Ein Kryo-Pulverisierungsprotokoll zur Verarbeitung von Mauspfoten zur Bewertung molekularer Wege von Gewebeentzündungen in einem Kollagen-induzierten Arthritis-Modell

Summary

Eine kryogene Pulverisierungsmethode zur Verarbeitung von murinen Pfoten mit einer flüssigen Stickstoff-Gefriermühle wurde entwickelt, um die Ausbeute und Qualität der aus den Geweben extrahierten RNA oder Proteine zu verbessern und die Analyse molekularer Profile im Zusammenhang mit entzündlichen Antworten.

Abstract

Die Profilierung molekularer Veränderungen in lokalen Geweben ist entscheidend, um den Wirkmechanismus(en) der therapeutischen Kandidaten in vivo zu verstehen. Im Bereich der Arthritisforschung konzentrieren sich viele Studien auf entzündete Gelenke, die aus einer komplexen Mischung aus Knochen, Knorpel, Muskel, Stromalzellen und Immunzellen bestehen. Hier haben wir eine zuverlässige und robuste mechanische Methode etabliert, um entzündete Mauspfoten in homogenpulverisierte Proben in einer kryogen kontrollierten Umgebung zu stören. Protein- und RNA-Lysate wurden verarbeitet, um proteomische und transkriptionelle Endpunkte und die molekulare Charakterisierung relevanter Krankheitswege im lokalen Gewebe zu ermöglichen.

Introduction

Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine chronisch systemische entzündliche Erkrankung mit anhaltender symmetrischer Synovitis in den Gelenken und extra artikulärer Beteiligung von Organen wie Haut, Herz, Lunge und Augen¹. Obwohl die systemischen Manifestationen der Immunantwort bei menschlichen Patienten offensichtlich sind, ist eines der Kennzeichen der RA-Pathologie die Infiltration von Immunzellen im Synovialgewebe und die Proliferation von synovialen Fibroblastenzellen².

Ähnlich wie beim menschlichen RA löst das Modell der Mauskollagen-induzierten Arthritis (CIA) starke Gewebeentzündungen mit aktiven Immunantworten in Synovialgeweben und systemischen Fächern aus. Die Anfälligkeit verschiedener Mausstämme für CIA-Modellverbindungen mit DemInthek-Komplex (MHC) und antigenspezifischen T-Zell- und B-Zell-Wechselwirkungen^3,4. Darüber hinaus sind viele pathogene Wege in der menschlichen RA, einschließlich der Autoantikörperproduktion, immunkomplexer Ablagerung, myeloische Zellaktivierung, polyartikulärer Manifestationen und Pannusbildung mit synovialer Immuninfiltration, in diesem Modell ebenfalls zu sehen. ^5,6. Die Ermittler haben dieses etablierte CIA-Modell verwendet, um die Auswirkungen entzündungshemmender Zytokinbehandlungen zu untersuchen⁷. Viele Biologika, die für Autoimmun- oder entzündliche Erkrankungen zugelassen sind, wie Z.B. Anti-TNF und Anti-IL-6, werden im CIA-Modell^8,9als wirksam befunden.

Die Profilierung der Wechselwirkungen des Immunsystems im Synovialgewebe ist entscheidend, um molekulare Mechanismen im Zusammenhang mit der Pathogenese von RA aufzuklären. Im klinischen Umfeld des Menschen ist es gängige Praxis, Nadelsynovialbiopsien unter Anleitung der Ultraschall-Bildgebung durchzuführen. In den präklinischen Umgebungen erschwert die kleinere Architektur der murinen Gelenke die Biopsieverfahren viel schwieriger, wenn nicht gar unmöglich. Kürzlich haben wir die Verwendung des murinen CIA-Modells demonstriert, um Kombinationen von Medikamenten zu bewerten, um unterschiedliche Endpunkte zu beeinflussen und Krankheiten in einem kombinatorischen Ansatz zu lösen¹⁰. Eine kryogene Gefrierwalzen-Pulverisierungsmethode wurde eingesetzt, um entzündete murine Pfoten zu homogenen Feinenpulvern zu verarbeiten und nachgelagerte Prozesse zur Extraktion von RNA und Proteinen zu etablieren. Diese Methode schützt RNA und Protein vor enzymatischen und chemischen Degrativen Prozessen und ermöglicht es uns, mehrere Analysemethoden auf eine einzige homogenisierte Probenquelle anzuwenden.

Protocol

Alle Tierversuche wurden im Einklang mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) von Janssen R&D durchgeführt.

1. Kryogene Gefrierwerk Mühlen-basierte Pulverisierungsmethode

1. Nach Beendigung der CIA-Studie opfern Mäuse mit 1,5% Isofluran, gefolgt von zervikaler Dislokation.
2. Am Tag der Gewebeverarbeitung alle Instrumente (Spatzer, Schleiffläschchen usw.) auf Trockeneis für mindestens 10 min vorkühlen. Thermische Handschuhe tragen, um Frostschäden zu vermeiden.
3. Hinterpfoten mit einer Schere an der Felllinie schneiden, wie in Abbildung 1Adargestellt.
4. Jede Pfote in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr geben, sofort in flüssigem Stickstoff einfrieren und gefrorene Pfoten bei -80 °C lagern. Halten Sie Proben nicht mehr als eine Woche eingefroren.
5. Gefriermühle mit flüssigem Stickstoff füllen, wie in Abbildung 1B dargestellt, und lassen Sie es für mindestens 10 min ausdemieren.
6. Unverarbeitete Probe auf Trockeneis aufbewahren und Gefrier-Tau-Zyklen vermeiden.
7. Eine Hinterpfote in vorgekühlte große Polycarbonat-Schleifflasche mit einem unteren Stahlstecker übertragen, den vorgekühlten Stahlstoßer einsetzen und die Polycarbonat-Schleifflasche mit dem vorgekühlten Stahlstopfen schließen (Abbildung 1C).
8. Übertragen Sie große Polycarbonat-Schleiffläschchen mit den Proben in die mit Flüssigkeit vorgefüllte Gefriermühle und schließen Sie den Deckel mit dem Gummiverschluss an der Vorderseite des Instruments.
9. Lassen Sie die Proben 1 Minute in flüssigem Stickstoff abkühlen.
10. Stellen Sie die Gefriermühle mit 10 Zyklen pro Sekunde auf das 1-Minuten-Programm und drücken Sie die Starttaste. Warten Sie, bis die Gefriermühle ihren Zyklus abgeschlossen hat.
    HINWEIS: Die Maschine macht einen Trommelklang, während sich der Stahlstoßer hin und her bewegt. Verwenden Sie Ohrstöpsel, um Hörverlust zu vermeiden.
11. Öffnen Sie den Deckel der Gefriermühle, nehmen Sie die große Polycarbonat-Schleifflasche heraus und legen Sie sie in einen Extraktor gemäß Abbildung 1D. Entfernen Sie den oberen Stahlstecker, indem Sie den schwarzen Griff nach unten drücken, bis der Stahlstecker aus dem Polycarbonatrohr gleitet.
12. Übertragen Sie die geöffnete große Polycarbonat-Schleifflasche auf Trockeneis. Entfernen Sie den Stahlstoßmitschlag mit vorgekühlten Zangen.
13. Das gefrorene Pulver in vorgekühlte 50 ml konische Röhre geben.
14. Gewicht 30-50 mg gefrorenes Pulver in eine geteerte gefrorene 1,5 ml Mikrozentrifugenröhre für die RNA-Extraktion und 100-200 mg gefrorenes Pulver für die Proteinextraktion.
    HINWEIS: Das gefrorene Pulver sollte wie weißer oder hellrosa feiner Sand aussehen, wie in Abbildung 1Edargestellt.
15. Pulverisierte Proben bei -80 °C lagern und innerhalb von 24 h zu RNA- und Proteinisolationen übergehen.

2. RNA-Extraktion

1. Fügen Sie 10 l Von -Mercaptoethanol (-ME) pro 1 ml RLT-Puffer hinzu.
2. Berechnen Sie das Volumen des RLT-Puffers, das einem Verhältnis von 23,3 ml/mg Gewebe entspricht, und fügen Sie das entsprechende Volumen des RLT-Puffers mit dem Röhrchen mit gefrorenem Pulver in das Rohr ein. Dieses Verhältnis wurde empirisch als ideal für Mauspfoten ermittelt.
3. Wirbeln Sie die Probe bei 3.000 RPM für 10 s.
4. Mit einem 1 ml Pipettor gut mischen, indem man 10 Mal kräftig nach oben und unten pipet.
5. Wirbeln Sie die Probe wieder bei 3.000 RPM für 20 s.
6. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 13.000 x g für 2 min.
7. Übertragen Sie 700 l der Überstande in ein frisches Rohr und fügen Sie 700 l 70% Ethanol hinzu.
   HINWEIS: Wenn <700 l in der Röhre ist, ist es akzeptabel, fortzufahren und immer noch ein äquivalentes Volumen von 70% Ethanol hinzuzufügen.
8. Laden Sie 700 l der Probe auf eine RNA-Reinigungskolonne.
9. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 10.000 x g für 30 s.
10. Verwerfen Sie den Durchfluss und laden Sie den verbleibenden Teil der Probe in die RNeasy-Spalte.
11. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 10.000 x g für 30 s.
12. Entsorgen Sie den Durchfluss und waschen Sie die Säule, indem Sie 700 L RW1-Puffer mit einer Zentrifugierung von 10.000 x g für 30 s hinzufügen. Bei der Durchführung der Option DNASE-Verdauung werden vor der DNASE-Behandlung 350 l RW1 hinzugefügt.  Und nach der DNASE-Behandlung kommen weitere 350 L RW1 hinzu.
13. Optional) Führen Sie einen DNase-Verdauungsschritt nach den Anweisungen des Herstellers.
14. Waschen Sie das Rohr zweimal, indem Sie 500 l RPE-Puffer hinzufügen, gefolgt von einer Zentrifugation bei 10.000 x g für 30 s. Entsorgen Sie den Durchfluss jedes Mal.
15. Trocknen Sie die Säule durch Zentrifugation bei 10.000 x g für 2 min.
16. Elute-RNA durch Zugabe von 50 l Wasser mit Zentrifugation bei 10.000 x g für 2 min. Sammeln Sie den Durchfluss und übertragen Sie es in ein neues 1,5 ml-Rohr.
17. Bestimmen Sie die RNA-Menge mit der Methode der Wahl des Forschers und lagern Sie sie bei -80 °C vor der weiteren Analyse.

3. Proteinextraktion

1. Verdünnen Sie die 10x Zelllyse-Stammlösung in 1x Zelllyse-Stammlösung mit Zellkultur-Wasser.
2. Rekonstituieren Sie den Protease Inhibitor Cocktail Set I mit 1 ml Wasser, um einen 100-fachen Protease-Hemmer-Bestand zu bilden.
3. Fügen Sie 100 l Protease-Inhibitor zu 9,9 ml 1x Zelllyse hinzu, um eine 1x-Endstofflösung herzustellen.
4. Fügen Sie 4 l eiskalten 1x Zelllysispuffer pro mg-Gewebepulver hinzu (z. B. 800 l Lysepuffer auf 200 mg Gewebepulver).
5. Fügen Sie eine 5 mm Edelstahlperle in das Rohr ein.
6. Wirbeln Sie das Rohr bei 3.000 U/min für 60 s. Übertragen Sie das Rohr auf nasses Eis und fahren Sie mit der nächsten Probe fort.
7. Alle Probenröhrchen in eine Box geben und die Zentrifugenbox bei 1.000 U/min, 4 °C für 1 h auf eine Wippe schütteln.
   HINWEIS: Forscher können feststellen, dass das Platzieren der Box vertikal kann eine bessere Vermischung mit der Perle erleichtern.
8. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 10.000 x g und 4 °C für 15 min.
9. Übertragen Sie die Überräube in ein frisches Rohr und vermeiden Sie die Fettschicht auf der Oberseite.
10. Bestimmen Sie die Gesamtproteinkonzentration. 10- bis 30-fache Verdünnungen von Proteinlysat sind ideal für einen BCA-Test.
11. Aliquot die Probe in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhren und lagern Sie bei -80 °C vor einer weiteren Analyse.

Representative Results

Hier zeigen wir eine repräsentative Gelbildvisualisierung von RNA, die aus Vorderpfoten von CIA-Mäusen extrahiert wurde, in Abbildung 2A. Die 28S rRNA und das 18S rRNA-Band zeigen an, dass alle Proben eine ausreichende Menge an intakter RNA haben. Als Nächstes zeigen wir in Abbildung 2Beine repräsentative Streuungsdiagramm der gesamten Proteinkonzentrationen auf der Grundlage der Protein-BCA-Analyse. Die Gesamtproteinkonzentrationen von naiven Mäusen, CIA-Mäusen oder CIA-Mäusen unter verschiedenen Behandlungen sind gruppenübergreifend vergleichbar. Zur Bestimmung der Konzentrationen von entzündlichen Zytokinen und Chemokinen im Proteinextrakt wurden Luminex-Analysen durchgeführt. Wir zeigen eine repräsentative Streuungsdarstellung der Konzentrationen normalisierter Zytokine und Chemokine (pg/mg-Gesamtprotein) in Abbildung 2C. Im Vergleich zu naiven Mäusen sind mehrere Zytokine bei CIA-Mäusen erhöht und die Behandlung mit Anti-IL17A-Antikörpern hemmt die Produktion mehrerer Zytokine signifikant. Um Transkriptome-Änderungen in CIA und behandlungsbedingten Effekten zu bewerten, wurde eine Mikroarray-Analyse durchgeführt. Wir zeigen eine repräsentative Heatmap-Diagramm von Genen deutlich erhöht bei CIA-Mäuseim Vergleich zu naiven Mäusen in Abbildung 2D.

Abbildung 1: Ausrüstung, die zum Pulverisieren von murinen Pfoten benötigt wird. (A) Entzündete oder entzündete Pfoten von CIA oder naiven Mäusen. (B) Flüssigstickstoff Dewar, der verwendet wird, um das Edelstahlbad der Gefriermühle zu füllen. (C) Montierter Gefrierrohrsatz. (D) Gefrierrohröffner. (E) Pulverisiertes Gewebe aus murinen Pfoten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Repräsentative Daten zur Analyse von Protein und RNA aus pulverisierten murinen Pfoten. (A) Gelbildvisualisierung der RNA-Integrität. (B) Gesamtproteinkonzentrationen aus verschiedenen Gruppen. (C) Chemokin und Zytokinexpression (Luminex) aus verschiedenen Gruppen. (D) Hierarchische Clustering-Heatmap der Mikroarray-Analyse aus verschiedenen Behandlungsgruppen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Obwohl es starke wissenschaftliche Gründe für die Bewertung molekularer Pfade in Synovialgeweben gibt, konzentrierten sich viele Berichte über die Immunprofilierung des murinen CIA-Modells auf peripheres Blut, während Protein- und RNA-Analysedaten von entzündeten Pfoten eher begrenzt sind. Es gibt mehrere mögliche Gründe für diese Voreingenommenheit: murine Sprunggelenke sind nicht größer als 2 cm; Die betroffenen Bereiche bestehen aus Haut-, Knochen- und Bindegeweben, die mit traditionellen Methoden wie Gewebeschleifer, Stößel und Mörtel, Kieselsäureperlenstörung, Trituration oder enzymatische Verdauung oft schwer zu homogenisieren sind. Diese Methoden führen in der Regel zu unvollständiger Homogenisierung, geringer Protein- oder RNA-Ausbeute oder inkonsistenter Qualität aufgrund des proteolytischen und nukleinsäureabbauenden Abbaus. Das hier beschriebene robuste Verfahren bietet ein detailliertes Verfahren zur Erzeugung eines homogenen pulverisierten gefrorenen Pulvers, um nachgelagerte proteomische und transkriptionelle Profilierungsbemühungen zu ermöglichen, molekulare Signaturen von Krankheiten aus einer einzigen einheitlichen Probe herzustellen. Quelle.

Bei der Ausführung dieser Methode sollten mehrere kritische Schritte berücksichtigt werden. Erstens sollten murine Pfoten an der Felllinie während der Gewebeernte geschnitten werden und große Mengen an Haaren sollten vermieden werden. Übermäßiges Haar kann Spalten während der RNA-Extraktion verstopfen und die Proteinextraktion stören. Zweitens sollten Tuben, Zangen und Spachtel während des gesamten Verfahrens auf Trockeneis gehalten werden, da erhöhte Temperaturen in Gewebepulvern das Material schnell in amorphen "Schlamm" verwandeln und die Integrität von Protein und RNA beeinträchtigt wird. Drittens sollte die Menge an Gewebepulver, die für die Protein- oder RNA-Extraktion verwendet wird, sorgfältig optimiert werden. Mehr Gewebepulver kann nicht immer eine höhere Ausbeute bieten, kann aber zusätzliche Probleme in der nachgelagerten Verarbeitung verursachen, einschließlich verstopfender RNA-Isolationssäulen, die das DNase/DNA-Verhältnis verändern (wenn dieser Schritt angewendet wird), um einen vollständigen DNA-Abbau zu verhindern. Schließlich sollte die Normalisierung des Protein- und RNA-Eintrags ein integraler Bestandteil der Workflow- und Datenanalyse sein. Die Variabilität der Gewebebelastung kann Veränderungen des relativen Protein- und RNA-Spiegels erheblich maskieren. Neben der Gesamtprotein- oder Gesamt-RNA kann die Expression von Haushaltsgenen auch als Anker für die Normalisierung betrachtet werden.

Durch umfangreiche Test- und Fehlerprozesse haben wir einige potenzielle häufige Probleme für Erstanwender dieser Methode identifiziert. Es kann eine geringe Ausbeute an RNA geben. Dies ist oft das Ergebnis einer Überlastung der Säule mit zu viel Gewebeextrakt. Die Menge des Gewebes pro Säule und das Verhältnis von RLT/Pulver sind entscheidend für effiziente RNA-Isolierungen. Wir haben festgestellt, dass einige kommerzielle 96-Well-Extraktionskits für diesen Prozess möglicherweise nicht funktionieren, da sich die Proben nicht mit einer entsprechenden Rate durch die Säule drehen, wodurch diese Proben in nachgelagerten Wasch- und Elutionsschritten beeinträchtigt werden. Es kann eine hohe Variabilität der Proteinkonzentration in der BCA-Analyse und Zytokinkonzentrationen in der Luminex-Analyse geben. Wenn es keine Probleme mit dem BCA oder dem Luminex-Prozess gibt, Wird es in der Regel durch Fett oder andere Verunreinigungen im Proteinextrakt verursacht. Es ist wichtig, die Fettschicht an der Oberseite oder unlösliche Materie am Boden der Mikrozentrifugenröhrchen zu vermeiden, wenn sie für die Proteinextraktion geerntet wird. Wiederholen Sie bei Bedarf die Drehung und sammeln Sie Überstand für die nachgelagerte Analyse.

Da diese Methode eine spezialisierte kryogene Gefriermühle und große Mengen trockeneis und flüssigen Stickstoffumfasst umfasst, sollten zusätzliche Sicherheitsmaßnahmen in Betracht gezogen werden. Die richtige persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Schutzbrillen, Labormäntel und kryogene Handschuhe, sollte immer getragen werden, um mögliche Frostverbrennungen und Verletzungen durch Explosionen zu verhindern. Die Erzeugung von Aerosolen sollte ebenfalls minimiert werden und die Verwendung von belüfteten Waagengehäusen wird empfohlen. Schließlich sollte, ähnlich wie bei allen anderen Protokollen, die mit tierischem Gewebe umgehen, darauf geachtet werden, dass alle nicht verwendeten Gewebeproben ordnungsgemäß entsorgt werden, während wiederverwendbare Schläuche vor der Reinigung dekontaminiert werden müssen.

Obwohl die Methode viele Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden hat, birgt sie noch einige Einschränkungen. Das Transkriptomprofil einer murinen ganzen Pfote überschneidet sich signifikant mit dem Transkriptomprofil aus der menschlichen Synovialbiopsie (Daten nicht gezeigt). Zusätzliche mRNA aus Muskel, Haut und Knochenmark könnten die Signale aus Synovialgewebe verdünnen. Eine alternative Lösung besteht darin, murines Synovialgewebe durch Lasermikrodissektion zu sammeln, das an OCT-eingebetteten Mausgelenken durchgeführt werden kann. Allerdings begrenzt der geringe Durchsatz und die relativ geringe Gewebemenge die breite Anwendung für die Lasermikrosektion. Darüber hinaus ist diese Methode auch bei erheblicher Automatisierung noch recht arbeitsintensiv. Es dauert mindestens 8 h, um 30-60 Proben mit Hilfe von 3-4 Ermittlern zu verarbeiten. Schließlich erfordert dieses Verfahren große Mengen an flüssigem Stickstoff (10-15 L für die Verarbeitung von 30-60 Proben).

In der vorhergehenden Methodenbeschreibung wurde die Auswertung proteomischer und transkriptionaler Endpunktanalysen nachgewiesen. Jedoch, zusätzlicher Endpunkt, wie Lipidomic, Metabolomik und kleine RNA-Profiling könnte von Interesse für die breitere Arthritis-Forschungsgemeinschaft sein.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mm stainless steel bead	Qiagen	69989
beta-mercaptoethanol	Sigma	M6250	Sample reducing agent that inhibits RNASE enzymes
Bioanalyzer Kit	Agilent	5067-1511	RNA qualification kit
b-mercaptoethanol	Sigma	M6250
Cell Culture Grade Water	Corning	25-055-CI	Water
Cell lysis stock solution	Cell Signaling	9803
Eppendorf Tube	Eppendorf	22363204	Microfuge tubes
Eppendorf tube centrifuge box	Nalgene	5055	Box for holding eppendorf tubes in horizontal tube arrangement
Everlast 247 Variable Speed Rocker	Benchmark Scientific	BR5000
Freezer Mill	Spex Sample Prep	6875	Freezer/Mill for processing paws into pulverized powder
Grinding Vial	Spex Sample Prep	6801	Polycarbonate vial for processing paws into pulverized powder
Pierce BCA kit	Pierce	23225	Kit for Total Protein Quantification
Protease Inhibitor Cocktail set 1	Calbiochem	539131	Protease Inhibitors
Protein BCA Kit	Pierce	23225
Quantigene Kit	Thermofisher	QP1013	bDNA analysis Kit
Refrigerated microcentrifuge	Eppendorf	5417R	Centrifugation
RLT Buffer	Qiagen	79216	RNA extraction buffer
RNeasy mini kit	Qiagen	74104	including RNeasy column, RLT Buffer and RW1 Buffer
Shaker	Benchmark Scientific	BR5000	Rocker/Shaker
Spatula	VWR	10806-412	Spatula for powder transfer
Stainless Steel Bead	Qiagen	69989	Bead for mixing during protein extraction
Tube Extractor	Spex Sample Prep	6884	Extractor for removing the top of grinding vial
Vortexer	VWR	10153-838	Sample mixing