प्रसंस्करण माउस Paws के लिए एक Cryo-pulverization प्रोटोकॉल एक कोलेजन प्रेरित गठिया मॉडल में ऊतक सूजन के आणविक रास्ते का मूल्यांकन करने के लिए
Summary
एक तरल नाइट्रोजन फ्रीजर मिल का उपयोग कर murine पंजे प्रक्रिया करने के लिए एक क्रायोजेनिक pulverization विधि की उपज और आरएनए या ऊतकों से निकाले प्रोटीन की गुणवत्ता में सुधार और भड़काऊ के साथ जुड़े आणविक प्रोफाइल के विश्लेषण को सक्षम करने के लिए विकसित किया गया था जवाब.
Abstract
स्थानीय ऊतकों में आणविक परिवर्तन ों की रूपरेखा विवो में चिकित्सीय उम्मीदवारों की कार्रवाई के तंत्र (ओं) को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। गठिया अनुसंधान के क्षेत्र में, कई अध्ययनों सूजन जोड़ों कि हड्डी का एक जटिल मिश्रण से बना रहे हैं पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं, उपास्थि, मांसपेशियों, stromal कोशिकाओं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं. यहाँ, हम एक cryogenicly नियंत्रित वातावरण में सजातीय pulverized नमूनों में सूजन माउस पंजे को बाधित करने के लिए एक विश्वसनीय और मजबूत यांत्रिक विधि की स्थापना की. प्रोटीन और आरएनए lysates proteomic और प्रतिलेखनीय समापन बिंदु और स्थानीय ऊतक में प्रासंगिक रोग रास्ते के आणविक लक्षण को सक्षम करने के लिए संसाधित किया गया.
Introduction
रूमेटोइड गठिया (आरए) जोड़ों में लगातार सममित synovitis और त्वचा, दिल, फेफड़े, और आंखों1जैसे अंगों की अतिरिक्त संधि की भागीदारी के साथ एक पुरानी प्रणालीगत सूजन रोग है। हालांकि प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के प्रणालीगत अभिव्यक्तियों मानव रोगियों में स्पष्ट कर रहे हैं, आरए पैथोलॉजी की पहचान में से एक synovial ऊतक में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की घुसपैठ और synovial फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं के प्रसार2है.
मानव आरए के समान, माउस कोलेजन प्रेरित गठिया (सीआईए) मॉडल synovial ऊतकों और प्रणालीगत डिब्बों में सक्रिय प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के साथ मजबूत ऊतक सूजन प्रकाश में लाता है। सी.आई.ए. मॉडल के लिए अलग-अलग माउस उपभेदों की संवेदनशीलता मेजर हिस्टोकॉम्बिलिटी कॉम्प्लेक्स (एमएचसी) हैप्लोटाइप और एंटीजन विशिष्ट टी सेल और बी सेल बातचीत3,4से संबंधित है। इसके अलावा, मानव आरए में कई रोगजनक रास्ते, ऑटोएंटीबॉडी उत्पादन, प्रतिरक्षा जटिल जमाव, माइलॉयड सेल सक्रियण, पॉलीआर्टिकुलर अभिव्यक्तियों और पैनस गठन सहित, इस मॉडल में भी स्पष्ट हैं 5,6. जांचकर्ताओं विरोधी भड़काऊ साइटोकिन उपचार7के प्रभाव की जांच करने के लिए इस अच्छी तरह से स्थापित सीआईए मॉडल कार्यरत है. ऑटोम्यून्यून या भड़काऊ रोगों के लिए अनुमोदित कई जीवविज्ञान, जैसे कि एंटी-टीएनएफ जेड और एंटी-आईएल-6, सीआईए मॉडल8,9में प्रभावशाली पाए गए हैं।
synovial ऊतक में प्रतिरक्षा प्रणाली की बातचीत का पता लगाने आरए के रोगजनन के साथ जुड़े आणविक तंत्र स्पष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण है। मानव नैदानिक सेटिंग में, एक आम अभ्यास अल्ट्रासाउंड इमेजिंग के मार्गदर्शन में सुई synovial बायोप्सी प्रदर्शन करने के लिए है। पूर्व नैदानिक सेटिंग्स में, murine जोड़ों के छोटे वास्तुकला बायोप्सी प्रक्रियाओं और अधिक कठिन अगर असंभव नहीं बनाता है। हाल ही में, हमने अलग-अलग एंड-पॉइंट को प्रभावित करने और एक संयोजी दृष्टिकोण10में रोग को हल करने के लिए दवाओं के संयोजन का मूल्यांकन करने के लिए murine CIA मॉडल के उपयोग का प्रदर्शन किया। एक क्रायोजेनिक फ्रीजर मिल आधारित pulverization विधि सजातीय ठीक पाउडर में सूजन murine पंजे की प्रक्रिया और आरएनए और प्रोटीन निकालने के लिए बहाव प्रक्रियाओं की स्थापना की नियोजित किया गया था। यह विधि आरएनए और प्रोटीन को एंजाइमी और रासायनिक अपमानजनक प्रक्रियाओं से बचाती है और हमें एकल समरूपनमूना स्रोत के लिए कई विश्लेषणात्मक विधियों को लागू करने में सक्षम बनाती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हालांकि वहाँ मजबूत वैज्ञानिक तर्क synovial ऊतकों में आणविक रास्ते का मूल्यांकन करने के लिए है, murine सीआईए मॉडल की प्रतिरक्षा रूपरेखा पर कई रिपोर्टों परिधीय रक्त पर ध्यान केंद्रित किया गया, जबकि प्रोटीन और प्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक इस पांडुलिपि और नवीन राव और जेनिफर टाउन की महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए Edith Janssen इस पांडुलिपि के प्रकाशन के समर्थन के लिए धन्यवाद देना चाहता हूँ.
Materials
| 5 mm stainless steel bead | Qiagen | 69989 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Sample reducing agent that inhibits RNASE enzymes |
| Bioanalyzer Kit | Agilent | 5067-1511 | RNA qualification kit |
| b-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Cell Culture Grade Water | Corning | 25-055-CI | Water |
| Cell lysis stock solution | Cell Signaling | 9803 | |
| Eppendorf Tube | Eppendorf | 22363204 | Microfuge tubes |
| Eppendorf tube centrifuge box | Nalgene | 5055 | Box for holding eppendorf tubes in horizontal tube arrangement |
| Everlast 247 Variable Speed Rocker | Benchmark Scientific | BR5000 | |
| Freezer Mill | Spex Sample Prep | 6875 | Freezer/Mill for processing paws into pulverized powder |
| Grinding Vial | Spex Sample Prep | 6801 | Polycarbonate vial for processing paws into pulverized powder |
| Pierce BCA kit | Pierce | 23225 | Kit for Total Protein Quantification |
| Protease Inhibitor Cocktail set 1 | Calbiochem | 539131 | Protease Inhibitors |
| Protein BCA Kit | Pierce | 23225 | |
| Quantigene Kit | Thermofisher | QP1013 | bDNA analysis Kit |
| Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | Centrifugation |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | RNA extraction buffer |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | including RNeasy column, RLT Buffer and RW1 Buffer |
| Shaker | Benchmark Scientific | BR5000 | Rocker/Shaker |
| Spatula | VWR | 10806-412 | Spatula for powder transfer |
| Stainless Steel Bead | Qiagen | 69989 | Bead for mixing during protein extraction |
| Tube Extractor | Spex Sample Prep | 6884 | Extractor for removing the top of grinding vial |
| Vortexer | VWR | 10153-838 | Sample mixing |
References
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