En Cryo-pulverization protokol til behandling af muse poter til at evaluere molekylære veje af vævs betændelse i en kollagen induceret arthritis model

Summary

En kryogen pulverisering metode til at behandle murine poter ved hjælp af en flydende kvælstof fryser mølle blev udviklet for at forbedre udbyttet og kvaliteten af RNA eller protein udvundet fra væv og gøre det muligt at analysere molekylære profiler forbundet med inflammatoriske Svar.

Abstract

Profilering af molekylære ændringer i lokalt væv er afgørende for at forstå virkningsmekanismen for terapeutiske kandidater in vivo. Inden for gigt forskning, mange undersøgelser er fokuseret på betænd leddene, der er sammensat af en kompleks blanding af knogler, brusk, muskel, stromale celler og immunceller. Her etablerede vi en pålidelig og robust mekanisk metode til at forstyrre inflammeret muse poter i homogene pulveriserede prøver i et kryogenisk kontrolleret miljø. Protein-og RNA-lysater blev behandlet for at muliggøre proteomiske og transkriptionelle endepunkter og molekylær karakterisering af relevante sygdoms veje i lokalt væv.

Introduction

Reumatoid arthritis (RA) er en kronisk systemisk inflammatorisk sygdom med persisterende symmetrisk synovitis i leddene og ekstra artikulær involvering af organer som hud, hjerte, lunger og øjne¹. Selv om de systemiske manifestationer af immunresponset er tydelige hos mennesker, er et af kendetegnene ved RA-patologi infiltration af immunceller i vævet i synovialvæv og proliferation af synovial fibroblast celler².

Svarende til human RA, mus kollagen induceret arthritis (CIA) model fremkalder stærk vævs betændelse med aktive immunrespons i synovialvæv og systemiske rum. Følsomheden af forskellige muse stammer til CIA model links til større histocompatibility Complex (MHC) haplotype og antigen specifikke T celle og B celle interaktioner^3,4. Desuden, mange patogene veje i human RA, herunder autoantistof produktion, immunkompleks deposition, myeloid celle aktivering, polyartikulære manifestationer og pannus dannelse med synovial immun infiltration, er også tydeligt i denne model ^5,6. Efterforskere har anvendt denne veletablerede CIA-model til at undersøge virkningerne af antiinflammatoriske cytokinbehandlinger⁷. Mange biologiske lægemidler godkendt til autoimmune eller inflammatoriske sygdomme, såsom anti-tnfα og anti-Il-6, er fundet at være effektive i CIA model^8,9.

Profilering interaktioner af immunsystemet i synovialvæv er afgørende for at belyse molekylære mekanismer forbundet med patogenesen af RA. I den humane kliniske indstilling, en almindelig praksis er at udføre nåle synovial biopsier under vejledning af ultralyd Imaging. I de prækliniske indstillinger, den mindre arkitektur af murine leddene gør biopsi procedurer meget vanskeligere, hvis ikke umuligt. For nylig demonstrerede vi udnyttelsen af murine CIA-modellen for at evaluere kombinationer af lægemidler til at påvirke forskellige slutpunkter og løse sygdomme i en kombinatorisk tilgang¹⁰. En kryogen fryse mølle-baseret pulverisering metode blev anvendt til at behandle bettet murine poter i homogene fine pulvere og etablerede downstream processer til at udtrække RNA og proteiner. Denne metode beskytter RNA og protein fra enzymatiske og kemiske degrative processer og gør det muligt for os at anvende flere analytiske metoder til en enkelt homogeniseret prøve kilde.

Protocol

Alle dyreforsøg blev gennemført i overensstemmelse med de politikker, der er foretaget af det institutionelle udvalg for dyrepasning og-anvendelse (IACUC) af Janssen R & D.

1. kryogen fryse mølle-baserede Pulverization metode

1. Ved afslutningen af CIA-studiet, ofrer mus med 1,5% isofluran efterfulgt af livmoderhals dislokation.
2. På dagen for vævs behandling, pre-chill alle instrumenter (spatler, slibning hætteglas, etc.) på tøris i mindst 10 min. bær termiske handsker for at undgå frostskader.
3. Skær bagpoter med en saks på pels linjen som afbildet i figur 1a.
4. Overfør hver pote til et 1,5 mL mikrocentrifuge glas, snap fryse i flydende nitrogen straks, og opbevar frosne poter ved-80 °C. Opbevar ikke prøver, som er frosset i mere end en uge.
5. Fyld fryse møllen med flydende nitrogen som vist i figur 1B , og lad det ækvibrere i mindst 10 minutter.
6. Opbevar uforarbejdet prøve på tøris og undgå frost-tø-cyklusser.
7. Overfør en bagpote til forkølet stort polycarbonat-slibe hætteglas med et bund stålstik, sæt den forkølede stål impaktor og luk hætteglasset med polycarbonat med det præ-afkølede stålstik (figur 1C).
8. Overfør store hætteglas med polycarbonat med prøverne i fryse møllen fyldt med væske, og luk låget med gummi låsen, som findes foran på instrumentet.
9. Lad prøverne køle af i flydende nitrogen i 1 minut.
10. Indstil fryse møllen til 1 minut-programmet med 10 cyklusser pr. sekund, og tryk på Start-knappen. Vent til fryse møllen til at fuldføre sin cyklus.
    Bemærk: Maskinen laver en tromme lyd, når stål impaktoren bevæger sig frem og tilbage. Brug ørepropper for at undgå høretab.
11. Åbn låget på fryse møllen, tag det store hætteglas med polycarbonat ud, og Anbring det i en udsugning som vist i figur 1D. Fjern det øverste stålstik ved at lægge trykket nedad på det sorte håndtag, indtil stål proppen glider ud af polycarbonat røret.
12. Overfør det åbnede store hætteglas med polycarbonat til tøris. Fjern stål impaktoren med forkølet pincet.
13. Det frosne pulver overføres til forkølet 50 mL konisk rør.
14. Vægt 30-50 mg frosset pulver til en tareret frosset 1,5 mL mikrocentrifuge slange til RNA-ekstraktion og 100-200 mg frossen pulver til proteinekstraktion.
    Bemærk: Det frosne pulver skal se ud som hvidt eller lyse rødt fint sand som afbildet i figur 1E.
15. Opbevar pulveriserede prøver ved-80 °C og Fortsæt til RNA og protein isoleringer inden for 24 timer.

2. RNA-ekstraktion

1. Tilsæt 10 μL β-mercaptoethanol (β-ME) pr. 1 mL RLT-buffer.
2. Beregn volumen af RLT buffer svarende til et forhold på 23,3 mL/mg væv og tilsæt passende volumen RLT buffer med β-ME til røret med frossen pulver. Dette forhold var empirisk fast besluttet på at være ideel til muse poter.
3. Vortex prøven ved 3.000 RPM i 10 s.
4. Bland godt ved pipettering op-og-ned 10 gange energisk med en 1 mL pipettor.
5. Vortex prøven igen ved 3.000 RPM for 20 s.
6. Centrifuger røret ved 13.000 x g i 2 min.
7. Overfør 700 μL af Supernatanterne til et friskt rør, og tilsæt 700 μL 70% ethanol.
   Bemærk: Hvis < 700 μL er i røret, er det acceptabelt at fortsætte, stadig tilføje tilsvarende volumen 70% ethanol.
8. Læg 700 μL af prøven på en RNA-oprensnings søjle.
9. Centrifuger røret ved ≥ 10.000 x g i 30 s.
10. Kassér gennemstrømningen, og Indlæs den resterende del af prøven i kolonnen RNeasy.
11. Centrifuger røret ved ≥ 10.000 x g i 30 s.
12. Kassér flowet igennem og vask kolonnen ved at tilsætte 700 μL RW1 buffer ved centrifugering ≥ 10.000 x g i 30 s. Hvis der udføres option DNASE fordøjelse, tilsættes 350 μL af RW1 før behandling med DNASE.  Og yderligere 350 μL RW1 tilsættes efter behandling med DNASE.
13. Valgfrit) Udfør et DNase-fordøjelses trin Følg producentens anvisninger.
14. Røret vaskes to gange ved tilsætning af 500 μL RPE-buffer efterfulgt af centrifugering ved ≥ 10.000 x g i 30 s. kassér strømmen gennem hver gang.
15. Kolonnen tørres ved centrifugering ved ≥ 10.000 x g i 2 min.
16. Elute RNA ved tilsætning af 50 μL vand med centrifugering ved ≥ 10.000 x g i 2 min. Saml strømmen gennem og Overfør til et nyt 1,5 ml rør.
17. Bestem mængden af RNA ved hjælp af forskeren metode til valg og opbevares ved-80 °C før yderligere analyse.

3. protein udvinding

1. Fortyndet 10x cellelyse stamopløsning i 1x cellelyse stamopløsning ved hjælp af cellekultur kvalitet vand.
2. Rekonstruere den proteasehæmmer cocktail sæt I med 1 mL vand til at gøre en 100x proteasehæmmer bestand.
3. Tilsæt 100 μL proteasehæmmer til 9,9 mL 1x celle lysis for at lave en 1x endelig stamopløsning.
4. Tilsæt 4 μL iskold 1x Cellelyse buffer pr. mg vævs pulver (f. eks. 800 μL lysis-buffer til 200 mg vævs pulver).
5. Tilsæt en 5 mm rustfrit stål perle til røret.
6. Vortex røret ved 3.000 RPM for 60 s. Overfør røret til våd is og Fortsæt til næste prøve.
7. Anbring alle prøverørene i en æske, og ryst centrifugerboksen på en rocker ved 1.000 RPM, 4 °C i 1 time.
   Bemærk: Forskerne kan finde, at placere boksen lodret kan lette bedre blanding med Perlen.
8. Rørene centrifugeres ved 10.000 x g og 4 °c i 15 minutter.
9. Overfør Supernatanterne til et friskt rør og undgå fedtlaget på toppen.
10. Bestemme den totale proteinkoncentration. 10 til 30 gange fortyndinger af proteinlysat er ideelle til en BCA test.
11. Prøven udtages til 1,5 mL mikrocentrifuge glas og opbevares ved-80 °C før yderligere analyse.

Representative Results

Her viser vi en repræsentativ gel billede visualisering af RNA udvundet fra forreste poter af CIA-mus i figur 2a. 28S rRNA og 18S rRNA-båndet indikerer, at alle prøver har tilstrækkelig mængde intakt RNA. Dernæst viser vi en repræsentativ scatter plot af samlede proteinkoncentrationer baseret på protein BCA analyse i figur 2B. Totale proteinkoncentrationer fra naive mus, CIA-mus eller CIA-mus under forskellige behandlinger er sammenlignelige på tværs af grupper. For at bestemme koncentrationerne af inflammatoriske cytokiner og kemo okiner i protein ekstrakten blev Luminex-analyser udført. Vi viser en repræsentativ scatter plot af koncentrationerne af normaliserede cytokiner og kemo okiner (PG/mg total protein) i figur 2C. Sammenlignet med naive mus er flere cytokiner forhøjede i CIA-mus, og behandling med anti-IL17A-antistoffer hæmmer signifikant produktionen af flere cytokiner. For at evaluere transkriptomændringer i CIA og behandlingsrelaterede effekter, blev der udført mikroarray analyse. Vi viser en repræsentativ heatmap plot af gener signifikant øget i CIA mus sammenlignet med naive mus i figur 2D.

Figur 1: nødvendigt udstyr til at pulverisere murine poter. (A) bettet eller ubetøjede poter fra CIA eller naive mus. B) flydende kvælstof Dewar, der anvendes til at fylde fryse møllen i rustfrit stål. C) monteret fryse mølle slange sæt. (D) fryser mølle tube åbner. E) pulveriseret væv fra murine poter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: repræsentative data om analyse af protein og RNA fra pulveriserede murine poter. A) gel-billed VISUALISERING af RNA-integritet. B) samlede proteinkoncentrationer fra forskellige grupper. (C) chemokin og cytokinekspression (Luminex) fra forskellige grupper. (D) hierarkisk klyngedannelse af heatmap for mikroarray analyse fra forskellige behandlingsgrupper. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Selv om der er stærke videnskabelige rationale til at evaluere molekylære veje i synovialvæv, mange rapporter om immun profilering af murine CIA model var fokuseret på perifert blod, mens protein og RNA analysedata af betonede poter er temmelig begrænset. Der er flere mulige årsager til denne skævhed: murine ankel leddene er ikke større end ~ 2 cm; de berørte områder består af hud, knogler og bindevæv, som ofte er svære at homogenisere ved hjælp af traditionelle metoder som vævs slibemaskiner, Pestle og mørtel, nedbrydning af silica-perler, formalings eller enzymatisk fordøjelse. Disse metoder resulterer typisk i ufuldstændig homogenisering, lavt protein-eller RNA-udbytte eller inkonsistent kvalitet på grund af proteolytisk og nukleinsyre nedbrydning. Den robuste metode, der beskrives heri, giver en detaljeret procedure til at generere et homogent pulveriseret frossen pulver, der gør det muligt for downstream-proteomiske og transkriptionelle profilerings bestræbelser at etablere molekylære underskrifter fra en enkelt ensartet prøve Kilde.

Der bør tages hensyn til flere kritiske trin, når denne metode udføres. For det første skal murine poter skæres ved pels linjen under vævs høst, og store mængder hår bør undgås. Overdreven hår kan tilstoppe søjler under RNA ekstraktion og interferere med protein udvinding. For det andet bør rør, tang og spatler holdes på tøris under hele proceduren, fordi forhøjet temperatur i vævs pulvere hurtigt vil vende materialet til amorfe "mudder" og integriteten af protein og RNA vil blive kompromitteret. For det tredje bør mængden af vævs pulver, der anvendes til protein-eller RNA-ekstraktion, optimeres omhyggeligt. Mere vævs pulver kan ikke altid give højere udbytte, men kan forårsage yderligere problemer i downstream-behandlingen, herunder tilstopning af RNA-isolations kolonner, ændring af DNase/DNA-forholdet (hvis dette trin er ansat) for at forhindre fuldstændig DNA-nedbrydning. Endelig bør normalisering af protein-og RNA-input være en integreret del af arbejdsprocessen og dataanalysen. Variabilitet i vævs belastningen kan i væsentlig grad maskere ændringer i det relative protein-og RNA-niveau. Ud over total protein eller total RNA kan ekspression af husholdnings gener også betragtes som ankre til normalisering.

Gennem omfattende trial and error proces, har vi identificeret nogle potentielle hyppige problemer for førstegangsbrugere af denne metode. Der kan være lavt udbytte af RNA. Dette er ofte et resultat af overbelastning kolonnen med for meget vævs ekstrakt. Mængden af væv pr. kolonne og forholdet mellem RLT/pulver er afgørende for effektiv RNA isoleringer. Vi har konstateret, at nogle kommercielle 96 brønd ekstraktions kits ikke kan arbejde for denne proces, da prøverne ikke vil spinne gennem kolonnen med en tilsvarende hastighed, og dermed kompromittere disse prøver i downstream vask og elueringstrin. Der kan være stor variation i proteinkoncentrationen i BCA analyse og cytokin koncentrationer i Luminex analyse. Hvis der ikke er problemer med BCA eller Luminex processen, det er typisk forårsaget af fedt eller andre forurenende stoffer i proteinekstrakt. Det er vigtigt at undgå fedtlag på toppen eller uopløseligt stof i bunden af mikrocentrifuge rørene, når høst til protein udvinding. Hvis det er nødvendigt, gentages spin og indsamle supernatanter til downstream-analyse.

Da denne metode omfatter en specialiseret kryogen fryse mølle og store mængder tøris og flydende nitrogen, bør der tages hensyn til yderligere sikkerhedsforanstaltninger. Korrekt personligt beskyttelsesudstyr, herunder sikkerhedsbriller, laboratorie frakker og kryogene handsker, bør altid bæres for at forhindre potentielle frost forbrændinger og tilskadekomst på grund af eksplosion. Generering af aerosoler bør også minimeres, og brug af ventilerede balance kabinetter tilrådes. Endelig, svarende til andre protokoller, der håndterer animalsk væv, bør der udvises forsigtighed for korrekt bortskaffelse af alle ubrugte vævsprøver, mens genanvendelige rør skal dekontamineres før rengøring.

Mens metoden har mange fordele i forhold til konventionelle metoder, det stadig havne nogle begrænsninger. Transkriptomen profil fra en murine hele pote betydeligt overlapper med transcriptome profil fra Human synovial biopsi (data ikke vist). Yderligere mRNA fra muskler, hud og knoglemarv kan fortynde signalerne fra synovialvæv. En alternativ løsning er at indsamle murine synovialvæv gennem laser microdissection, som kan udføres på OLT indlejrede muse samlinger. Men, lav gennemløb og den relativt lille mængde af væv begrænser den brede anvendelse til laser microdissection. Desuden, selv med betydelig automatisering, denne metode er stadig ganske arbejdskraftintensiv. Det tager mindst 8 h at behandle 30-60 prøver ved hjælp af 3-4 efterforskere. Endelig, denne metode kræver store mængder af flydende nitrogen (~ 10-15 L til forarbejdning 30-60 prøver).

I den foregående metodebeskrivelse blev vurderingen af proteomiske og transkriptionelle endepunkts analyser påvist. Men, yderligere endepunkt, såsom lipidomic, metabolomics og lille RNA profilering kunne være af interesse for bredere gigt forskning samfund.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mm stainless steel bead	Qiagen	69989
beta-mercaptoethanol	Sigma	M6250	Sample reducing agent that inhibits RNASE enzymes
Bioanalyzer Kit	Agilent	5067-1511	RNA qualification kit
b-mercaptoethanol	Sigma	M6250
Cell Culture Grade Water	Corning	25-055-CI	Water
Cell lysis stock solution	Cell Signaling	9803
Eppendorf Tube	Eppendorf	22363204	Microfuge tubes
Eppendorf tube centrifuge box	Nalgene	5055	Box for holding eppendorf tubes in horizontal tube arrangement
Everlast 247 Variable Speed Rocker	Benchmark Scientific	BR5000
Freezer Mill	Spex Sample Prep	6875	Freezer/Mill for processing paws into pulverized powder
Grinding Vial	Spex Sample Prep	6801	Polycarbonate vial for processing paws into pulverized powder
Pierce BCA kit	Pierce	23225	Kit for Total Protein Quantification
Protease Inhibitor Cocktail set 1	Calbiochem	539131	Protease Inhibitors
Protein BCA Kit	Pierce	23225
Quantigene Kit	Thermofisher	QP1013	bDNA analysis Kit
Refrigerated microcentrifuge	Eppendorf	5417R	Centrifugation
RLT Buffer	Qiagen	79216	RNA extraction buffer
RNeasy mini kit	Qiagen	74104	including RNeasy column, RLT Buffer and RW1 Buffer
Shaker	Benchmark Scientific	BR5000	Rocker/Shaker
Spatula	VWR	10806-412	Spatula for powder transfer
Stainless Steel Bead	Qiagen	69989	Bead for mixing during protein extraction
Tube Extractor	Spex Sample Prep	6884	Extractor for removing the top of grinding vial
Vortexer	VWR	10153-838	Sample mixing