Summary
שיטה מתישה קריוגניים כדי לעבד כפות מורתיות באמצעות טחנת חנקן נוזלי המקפיא פותחה כדי לשפר את התשואה והאיכות של RNA או חלבון שחולצו מן הרקמות ולאפשר ניתוח של פרופילים מולקולריים הקשורים דלקתיות תגובות.
Abstract
יצירת פרופילים של שינויים מולקולריים ברקמות המקומיות חיונית להבנת המנגנון (ים) של פעולה של מועמדים טיפוליים בvivo. בתחום של מחקר דלקת פרקים, מחקרים רבים מתמקדים המפרקים דלקתית המורכבת תערובת מורכבת של עצם, סחוס, שריר, סטרומה תאים ותאים חיסוניים. כאן, הקמנו שיטה מכנית אמינה ואיתנה כדי לשבש כפות העכבר מודלק לתוך דגימות הומוגנית מרוסק בסביבה מבוקרת קריובית. חלבון ו-RNA lysates היו מעובדים כדי לאפשר את נקודות הקצה של פרוטאומית וטרנססקריפט ואפיון מולקולרי של מסלולים רלוונטיים למחלות ברקמה המקומית.
Introduction
דלקת מפרקים שיגרונית (RA) היא מחלה דלקתית כרונית מערכתית עם דלקת סימטרי מתמשך במפרקים ומעורבות נוספת של איברים כגון העור, הלב, הריאות, ועיניים1. למרות הביטויים מערכתית של התגובה החיסונית ניכרת בחולים אנושיים, אחד הסימנים ההיכר של הפתולוגיה RA הוא הסתננות של תאים חיסוניים ברקמת אמתחת והתפשטות של תאים מערכת פיברונובקבוקון2.
בדומה RA אנושי, העכבר קולגן המושרה דלקת מפרקים (CIA) מודל מעורר דלקת רקמה חזקה עם תגובות החיסון פעיל ברקמות אמתחת ו מערכתית תאים. הרגישות של זנים שונים של העכבר כדי CIA מודל קישורים לקומפלקס היסטליקציות העיקריים (mhc) haplotype ו אנטיגן מסוים תא T אינטראקציה עם תא2,4. בנוסף, מסלולים פתוגניים רבים ב-RA האנושי, כולל הפקת נוגדן אוטומטי, מורכבות החיסון המערכת, הפעלת תא מיאלואידית, ביטויים פוליפרגניים והיווצרות pannoבקבוקון עם חדירה חיסונית מערכת, הם גם ברור במודל זה 5,6. החוקרים המועסקים במודל זה מבוסס היטב CIA כדי לחקור את ההשפעות של טיפולי ציטוקין אנטי דלקתיות7. ביולוגי רבים מאושרים עבור מחלות אוטואימוניות או דלקתיות, כגון אנטי-tnfα ו anti-IL-6, נמצאים יעיל במודל ה-CIA8,9.
יצירת פרופיל האינטראקציות של המערכת החיסונית ברקמת אמתחת היא חיונית כדי להבהיר מנגנונים מולקולריים הקשורים בפתוגנזה של RA. בסביבה הקלינית האנושית, מנהג נפוץ הוא לבצע ביופסיות מערכת המחט תחת הדרכתו של הדמיה אולטרסאונד. בהגדרות טרום קלינית, הארכיטקטורה הקטנה של המפרקים murine עושה הליכים ביופסיה הרבה יותר קשה אם לא בלתי אפשרי. לאחרונה, הדגמנו את הניצול של הדגם murine CIA כדי להעריך שילובים של תרופות כדי להשפיע על נקודות קצה שונים ולפתור את המחלה בגישה קומבינטורית10. מקפיא ההקפאה טחנת המכונה שיטת הטחינה היה מועסק כדי לעבד כפות מורתיות מודלק לתוך אבקות בסדר הומוגנית והקימו תהליכי הזרם כדי לחלץ RNA וחלבונים. שיטה זו מגינה על RNA וחלבונים מתהליכים degrative מגמטיים וכימיים ומאפשרת לנו להחיל שיטות אנליטיות מרובות על מקור יחיד הומוגניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ניסויי החיות נערכו בהתאם למדיניות הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ולשימוש (IACUC) של ינסן R & D.
1. מקפיא קריוגני מיל מבוסס שיטת הטחינה
- בסיום מחקר ה-CIA, עכברים להקריב עם 1.5% isof, ואחריו פריקה צוואר הרחם.
- ביום עיבוד רקמות, מראש לצנן את כל המכשירים (מלקחיים, שחיקה בבקבוקונים, וכו ') על קרח יבש למינימום של 10 דקות. ללבוש כפפות תרמיות כדי למנוע נזק להקפיא.
- חותכים כפות אחוריות עם מספריים בקו הפרווה כמתואר באיור 1א.
- העבר כל כפה לתוך אחד 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה שפופרת, לעצור את ההקפאה בחנקן נוזלי מיד, ולאחסן כפות קפואות ב-80 ° c. אין לשמור על הדוגמיות מוקפאות ליותר משבוע אחד.
- מילוי טחנת המקפיא עם חנקן נוזלי כפי שמוצג באיור 1B ולתת לו לעבור לפחות 10 דקות.
- שמרו על דגימה לא מעובד על קרח יבש והימנעו מחזורים להפשיר.
- העברת אחד הרגליים האחוריות לתוך מקורר שחיקה פוליקרבונט גדול בקבוקון עם תקע הפלדה התחתונה, להכניס את impactor חקן טרום מקורר פלדה ולסגור את המבחנה פוליקרבונט שחיקה עם תקע העליון מקורר פלדה (איור 1ג).
- העברת שיוף פוליקרבונט גדול מבחנות עם דגימות לתוך טחנת המקפיא מראש מלא נוזל ולסגור את המכסה עם אבזם גומי נמצא בחזית המכשיר.
- תנו לדוגמיות להתקרר בחנקן נוזלי לדקה אחת.
- להגדיר את טחנת המקפיא לתוכנית 1 דקה עם 10 מחזורי לשנייה ולחץ על כפתור התחל. לחכות לטחנת המקפיא כדי להשלים את המחזור שלה.
הערה: המכונה גורמת לתיפוף להישמע כמו שחקן הפלדה נע הלוך ושוב. השתמש אטמי אוזניים כדי למנוע אובדן שמיעה. - פתח את המכסה של טחנת המקפיא, להוציא את המבחנה פוליקרבונט גדול שחיקה ולמקם אותו חולץ כפי שתוארה באיור 1D. הסר את תקע הפלדה העליון על-ידי הצבת לחץ כלפי מטה על הידית השחורה עד שהפלדה מחליק מתוך צינור הפוליקרבונט.
- להעביר את שפתוח פוליקרבונט גדול שחיקה בקבוקון על קרח יבש. להסיר את המדחף פלדה עם מלקחיים טרום מקורר.
- העבירו את האבקה הקפואה לצינור מקורר 50 mL.
- משקל 30-50 מ ג של אבקה קפואה לתוך שפופרת קפוא 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה להפקת RNA ו 100-200 מ"ג של אבקה קפואה להפקת חלבון.
הערה: האבקה הקפואה אמורה להיראות כמו לבנה או חול בהיר וורוד כמתואר באיור 1E. - לאחסן דגימות מרוסק ב-80 ° צ' ולהמשיך ל-RNA ולבודדים חלבון בתוך 24 h.
2. הפקת רנ א
- הוסף 10 μL של β-mercaptoethanol (β-ME) לכל 1 מ"ל של מאגר RLT.
- חישוב הנפח של מאגר RLT המתאים ליחס של 23.3 mL/mg של רקמות ולהוסיף את הנפח המתאים של מאגר RLT עם β-ME לצינור עם אבקה קפואה. יחס זה היה נחוש באופן אמפירי להיות אידיאלי עבור כפות העכבר.
- מערבולת המדגם ב 3,000 RPM עבור 10 s.
- מערבבים היטב על ידי ליטוף למעלה ולמטה 10 פעמים במרץ עם מצנעת 1 מ ל.
- מערבולת המדגם שוב ב 3,000 RPM עבור 20 s.
- צנטריפוגה את הצינור ב 13,000 x g עבור 2 דקות.
- העבר 700 μL של supernatants לצינור טרי ולהוסיף 700 μL של 70% אתנול.
הערה: אם < 700 μL הוא בתוך הצינור, זה מקובל להמשיך, עדיין הוספת כמות שווה של 70% אתנול. - טען 700 μL של המדגם לתוך טור טיהור של RNA.
- צנטריפוגה את הצינור ב ≥ 10,000 x g עבור 30 s.
- בטל את הזרימה וטען את החלק הנותר של הדגימה לעמודה RNeasy.
- צנטריפוגה את הצינור ב ≥ 10,000 x g עבור 30 s.
- למחוק את הזרימה ולשטוף את העמודה על ידי הוספת 700 μL של RW1 מאגר עם צנטריפוגה של ≥ 10,000 x g עבור 30 s. אם האפשרות ביצוע העיכול DNASE, 350 μL של RW1 מתווסף לפני הטיפול DNASE. וגם 350 μL נוספים של RW1 מתווסף לאחר הטיפול DNASE.
- אופציונלי) בצע צעד העיכול DNase בעקבות הוראות היצרן.
- לשטוף את הצינור פעמיים על ידי הוספת 500 μL של מאגר RPE ואחריו צנטריפוגה ב ≥ 10,000 x g עבור 30 s. להיפטר לזרום בכל פעם.
- יבש את העמודה על ידי צנטריפוגה ב ≥ 10,000 x g עבור 2 דקות.
- אליוט RNA על ידי הוספת 50 μL מים עם צנטריפוגה ב ≥ 10,000 x g עבור 2 דקות. לאסוף זרימה דרך ולהעביר לתוך הצינור החדש 1.5 mL.
- לקבוע את כמות ה-RNA בשיטת הבחירה של החוקר והחנות ב-80 ° c לפני ניתוח נוסף.
3. הפקת חלבון
- לדלל את הפתרון המניה 10x לפירוק תאים ב 1x לפירוק תא פתרון מניות באמצעות תרבות התא מים כיתה.
- מרכיבים מחדש את הקוקטייל פרוטאז מעכבי סט אני עם 1 מ ל של מים לעשות מלאי מעכב פרוטאז 100x.
- הוסף 100 μL של פרוטאז המעכב כדי 9.9 mL של 1 x הליזה לבצע פתרון מלאי הסופי 1x.
- הוסף 4 μL של קרח קר 1x מאגר לפירוק לרקמות mg (g., 800 μL של מאגר הליזה ל 200 מ ג של אבקת רקמות).
- הוסף אחד 5 מ"מ מפלדת אל חלד לצינור.
- מערבולת הצינור ב 3,000 RPM עבור 60 s. העבר את הצינור לקרח רטוב והמשך למדגם הבא.
- מניחים את כל הצינורות לדוגמה בתיבה ולנענע את תיבת צנטריפוגה על הנדנדה ב 1,000 RPM, 4 ° צ' עבור 1 h.
הערה: החוקרים עשויים לגלות כי הצבת תיבת אנכי יכול להקל על ערבוב טוב יותר עם חרוז. - צנטריפוגה את הצינורות ב 10,000 x g ו 4 ° צ' עבור 15 דקות.
- העבירו את הסופרנטנים לתוך צינורית טרייה והימנעו משכבת השומן בחלק העליון.
- קבע את ריכוז החלבון הכולל. 10 עד 30-הדילול של חלבון ליפוסט הם אידיאליים עבור מבחן BCA.
- מוסיף את המדגם לתוך 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה צינורות וחנות ב-80 ° צ' לפני ניתוח נוסף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאן, אנו מראים הדמיית תמונה מייצגת ג'ל של RNA שחולצו מן הכפות הקדמיות של עכברי ה-CIA באיור 2א. ה -28 rRNA ו-18 rRNA הלהקה מצביעים על כל הדגימות יש כמות מספקת של RNA שלם. לאחר מכן, אנו מציגים מגרש פיזור מייצג של ריכוזי חלבון סך מבוסס על ניתוח BCA חלבון באיור 2ב. ריכוזי חלבון מוחלטים מעכברים תמימים, עכברי CIA או עכברים מהסי. איי. אי תחת טיפולים שונים הם דומים לאורך קבוצות. כדי לקבוע את ריכוזי ציטוקינים דלקתיים ו נוגדנים בתמצית החלבון, ניתוח לומיקס נערכו. אנו מציגים מגרש פיזור מייצג של ריכוזים של ציטוקינים מנורמל ו נוגדנים (pg/mg הכולל חלבון) באיור 2ג. לעומת עכברים תמימים, ציטוקינים מספר מוגבה בעכברים CIA וטיפול עם נוגדן anti-IL17A מעכב באופן משמעותי ייצור של ציטוקינים מספר. כדי להעריך שינויים שנערכו ב-CIA ואפקטים הקשורים לטיפול, בוצע ניתוח microarray. אנו מראים מגרש החום נציג העלילה של גנים גדל באופן משמעותי בעכברי ה-CIA לעומת עכברים תמימים באיור 2ד.
איור 1: ציוד הדרוש לרסק כפות רגליים מורקיות. (א) מודלק או לא מודלקכפותמ-CIA או עכברים תמימים. (ב) חנקן נוזלי dewar השתמשו כדי למלא את האמבטיה נירוסטה של טחנת המקפיא. (ג) מורכב צינור מקפיא מפעל. (ד) מקפיא מטחנת שפופרת. (ה) התישה רקמות מכפות הידיים של מורלין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: נתונים מייצגים על ניתוח של חלבון ו-RNA מ כפות מורטין מרוסק. (א) ג'ל ויזואליזציה של התמונה של שלמות RNA. (ב) ריכוזי חלבון כולל מקבוצות שונות. (ג) כימוקין וביטוי ציטוקין (לומיקס) מקבוצות שונות. (ד) מיפוי הירארכי באשכולות של ניתוח microarray מקבוצות טיפול שונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
למרות שיש הרציונל המדעי חזק להעריך מסלולים מולקולריים ברקמות אמתחת, דיווחים רבים על פרופיל החיסון של מודל ה-CIA murine התמקדו דם היקפי, בעוד חלבונים ו-RNA ניתוח נתונים של כפות מודלק הם מוגבלים למדי. ישנן מספר סיבות אפשריות להטיה זו: מפרקי הקרסול של מוריין אינם גדולים מ-~ 2 ס מ; האזורים המושפעים מורכב של עור, עצם ורקמות החיבור אשר לעתים קרובות קשה המגון באמצעות שיטות מסורתיות כמו מטחנות רקמה, מרגמה וטיט, סיליקה חרוז הפרעה, נשחקו או עיכול אנזימטי. שיטות אלה כתוצאה בדרך כלל המגון המלא שלם, חלבון נמוך או תשואה RNA, או איכות לא עקבית עקב השפלה חומצה הגרעין של פרוטחרדה. השיטה האיתנה המתוארת בזאת מספקת הליך מפורט להפקת אבקה קפואה מתישה הומוגנית כדי לאפשר במורד הזרם פרוטאומית ומאמצים ליצור פרופילים ליצירת חתימות מולקולרית של מחלות ממדגם אחיד אחד מקור.
יש לשקול מספר שלבים קריטיים בעת ביצוע שיטה זו. ראשית, כפות מורנה צריך להיות גזור על קו הפרווה במהלך הקציר רקמות וכמויות גדולות של שיער יש להימנע. שיער מוגזם יכול לסתום עמודים במהלך חילוץ RNA ולהפריע חילוץ החלבון. שנית, צינורות, מלקחיים ומלקחיים יש לשמור על קרח יבש במהלך ההליך, כי טמפרטורה מוגבה אבקות רקמות במהירות להפוך את החומר לתוך "בוץ" אמורפיים ואת שלמות החלבון ו-RNA יהיה בסכנה. שלישית, כמות אבקת רקמות המשמש להפקת חלבון או RNA צריך להיות אופטימיזציה בזהירות. אבקת רקמות יותר לא תמיד לספק תשואה גבוהה יותר, אבל יכול לגרום לבעיות נוספות בעיבוד במורד הזרם כולל סתימת עמודות בידוד RNA, שינוי יחס DNase/DNA (אם שלב זה מועסק) כדי למנוע השפלה מלאה DNA. לבסוף, נורמליזציה של חלבון וקלט RNA צריכה להיות חלק אינטגרלי מזרימת העבודה ומניתוח הנתונים. השונות בעומס רקמות יכול לשנות באופן משמעותי את השינויים בחלבון יחסי וברמות ה-RNA. בנוסף לחלבון הכולל או ל-RNA הכולל, ביטוי של גנים של משק הבית יכול להיחשב גם עוגנים לנורמליזציה.
באמצעות ניסוי מקיף ותהליך השגיאה, זיהינו כמה בעיות פוטנציאליות תכופות עבור משתמשים בפעם הראשונה של שיטה זו. יכול להיות תשואה נמוכה של RNA. זה לעתים קרובות תוצאה של העמסת יתר על הטור עם תמצית רקמות יותר מדי. כמות הרקמה לכל עמודה ויחס של RLT/אבקה הם חיוניים לצורך מבודדים RNA. מצאנו כי חלק מסחרי 96 ערכות החילוץ היטב עשוי לא לעבוד עבור תהליך זה כמו הדגימות לא יסתובב דרך העמודה בקצב שווה ערך, ובכך להתפשר על דגימות אלה במורד הזרם ואת הצעדים הימנעות. יכול להיות שינויים גבוהים בריכוז חלבונים ב-bca ניתוח וריכוזי ציטוקינים בניתוח לומיקס. אם אין בעיות עם BCA או בתהליך לומיקס, היא נגרמת בדרך כלל על ידי מזהמים שמנים או אחרים בתמצית החלבון. חשוב למנוע את שכבת השומן בחלק העליון או החומר הסודי בחלק התחתון של צינורות המיקרוצנטריפוגה בעת קציר להפקת חלבון. במקרה הצורך, חזרו על הספין. ואספו סופרנטנים לניתוח במורד הזרם
כאשר שיטה זו כרוכה טחנת המקפיא המקצועית מיוחדים כמויות גדולות של קרח יבש וחנקן נוזלי, אמצעי בטיחות נוספים יש לשקול. ציוד להגנה אישית נכונה כולל משקפיים בטיחות, מעילים מעבדה וכפפות קריוגניים צריך תמיד להיות שחוקים כדי למנוע כוויות הקפאת פוטנציאל פציעה עקב פיצוץ. דור של אירוסולים צריך גם להיות ממוזער ושימוש של מארזים מאזן פרקו מומלץ. לבסוף, בדומה לכל הפרוטוקולים האחרים המטפלים ברקמות בעלי חיים, טיפול צריך להילקח כראוי להיפטר כיאות של כל דגימות רקמות שאינן בשימוש, בעוד צינורות הניתנים לשימוש חוזר צריך להיות decontaminated לפני הניקוי.
בעוד שהשיטה היא בעלת יתרונות רבים לעומת שיטות קונבנציונליות, היא עדיין מוגבלת. הפרופיל הטרנססקריפט מתוך כפה כולה חופף באופן משמעותי עם פרופיל transcript של הביופסיה אמתחת אנושי (נתונים לא מוצגים). Mrna נוסף משריר, עור מח עצם יכול לדלל את האותות מרקמת אמתחת. פתרון אלטרנטיבי הוא לאסוף רקמות מורטין אמתחת באמצעות לייזר מיקרודיסקציה, אשר ניתן לבצע על מפרקי העכבר באוקטובר מוטבע. עם זאת, תפוקה נמוכה וכמות הרקמות הקטנה יחסית מגבילה את היישום הרחב לניתוח מיקרו-לייזר. בנוסף, גם עם אוטומציה משמעותית, שיטה זו היא עדיין עבודה אינטנסיבית למדי. זה לוקח לפחות 8 h כדי לעבד 30-60 דגימות בעזרת החוקרים 3-4. לבסוף, שיטה זו דורשת כמויות גדולות של חנקן נוזלי (~ 10-15 L עבור עיבוד 30-60 דגימות).
בתיאור השיטה הקודמת, ההערכה של ניתוחי נקודות הקצה של פרוטאומית וטרנססקריפט הוכחו. עם זאת, נקודת קצה נוספת, כגון lipidomic, טבולומיקס ופרופיל RNA קטן יכול להיות עניין לקהילה המחקר רחב יותר של דלקת מפרקים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים BJ, SH, ML, RM, ML, אל ו-FS הם עובדי מחקר ג ' יאנסן & פיתוח Inc והם בעלי מניות בחברת האם, ג ' ונסון & ג ' ונסון, Inc.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות לאדית ג'סן על הסקירה הקריטית של כתב היד וNavin ראו וג טאון על תמיכתם בפרסום כתב היד הזה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mm stainless steel bead | Qiagen | 69989 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Sample reducing agent that inhibits RNASE enzymes |
| Bioanalyzer Kit | Agilent | 5067-1511 | RNA qualification kit |
| b-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Cell Culture Grade Water | Corning | 25-055-CI | Water |
| Cell lysis stock solution | Cell Signaling | 9803 | |
| Eppendorf Tube | Eppendorf | 22363204 | Microfuge tubes |
| Eppendorf tube centrifuge box | Nalgene | 5055 | Box for holding eppendorf tubes in horizontal tube arrangement |
| Everlast 247 Variable Speed Rocker | Benchmark Scientific | BR5000 | |
| Freezer Mill | Spex Sample Prep | 6875 | Freezer/Mill for processing paws into pulverized powder |
| Grinding Vial | Spex Sample Prep | 6801 | Polycarbonate vial for processing paws into pulverized powder |
| Pierce BCA kit | Pierce | 23225 | Kit for Total Protein Quantification |
| Protease Inhibitor Cocktail set 1 | Calbiochem | 539131 | Protease Inhibitors |
| Protein BCA Kit | Pierce | 23225 | |
| Quantigene Kit | Thermofisher | QP1013 | bDNA analysis Kit |
| Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | Centrifugation |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | RNA extraction buffer |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | including RNeasy column, RLT Buffer and RW1 Buffer |
| Shaker | Benchmark Scientific | BR5000 | Rocker/Shaker |
| Spatula | VWR | 10806-412 | Spatula for powder transfer |
| Stainless Steel Bead | Qiagen | 69989 | Bead for mixing during protein extraction |
| Tube Extractor | Spex Sample Prep | 6884 | Extractor for removing the top of grinding vial |
| Vortexer | VWR | 10153-838 | Sample mixing |
References
- Firestein, G. S. Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Journal of Clinical Rheumatology. 11, S39-S44 (2005).
- McInnes, I. B., Schett, G. The pathogenesis of rheumatoid arthritis. New England Journal of Medicine. 365, 2205-2219 (2011).
- Ahlqvist, E., Hultqvist, M., Holmdahl, R. The value of animal models in predicting genetic susceptibility to complex diseases such as rheumatoid arthritis. Arthritis Research and Therapy. 11, 226 (2009).
- David, C. S., Taneja, V. Role of major histocompatibility complex genes in murine collagen-induced arthritis: a model for human rheumatoid arthritis. American Journal of the Medical Sciences. 327, 180-187 (2004).
- Tarkowski, A., Holmdahl, R., Klareskog, L. Rheumatoid factors in mice. Monographs in Allergy. 26, 214-229 (1989).
- Schurgers, E., Billiau, A., Matthys, P. Collagen-induced arthritis as an animal model for rheumatoid arthritis: focus on interferon-gamma. Journal of Interferon & Cytokine Research. 31, 917-926 (2011).
- Joosten, L. A., Helsen, M. M., van de Loo, F. A., van den Berg, W. B. Anticytokine treatment of established type II collagen-induced arthritis in DBA/1 mice. A comparative study using anti-TNF alpha anti-IL-1 alpha/beta, and IL-1Ra. Arthritis & Rheumatology. 39, 797-809 (1996).
- Asquith, D. L., Miller, A. M., McInnes, I. B., Liew, F. Y. Animal models of rheumatoid arthritis. European Journal of Immunology. 39, 2040-2044 (2009).
- Williams, R. O. Collagen-induced arthritis as a model for rheumatoid arthritis. Methods in Molecular Medicine. 98, 207-216 (2004).
- Shen, F., et al. Combined Blockade of TNF-alpha and IL-17A Alleviates Progression of Collagen-Induced Arthritis without Causing Serious Infections in Mice. Journal of Immunology. 202, 2017-2026 (2019).
