Summary

コラーゲン誘発性関節炎モデルにおける組織炎症の分子経路を評価するためのマウス足処理のためのクライオ粉砕プロトコル

Published: October 30, 2019
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Summary

液体窒素冷凍庫ミルを用いてマウス足を処理する極低温粉砕法を開発し、組織から抽出されたRNAまたはタンパク質の収率と品質を向上させ、炎症に関連する分子プロファイルの解析を可能にした。応答。

Abstract

局所組織における分子変化のプロファイリングは、生体内における治療候補の作用のメカニズムを理解するために重要である。関節炎の研究の分野では、多くの研究は、骨、軟骨、筋肉、間質細胞および免疫細胞の複雑な混合物で構成される炎症性関節に焦点を当てています。ここでは、炎症を起こしたマウスの足を極低温で制御された環境で均質な粉砕サンプルに破壊する信頼性と堅牢な機械的方法を確立しました。タンパク質およびRNAリサートは、局所組織におけるプロテオミクスおよび転写エンドポイントおよび関連する疾患経路の分子特性評価を可能にするために処理された。

Introduction

関節リウマチ(RA)は、関節に持続性対称性腺炎を有し、皮膚、心臓、肺、眼1などの器官の余分な関節関与を有する慢性全身性炎症性疾患である。免疫応答の全身症状はヒト患者において明らかであるが、RA病理の特徴の1つは、静脈組織における免疫細胞の浸潤およびスイノビアル線維芽細胞の増殖である2である。

ヒトRAと同様に、マウスコラーゲン誘発関節炎(CIA)モデルは、滑膜組織および全身コンパートメントにおける活性免疫応答を有する強い組織炎症を引き起こす。CIAモデルに対する異なるマウス株の感受性は、主要組織適合性複合体(MHC)ハプロタイプおよび抗原特異的T細胞およびB細胞相互作用3、4にリンクする。さらに、自己抗体産生、免疫複合体沈着、骨髄細胞活性化、多関節状症状および眼窩免疫浸潤を伴うパンヌス形成を含むヒトRAにおける多くの病原性経路も、このモデルで明らかである。5、6.研究者は、抗炎症サイトカイン治療の効果を調査するために、この確立されたCIAモデルを採用しています7.抗TNFαおよび抗IL-6のような自己免疫または炎症性疾患に対して承認された多くの生物学的製剤は、CIAモデル8、9において有効であることが見出される。

静脈組織における免疫系の相互作用をプロファイリングすることは、RAの病因に関連する分子機構を解明するために重要である。人間の臨床環境では、超音波画像診断の指導の下で針の静脈生検を行うことが一般的です。前臨床の設定では、マウス関節の小さなアーキテクチャは、不可能でない場合、生検手順がはるかに困難になります。最近、異なる終点に影響を与える薬物の組み合わせを評価し、組み合わせアプローチ10で疾患を解決するために、マウスCIAモデルの利用を実証した。炎症を起こしたマウスの足を均質な微粉末に処理し、RNAとタンパク質を抽出する下流プロセスを確立するために、極低温冷凍ミルベースの粉砕法が採用されました。この方法は、RNAとタンパク質を酵素的および化学的な分解プロセスから保護し、単一の均質化されたサンプルソースに複数の分析方法を適用することを可能にします。

Protocol

すべての動物実験は、ヤンセンR&Dの制度動物ケア利用委員会(IACUC)の方針に従って行われました。 1. 極低温冷凍ミルベースの粉砕法 CIAの研究の終了時に、1.5%のイソフルランでマウスを犠牲にし、続いて子宮頸部脱臼を行った。 組織処理の日には、すべての器具(スパチュラ、粉砕バイアルなど)をドライアイスで10分間冷やし、凍結損傷を避けるためにサー?…

Representative Results

ここで、図2AにCIAマウスの前足から抽出したRNAの代表的なゲル画像可視化を示す。28S rRNAおよび18S rRNAバンドは、すべてのサンプルが十分な量の無傷のRNAを有しっていることを示す。次に、図2Bにタンパク質BCA分析に基づく総タンパク質濃度の代表的な散乱プロットを示す。ナイーブマウス、CIAマウ?…

Discussion

経卵組織の分子経路を評価する科学的根拠は強いが、マウスCIAモデルの免疫プロファイリングに関する多くの報告は末梢血に焦点を当て、炎症を起こした足のタンパク質およびRNA分析データはかなり限られている。このバイアスのいくつかの考えられる理由があります: マウス足首関節は〜2 cm以下です。患部は、組織グラインダー、害虫やモルタル、シリカビーズ破壊、トリチュレーション?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者たちは、原稿とナヴィン・ラオとジェニファー・タウンの批判的なレビューに対するエディス・ヤンセンの評価を賜ります。

Materials

5 mm stainless steel bead Qiagen 69989
beta-mercaptoethanol Sigma M6250 Sample reducing agent that inhibits RNASE enzymes
Bioanalyzer Kit Agilent 5067-1511 RNA qualification kit
b-mercaptoethanol Sigma M6250
Cell Culture Grade Water Corning 25-055-CI Water
Cell lysis stock solution Cell Signaling 9803
Eppendorf Tube Eppendorf 22363204 Microfuge tubes
Eppendorf tube centrifuge box Nalgene 5055 Box for holding eppendorf tubes in horizontal tube arrangement
Everlast 247 Variable Speed Rocker Benchmark Scientific BR5000
Freezer Mill Spex Sample Prep 6875 Freezer/Mill for processing paws into pulverized powder
Grinding Vial Spex Sample Prep 6801 Polycarbonate vial for processing paws into pulverized powder
Pierce BCA kit Pierce 23225 Kit for Total Protein Quantification
Protease Inhibitor Cocktail set 1 Calbiochem 539131 Protease Inhibitors
Protein BCA Kit Pierce 23225
Quantigene Kit Thermofisher QP1013 bDNA analysis Kit
Refrigerated microcentrifuge Eppendorf 5417R Centrifugation
RLT Buffer Qiagen 79216 RNA extraction buffer
RNeasy mini kit Qiagen 74104 including RNeasy column, RLT Buffer and RW1 Buffer
Shaker Benchmark Scientific BR5000 Rocker/Shaker
Spatula VWR 10806-412 Spatula for powder transfer
Stainless Steel Bead Qiagen 69989 Bead for mixing during protein extraction
Tube Extractor Spex Sample Prep 6884 Extractor for removing the top of grinding vial
Vortexer VWR 10153-838 Sample mixing

References

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Cite This Article
Jones, B., Hitchcock, S., Loza, M., Malaviya, R., Ort, T., Shen, F. A Cryo-pulverization Protocol for Processing Mouse Paws to Evaluate Molecular Pathways of Tissue Inflammation in a Collagen Induced Arthritis Model. J. Vis. Exp. (152), e60229, doi:10.3791/60229 (2019).

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