Ein Kryo-Pulverisierungsprotokoll zur Verarbeitung von Mauspfoten zur Bewertung molekularer Wege von Gewebeentzündungen in einem Kollagen-induzierten Arthritis-Modell
Summary
Eine kryogene Pulverisierungsmethode zur Verarbeitung von murinen Pfoten mit einer flüssigen Stickstoff-Gefriermühle wurde entwickelt, um die Ausbeute und Qualität der aus den Geweben extrahierten RNA oder Proteine zu verbessern und die Analyse molekularer Profile im Zusammenhang mit entzündlichen Antworten.
Abstract
Die Profilierung molekularer Veränderungen in lokalen Geweben ist entscheidend, um den Wirkmechanismus(en) der therapeutischen Kandidaten in vivo zu verstehen. Im Bereich der Arthritisforschung konzentrieren sich viele Studien auf entzündete Gelenke, die aus einer komplexen Mischung aus Knochen, Knorpel, Muskel, Stromalzellen und Immunzellen bestehen. Hier haben wir eine zuverlässige und robuste mechanische Methode etabliert, um entzündete Mauspfoten in homogenpulverisierte Proben in einer kryogen kontrollierten Umgebung zu stören. Protein- und RNA-Lysate wurden verarbeitet, um proteomische und transkriptionelle Endpunkte und die molekulare Charakterisierung relevanter Krankheitswege im lokalen Gewebe zu ermöglichen.
Introduction
Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine chronisch systemische entzündliche Erkrankung mit anhaltender symmetrischer Synovitis in den Gelenken und extra artikulärer Beteiligung von Organen wie Haut, Herz, Lunge und Augen1. Obwohl die systemischen Manifestationen der Immunantwort bei menschlichen Patienten offensichtlich sind, ist eines der Kennzeichen der RA-Pathologie die Infiltration von Immunzellen im Synovialgewebe und die Proliferation von synovialen Fibroblastenzellen2.
Ähnlich wie beim menschlichen RA löst das Modell der Mauskollagen-induzierten Arthritis (CIA) starke Gewebeentzündungen mit aktiven Immunantworten in Synovialgeweben und systemischen Fächern aus. Die Anfälligkeit verschiedener Mausstämme für CIA-Modellverbindungen mit DemInthek-Komplex (MHC) und antigenspezifischen T-Zell- und B-Zell-Wechselwirkungen3,4. Darüber hinaus sind viele pathogene Wege in der menschlichen RA, einschließlich der Autoantikörperproduktion, immunkomplexer Ablagerung, myeloische Zellaktivierung, polyartikulärer Manifestationen und Pannusbildung mit synovialer Immuninfiltration, in diesem Modell ebenfalls zu sehen. 5,6. Die Ermittler haben dieses etablierte CIA-Modell verwendet, um die Auswirkungen entzündungshemmender Zytokinbehandlungen zu untersuchen7. Viele Biologika, die für Autoimmun- oder entzündliche Erkrankungen zugelassen sind, wie Z.B. Anti-TNF und Anti-IL-6, werden im CIA-Modell8,9als wirksam befunden.
Die Profilierung der Wechselwirkungen des Immunsystems im Synovialgewebe ist entscheidend, um molekulare Mechanismen im Zusammenhang mit der Pathogenese von RA aufzuklären. Im klinischen Umfeld des Menschen ist es gängige Praxis, Nadelsynovialbiopsien unter Anleitung der Ultraschall-Bildgebung durchzuführen. In den präklinischen Umgebungen erschwert die kleinere Architektur der murinen Gelenke die Biopsieverfahren viel schwieriger, wenn nicht gar unmöglich. Kürzlich haben wir die Verwendung des murinen CIA-Modells demonstriert, um Kombinationen von Medikamenten zu bewerten, um unterschiedliche Endpunkte zu beeinflussen und Krankheiten in einem kombinatorischen Ansatz zu lösen10. Eine kryogene Gefrierwalzen-Pulverisierungsmethode wurde eingesetzt, um entzündete murine Pfoten zu homogenen Feinenpulvern zu verarbeiten und nachgelagerte Prozesse zur Extraktion von RNA und Proteinen zu etablieren. Diese Methode schützt RNA und Protein vor enzymatischen und chemischen Degrativen Prozessen und ermöglicht es uns, mehrere Analysemethoden auf eine einzige homogenisierte Probenquelle anzuwenden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Obwohl es starke wissenschaftliche Gründe für die Bewertung molekularer Pfade in Synovialgeweben gibt, konzentrierten sich viele Berichte über die Immunprofilierung des murinen CIA-Modells auf peripheres Blut, während Protein- und RNA-Analysedaten von entzündeten Pfoten eher begrenzt sind. Es gibt mehrere mögliche Gründe für diese Voreingenommenheit: murine Sprunggelenke sind nicht größer als 2 cm; Die betroffenen Bereiche bestehen aus Haut-, Knochen- und Bindegeweben, die mit traditionellen Methoden wie Gewebe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Edith Janssen für die kritische Überprüfung des Manuskripts und Navin Rao und Jennifer Towne für ihre Unterstützung der Veröffentlichung dieses Manuskripts.
Materials
| 5 mm stainless steel bead | Qiagen | 69989 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Sample reducing agent that inhibits RNASE enzymes |
| Bioanalyzer Kit | Agilent | 5067-1511 | RNA qualification kit |
| b-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Cell Culture Grade Water | Corning | 25-055-CI | Water |
| Cell lysis stock solution | Cell Signaling | 9803 | |
| Eppendorf Tube | Eppendorf | 22363204 | Microfuge tubes |
| Eppendorf tube centrifuge box | Nalgene | 5055 | Box for holding eppendorf tubes in horizontal tube arrangement |
| Everlast 247 Variable Speed Rocker | Benchmark Scientific | BR5000 | |
| Freezer Mill | Spex Sample Prep | 6875 | Freezer/Mill for processing paws into pulverized powder |
| Grinding Vial | Spex Sample Prep | 6801 | Polycarbonate vial for processing paws into pulverized powder |
| Pierce BCA kit | Pierce | 23225 | Kit for Total Protein Quantification |
| Protease Inhibitor Cocktail set 1 | Calbiochem | 539131 | Protease Inhibitors |
| Protein BCA Kit | Pierce | 23225 | |
| Quantigene Kit | Thermofisher | QP1013 | bDNA analysis Kit |
| Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | Centrifugation |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | RNA extraction buffer |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | including RNeasy column, RLT Buffer and RW1 Buffer |
| Shaker | Benchmark Scientific | BR5000 | Rocker/Shaker |
| Spatula | VWR | 10806-412 | Spatula for powder transfer |
| Stainless Steel Bead | Qiagen | 69989 | Bead for mixing during protein extraction |
| Tube Extractor | Spex Sample Prep | 6884 | Extractor for removing the top of grinding vial |
| Vortexer | VWR | 10153-838 | Sample mixing |
References
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