Une méthode cryogénique de pulvérisation pour traiter les pattes murines à l’aide d’une usine de congélation à azote liquide a été mise au point pour améliorer le rendement et la qualité de l’ARN ou des protéines extraits des tissus et permettre l’analyse des profils moléculaires associés aux Réponses.
Le profilage des changements moléculaires dans les tissus locaux est crucial pour comprendre le mécanisme d’action des candidats thérapeutiques in vivo. Dans le domaine de la recherche sur l’arthrite, de nombreuses études sont axées sur les articulations enflammées qui sont composées d’un mélange complexe d’os, de cartilage, de muscle, de cellules stromales et de cellules immunitaires. Ici, nous avons établi une méthode mécanique fiable et robuste pour perturber les pattes de souris enflammées en échantillons pulvérisés homogènes dans un environnement cryogéniquement contrôlé. Des lysates de protéine et d’ARN ont été traités pour permettre des paramètres protéomiques et transcriptionnels et la caractérisation moléculaire des voies pertinentes de la maladie dans les tissus locaux.
La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie inflammatoire systémique chronique avec une synovite symétrique persistante dans les articulations et une implication articulaire supplémentaire d’organes tels que la peau, le cœur, les poumons et les yeux1. Bien que les manifestations systémiques de la réponse immunitaire soient évidentes dans les patients humains, une des caractéristiques de la pathologie de RA est l’infiltration des cellules immunitaires dans le tissu synovial et la prolifération des cellules synovials de fibroblaste2.
Semblable à la RA humaine, le modèle induit par l’arthrite de collagène de souris (CIA) suscite l’inflammation forte de tissu avec des réponses immunitaires actives dans les tissus synovials et les compartiments systémiques. La susceptibilité des différentes souches de souris aux liens de modèle de CIA au complexe d’histocompatibilité majeure (MHC) haplotype et antigène spécifiques interactions de cellules T et b de cellules3,4. En outre, beaucoup de voies pathogènes dans la RA humaine, y compris la production d’autoantibody, le dépôt complexe immunisé, l’activation de cellules myéloïdes, les manifestations polyarticulaires et la formation pannus avec l’infiltration immunisée synovial, sont également évidentes dans ce modèle 5,6. Les enquêteurs ont utilisé ce modèle bien établi de la CIA pour étudier les effets des traitements anti-inflammatoires cytokine7. Beaucoup de produits biologiques approuvés pour les maladies auto-immunes ou inflammatoires, tels que l’anti-TNF et anti-IL-6, se sont avérés efficaces dans le modèle de la CIA8,9.
Le profilage des interactions du système immunitaire dans le tissu synovial est crucial pour élucider les mécanismes moléculaires associés à la pathogénie de la polyarthrite rhumatoïde. Dans le cadre clinique humain, une pratique courante est d’effectuer des biopsies synoviales d’aiguille sous la conduite de l’imagerie par ultrasons. Dans les milieux précliniques, la plus petite architecture des articulations murines rend les procédures de biopsie beaucoup plus difficiles, voire impossibles. Récemment, nous avons démontré l’utilisation du modèle de la CIA murine pour évaluer les combinaisons de médicaments pour avoir un impact sur les points finaux disparates et résoudre la maladie dans une approche combinatoire10. Une méthode cryogénique de pulvérisation à base de moulin de congélation a été employée pour transformer les pattes murine enflammées en poudres fines homogènes et les processus établis en aval pour extraire l’ARN et les protéines. Cette méthode protège l’ARN et les protéines contre les processus de dégrativement enzymatiques et chimiques et nous permet d’appliquer plusieurs méthodes analytiques à une seule source d’échantillon homogénéisée.
Bien qu’il existe une forte justification scientifique pour évaluer les voies moléculaires dans les tissus synovials, de nombreux rapports sur le profilage immunitaire du modèle de la CIA maurine ont été axés sur le sang périphérique, tandis que les données d’analyse des protéines et de l’ARN des pattes enflammées sont plutôt limitées. Il y a plusieurs raisons possibles à ce biais : les articulations de la cheville murine ne sont pas plus grandes que 2 cm; les zones touchées sont constituées de tissus cut…
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier Edith Janssen pour la critique du manuscrit et Navin Rao et Jennifer Towne pour leur soutien à la publication de ce manuscrit.
5 mm stainless steel bead | Qiagen | 69989 | |
beta-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Sample reducing agent that inhibits RNASE enzymes |
Bioanalyzer Kit | Agilent | 5067-1511 | RNA qualification kit |
b-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
Cell Culture Grade Water | Corning | 25-055-CI | Water |
Cell lysis stock solution | Cell Signaling | 9803 | |
Eppendorf Tube | Eppendorf | 22363204 | Microfuge tubes |
Eppendorf tube centrifuge box | Nalgene | 5055 | Box for holding eppendorf tubes in horizontal tube arrangement |
Everlast 247 Variable Speed Rocker | Benchmark Scientific | BR5000 | |
Freezer Mill | Spex Sample Prep | 6875 | Freezer/Mill for processing paws into pulverized powder |
Grinding Vial | Spex Sample Prep | 6801 | Polycarbonate vial for processing paws into pulverized powder |
Pierce BCA kit | Pierce | 23225 | Kit for Total Protein Quantification |
Protease Inhibitor Cocktail set 1 | Calbiochem | 539131 | Protease Inhibitors |
Protein BCA Kit | Pierce | 23225 | |
Quantigene Kit | Thermofisher | QP1013 | bDNA analysis Kit |
Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | Centrifugation |
RLT Buffer | Qiagen | 79216 | RNA extraction buffer |
RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | including RNeasy column, RLT Buffer and RW1 Buffer |
Shaker | Benchmark Scientific | BR5000 | Rocker/Shaker |
Spatula | VWR | 10806-412 | Spatula for powder transfer |
Stainless Steel Bead | Qiagen | 69989 | Bead for mixing during protein extraction |
Tube Extractor | Spex Sample Prep | 6884 | Extractor for removing the top of grinding vial |
Vortexer | VWR | 10153-838 | Sample mixing |