出器に入れる。上部のスチールプラグを取り外し、スチールプラグがポリカーボネートチューブから滑り出すまで、黒いハンドルに下向きの圧力をかけて取り外します。
12. 開いた大きなポリカーボネート粉砕バイアルをドライアイスに移します。あらかじめ冷やした鉗子でスチールインプレッシエーターを取り外します。
13. 冷凍粉末を予冷50mL円錐管に移します。
14. 重量30〜50mgの凍結粉末を、RNA抽出用のタール状凍結1.5mLマイクロ遠心管、タンパク質抽出用の冷凍粉末100〜200mgに含む。
    注:凍結された粉末は、図 1Eに示すように白または薄いピンクの細かい砂のように見える必要があります。
15. 粉砕されたサンプルを-80°Cで保存し、24時間以内にRNAおよびタンパク質分離に進みます。

2. RNA抽出

1. RLT緩衝液1mLあたり10μLのβ-メルカプトエタノール(β-ME)を加えます。
2. 組織の23.3 mL/mgの比率に対応するRLTバッファーの体積を計算し、凍結粉末でチューブにβ-MEを使用したRLTバッファの適切なボリュームを追加します。この比率は、マウスの足に最適であると経験的に決定した。
3. 10sのための3,000 RPMでサンプルをボルテックス。
4. 1 mLピペットで上下を10回精力的にピペットでよく混ぜます。
5. 20sの3,000 RPMで再びサンプルをボルテックス。
6. チューブを13,000 x gで2分間遠心分離します。
7. 上清の700μLを新鮮なチューブに移し、700°Lの700°Lのエタノールを加えます。
   注:<700 μL がチューブ内にある場合は、70% エタノールの同等の体積を追加しても続行できます。
8. サンプルの700 μLをRNA精製カラムにロードします。
9. 30 s の ≥10,000 x gでチューブを遠心分離します。
10. フロースルーを破棄し、サンプルの残りの部分を RNeasy 列にロードします。
11. 30 s の ≥10,000 x gでチューブを遠心分離します。
12. 流れを捨て、30sの遠心分離で700 μLのRW1バッファを追加してカラムを洗浄します。オプションDNASE消化を行う場合は、DNASE治療の前に350μLのRW1が添加される。 そして、DNASE処理の後にRW1の350 μLを追加します。
13. オプション) DNase 消化ステップを実行し、製造元の指示に従います。
14. 500 μL の RPE バッファーを追加し、その後に 30 s の ≥10,000 x gで遠心分離を加えてチューブを 2 回洗浄します。
15. 2分間≥10,000 x gで遠心分離してカラムを乾燥させます。
16. エルテRNAは、2分間≥10,000 x gで遠心分離50μLの水を加えて、流れを回収し、新しい1.5 mLチューブに移します。
17. さらに分析する前に、研究者の選択方法を使用してRNAの量を決定し、-80°Cで保存します。

3. タンパク質抽出

1. 細胞培養グレードの水を用いて1x細胞溶解原液に10x細胞溶解原液を希釈する。
2. プロテアーゼ阻害剤カクテルセットIを1mLの水で再構成し、100xプロテアーゼ阻害剤ストックを作ります。
3. 1x細胞溶解の9.9 mLにプロテアーゼ阻害剤の100 μLを追加し、1x最終原液を作ります。
4. 4 μL の氷冷 1x 細胞リシス バッファー/mg 組織粉末 (例えば、800 μL のリシス バッファーを 200 mg の組織粉末に) を加えます。
5. チューブに5mmステンレスビーズを1つ追加します。
6. 60sの3,000 RPMでチューブをボルテックスし、チューブを濡れた氷に移し、次のサンプルに進みます。
7. すべてのサンプルチューブを箱に入れ、1,000 RPM、1時間4°Cでロッカーの遠心分離機ボックスを振ります。
   注:研究者は、ボックスを垂直に置くことは、ビーズとのより良い混合を容易にすることができることを見つけることができます。
8. 10,000 x gと 4 °C でチューブを 15 分間遠心分離します。
9. 新鮮なチューブに上清を転送し、上部の脂肪層を避けます。
10. 総タンパク質濃度を決定します。タンパク質リサートの10~30倍の希釈は、BCA試験に最適です。
11. 試料を1.5mLマイクロ遠心管にアリコートし、-80°Cで保存してからさらに分析してください。

Representative Results

ここで、図2AにCIAマウスの前足から抽出したRNAの代表的なゲル画像可視化を示す。28S rRNAおよび18S rRNAバンドは、すべてのサンプルが十分な量の無傷のRNAを有しっていることを示す。次に、図2Bにタンパク質BCA分析に基づく総タンパク質濃度の代表的な散乱プロットを示す。ナイーブマウス、CIAマウスまたはCIAマウスからの総タンパク質濃度は、グループ間で同等である。タンパク質抽出物中の炎症性サイトカインおよびケモカインの濃度を決定するために、ルミネックス分析を行った。図2Cに、正規化サイトカインおよびケモカイン(pg/mg総タンパク質)の濃度の代表的な散布図を示す。ナイーブマウスと比較して、CIAマウスではいくつかのサイトカインが上昇し、抗IL17A抗体による治療は、いくつかのサイトカインの産生を有意に阻害する。CIAおよび治療関連効果におけるトランスクリプトーム変化を評価するために、マイクロアレイ分析を行った。図2Dに、CIAマウスにおいて有意に増加した遺伝子の代表的なヒートマッププロットを示す。

図1:マウスの足を粉砕するために必要な機器。(A)CIAまたはナイーブマウスからの炎症または炎症を起こしていない足。(B)冷凍工場のステンレス鋼浴を充填するために使用される液体窒素デュワー。(C)組み立てられた冷凍ミルチューブセット。(D)フリーザーミルチューブオープナー。(E) マウスの足から組織を粉砕した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:粉砕されたマウス足からのタンパク質およびRNAの分析に関する代表的なデータ。(A)RNA完全性のゲル画像可視化(B) 異なる基からの総タンパク質濃度。(C)ケモカインおよびサイトカイン発現(ルミネックス)を異なる基から(D) 異なる治療群からのマイクロアレイ解析の階層クラスタリングヒートマップこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

経卵組織の分子経路を評価する科学的根拠は強いが、マウスCIAモデルの免疫プロファイリングに関する多くの報告は末梢血に焦点を当て、炎症を起こした足のタンパク質およびRNA分析データはかなり限られている。このバイアスのいくつかの考えられる理由があります: マウス足首関節は〜2 cm以下です。患部は、組織グラインダー、害虫やモルタル、シリカビーズ破壊、トリチュレーションまたは酵素消化のような伝統的な方法を使用して均質化することがしばしば困難である皮膚、骨および結合組織で構成されています。これらの方法は、典型的には、不完全な均質化、低タンパク質またはRNA収率、またはタンパク質分解および核酸分解による一貫性のない品質をもたらす。本明細書に記載される堅牢な方法は、単一の均一なサンプルから疾患の分子シグネチャを確立するための下流のプロテオミクスおよび転写プロファイリングの努力を可能にするために均質な粉砕された凍結粉末を生成するための詳細な手順を提供するソース。

このメソッドを実行する場合は、いくつかの重要な手順を考慮する必要があります。まず、マウスの足は、組織の収穫中に毛皮のラインで切断する必要があり、大量の髪を避ける必要があります。過度の毛髪は、RNA抽出中にカラムを詰まらせ、タンパク質抽出を妨げる可能性があります。第二に、組織粉末中の高温は物質を急速に非晶質の「泥」に変え、タンパク質とRNAの完全性が損なわれるため、チューブ、鉗子、およびスパチュラは、手順全体を通してドライアイスに保たれるべきである。第三に、タンパク質またはRNA抽出に使用される組織粉末の量は慎重に最適化されるべきである。より多くの組織粉末は、常に高い収率を提供するとは限りませんが、RNA単離カラムの詰まり、DNase/DNA比の変化(このステップが採用されている場合)を含む下流処理に追加の問題を引き起こし、完全なDNA分解を防ぐことができます。最後に、タンパク質とRNA入力の正規化は、ワークフローとデータ分析の不可欠な部分でなければなりません。組織負荷の変動性は、相対タンパク質およびRNAレベルの変化を有意にマスクすることができる。総タンパク質または全RNAに加えて、ハウスキーピング遺伝子の発現は、正規化のためのアンカーとも考えることができる。

広範な試行錯誤プロセスを通じて、このメソッドの初めてのユーザーにとって頻繁に発生する可能性のある問題を特定しました。RNAの収率が低い可能性があります。これは、多くの場合、あまりにも多くの組織抽出物でカラムを過負荷にした結果です。カラムあたりの組織量とRLT/粉末の比率は、効率的なRNA分離のために重要です。サンプルが同等の速度でカラムを回転しないため、一部の市販の96ウェル抽出キットがこのプロセスでは機能しない可能性があることが判明し、下流の洗浄および溶出工程でこれらのサンプルが損なわれることがわかりました。ルミネックス分析では、BCA分析におけるタンパク質濃度とサイトカイン濃度の変動性が高い可能性があります。BCAまたはルミナスプロセスに問題がない場合、それは通常、タンパク質抽出物中の脂肪または他の汚染物質によって引き起こされます。タンパク質抽出のために収穫する際には、マイクロ遠心管の底部の上部または不溶性物質の脂肪層を避けることは重要です。必要に応じて、スピンを繰り返し、下流分析用の上清を収集します。

この方法は、特殊な極低温冷凍庫工場と大量のドライアイスと液体窒素を含むので、追加の安全対策を考慮する必要があります。安全メガネ、ラボコート、極低温手袋を含む適切な個人保護装置は、爆発による凍結火傷や怪我の可能性を防ぐために常に着用する必要があります。エアロゾルの生成も最小限に抑え、ベントバランスエンクロージャの使用をお勧めします。最後に、動物組織を扱う他のプロトコルと同様に、未使用の組織サンプルをすべて適切に処分するように注意する必要がありますが、再利用可能なチューブは洗浄前に除染する必要があります。

この方法には従来の方法に対して多くの利点がありますが、まだいくつかの制限があります。マウス全体のポーからのトランスクリプトームプロファイルは、ヒト卵性生検からのトランスクリプトームプロファイルと有意に重複する(データは示されていない)。筋肉、皮膚および骨髄からの追加のmRNAは、スイノビアル組織からのシグナルを希釈することができる。別の解決策は、OCT埋め込みマウス関節上で行うことができるレーザーマイクロダイブドを介してマウスのスイノビアル組織を収集することです。しかし、低スループットと組織の比較的少量は、レーザーマイクロダイブセクションのための広範なアプリケーションを制限します。さらに、重要な自動化を使用しても、この方法は依然として非常に手間がかかります。3-4の調査者の助けを借りて30-60サンプルを処理するには、少なくとも8時間かかります。最後に、この方法は、大量の液体窒素(30〜60サンプルを処理するための〜10〜15L)を必要とします。

上記の方法の説明では、プロテオミクスおよび転写エンドポイント分析の評価が実証された。しかし、脂質、メタボロミクス、小型RNAプロファイリングなどの追加のエンドポイントは、より広範な関節炎研究コミュニティにとって興味深い可能性があります。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mm stainless steel bead	Qiagen	69989
beta-mercaptoethanol	Sigma	M6250	Sample reducing agent that inhibits RNASE enzymes
Bioanalyzer Kit	Agilent	5067-1511	RNA qualification kit
b-mercaptoethanol	Sigma	M6250
Cell Culture Grade Water	Corning	25-055-CI	Water
Cell lysis stock solution	Cell Signaling	9803
Eppendorf Tube	Eppendorf	22363204	Microfuge tubes
Eppendorf tube centrifuge box	Nalgene	5055	Box for holding eppendorf tubes in horizontal tube arrangement
Everlast 247 Variable Speed Rocker	Benchmark Scientific	BR5000
Freezer Mill	Spex Sample Prep	6875	Freezer/Mill for processing paws into pulverized powder
Grinding Vial	Spex Sample Prep	6801	Polycarbonate vial for processing paws into pulverized powder
Pierce BCA kit	Pierce	23225	Kit for Total Protein Quantification
Protease Inhibitor Cocktail set 1	Calbiochem	539131	Protease Inhibitors
Protein BCA Kit	Pierce	23225
Quantigene Kit	Thermofisher	QP1013	bDNA analysis Kit
Refrigerated microcentrifuge	Eppendorf	5417R	Centrifugation
RLT Buffer	Qiagen	79216	RNA extraction buffer
RNeasy mini kit	Qiagen	74104	including RNeasy column, RLT Buffer and RW1 Buffer
Shaker	Benchmark Scientific	BR5000	Rocker/Shaker
Spatula	VWR	10806-412	Spatula for powder transfer
Stainless Steel Bead	Qiagen	69989	Bead for mixing during protein extraction
Tube Extractor	Spex Sample Prep	6884	Extractor for removing the top of grinding vial
Vortexer	VWR	10153-838	Sample mixing