Крио-распыления Протокол для обработки мышь лапы для оценки молекулярных путей воспаления тканей в коллагениндовой модели артрита

Summary

Криогенный метод распыления для обработки мурин лап с помощью жидкого азота морозильной мельницы был разработан для улучшения урожайности и качества РНК или белка, извлеченного из тканей и позволяют анализ молекулярных профилей, связанных с воспалительными Ответы.

Abstract

Профилирование молекулярных изменений в местных тканях имеет решающее значение для понимания механизма (ы) действия терапевтических кандидатов in vivo. В области исследований артрита, многие исследования сосредоточены на воспаление суставов, которые состоят из сложной смеси костей, хряща, мышц, стромальных клеток и иммунных клеток. Здесь мы создали надежный и надежный механический метод для разрушения воспаленных мышей лап в однородные распыленные образцы в криогенно контролируемой среде. Белки и РНК-лизаты были обработаны для обеспечения протеомных и транскрипционных конечных точек и молекулярной характеристики соответствующих путей заболевания в местной ткани.

Introduction

Ревматоидный артрит (РА) является хроническим системным воспалительным заболеванием с стойким симметричным синовитом в суставах и дополнительным суставным участием органов, таких как кожа, сердце, легкие и глаза^1. Хотя системные проявления иммунного ответа очевидны у пациентов, одной из отличительных черт патологии РА является проникновение иммунных клеток в синовиальную ткань и пролиферация синовиальных фибробластных клеток².

Как и в человеческой РА, мышь коллагена индуцированных артрита (ЦРУ) модель вызывает сильное воспаление тканей с активными иммунными реакциями в синовиальных тканей и системных отсеков. Восприимчивость различных штаммов мыши к модели ЦРУ ссылки на основные гистосовместимости комплекса (MHC) гаплотип и антиген конкретных Т-клеток и B-клеточных взаимодействий^3,4. Кроме того, многие патогенные пути в организме человека, в том числе производство аутоантител, иммунный комплекс осаждения, активация миелоидных клеток, полиартикулярные проявления и формирование паннуса с синовиальной иммунной инфильтрацией, также проявляются в этой модели ^5,6. Следователи использовали эту устоявшуюся модель ЦРУ для расследования последствий противовоспалительных цитокинов лечения⁷. Многие биопрепараты, одобренные для аутоиммунных или воспалительных заболеваний, таких как анти-ТНФЗ и анти-IL-6, оказались эффективными в модели ЦРУ^8,9.

Профилирование взаимодействий иммунной системы в синовиальной ткани имеет решающее значение для выяснения молекулярных механизмов, связанных с патогенезом РА. В клинических условиях человека, распространенная практика заключается в выполнении иглы синовиальной биопсии под руководством ультразвуковой визуализации. В доклинических условиях меньшая архитектура муринских суставов делает процедуры биопсии гораздо более сложными, если не невозможными. Недавно мы продемонстрировали использование модели murine ЦРУ для оценки комбинаций препаратов для воздействия разрозненных конечных точек и разрешения болезни в комбинаторном подходе¹⁰. Для обработки воспаленные муринные лапы в однородные мелкие порошки был использован криогенный морозильный метод мельницы на основе мельницы. Этот метод защищает РНК и белок от ферментативных и химических дегративных процессов и позволяет нам применять несколько аналитических методов к одному гомогенизированному источнику образца.

Protocol

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с политикой Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) компании «Янссен» НИОКР.

1. Криогенный морозильник мельница основе пульверизации Метод

1. При прекращении исследования ЦРУ, жертвоприношение мышей с 1,5% изолюран с последующим вывихом шейки матки.
2. В день обработки тканей, предварительно охладить все инструменты (шпатулы, шлифовальные флаконы и т.д.) на сухом льду в течение как минимум 10 мин. Носите тепловые перчатки, чтобы избежать замораживания повреждения.
3. Вырезать задние лапы с ножницами на линии меха, как показано на рисунке 1А.
4. Перенесите каждую лапу в одну микроцентрифуговую трубку мощностью 1,5 мл, немедленно заморозьте жидкий азот и храните замороженные лапы при -80 градусов по Цельсию. Не держите образцы замороженными в течение более одной недели.
5. Заполните морозильную мельницу жидким азотом, как показано на рисунке 1B, и дайте ей уравновесить, по крайней мере 10 мин.
6. Храните необработанный образец на сухом льду и избегайте циклов замораживания оттепели.
7. Перенесите одну заднюю лапу в предварительно охлажденный большой поликарбонат шлифовальный флакон с нижней стальной штепсельной вилкой, вставьте предварительно охлажденный стальной ударитель и закройте поликарбонатный шлифовальный флакон с предварительно охлажденной верхней стальной вилкой(рисунок 1C).
8. Перенесите большие флаконы из поликарбоната с образцами в морозильную мельницу, предварительно заполненную жидкостью, и закройте крышку резиновой застежкой, найденной в передней части инструмента.
9. Дайте образцам остыть в жидком азоте в течение 1 минуты.
10. Установите морозильную мельницу на 1-минутную программу с 10 циклами в секунду и нажмите кнопку «Пуск». Подождите, пока морозильник мельницы, чтобы завершить свой цикл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Машина издает звук, издав ударный звук, когда стальной ударный перемещается вперед и назад. Используйте затычки для ушей, чтобы избежать потери слуха.
11. Откройте крышку морозильной мельницы, выньте большой поликарбонатшливый флакон и поместите его в экстрактор, как показано на рисунке 1D. Удалите верхнюю стальную вилку, разместив понижательное давление на черную ручку до тех пор, пока стальная вилка не выкатится из поликарбонатной трубки.
12. Перенесите открытый большой поликарбонатный пробирки на сухой лед. Удалите стальной ударсудар с предварительно охлажденным щиптом.
13. Перенесите замороженный порошок в предварительно охлажденный коническую трубку 50 мл.
14. Вес 30-50 мг замороженного порошка в tared замороженные 1,5 мл микроцентрифуг трубки для экстракции РНК и 100-200 мг замороженного порошка для извлечения белка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Замороженный порошок должен выглядеть как белый или светло-розовый мелкий песок, как показано на рисунке 1E.
15. Храните распыленные образцы при -80 градусах Цельсия и переходите к РНК и белковой изоляции в течение 24 ч.

2. Добыча РНК

1. Добавьте 10 л из й-меркаптоэтанола (к-МЭ) на 1 мл буфера RLT.
2. Рассчитайте объем RLT Buffer, соответствующий соотношению 23,3 мл/мг ткани, и добавьте соответствующий объем RLT Buffer с помощью q-ME в трубку с замороженным порошком. Это соотношение было эмпирически определено, чтобы быть идеальным для мыши лапы.
3. Вихрь образец при 3000 об/мин на 10 с.
4. Хорошо перемешать, пипетки вверх-вниз 10 раз энергично с 1 мл пипетатора.
5. Vortex образец снова на 3000 об/мин на 20 с.
6. Центрифуга трубки на 13000 х г в течение 2 мин.
7. Перенесите 700 л супернатантов в свежую трубку и добавьте 700 л 70% этанола.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если в трубке находится lt;700 л, то можно продолжить, по-прежнему добавляя эквивалентный объем в 70% этанола.
8. Загрузите 700 л образца на столбец очистки РНК.
9. Центрифуга трубки на 10000 х г на 30 с.
10. Отбросьте поток и загрузите оставшуюся часть образца в столбец RNeasy.
11. Центрифуга трубки на 10000 х г на 30 с.
12. Отбросьте поток и промойте столбец, добавив 700 л буфера RW1 с центрифугированием 10 000 х г на 30 сс. При выполнении опции dnaSE пищеварения, 350 Л RW1 добавляется до лечения ДНКСЭ.  И еще 350 л RW1 добавляется после лечения ДНКСЭ.
13. Дополнительно) Выполните шаг dNase пищеварения следовать инструкциям производителя.
14. Вымойте трубку дважды, добавив 500 кЛ буфера RPE с последующим центругированием на уровне 10 000 х г в течение 30 с. Отбросьте поток через каждый раз.
15. Высушите столбец центрифугированием при 10 000 х г в течение 2 мин.
16. Elute РНК, добавляя 50 л воды с центрифугированием на 10000 х г в течение 2 мин. Соберите поток через и передать в новую трубку 1,5 мл.
17. Определите количество РНК с помощью метода исследователя выбора и хранения при -80 градусов по Цельсию до дальнейшего анализа.

3. Экстракция белка

1. Разбавить 10x клеточного лиза цисисого штучного раствора в 1x-клеточном растворе лиза с использованием воды класса клеточной культуры.
2. Восстановите ингибитор протеазы Коктейль Набор I с 1 мл воды, чтобы сделать 100x протеазы ингибитор фонда.
3. Добавьте 100 л ингибитора протеазы к 9,9 мл из 1x Lysis, чтобы сделать 1x окончательный запас решения.
4. Добавьте 4 злиц ледяного холода 1x Cell Lysis Buffer на мг порошка ткани (например, 800 л люл буфера лисиса до 200 мг порошка ткани).
5. Добавьте в трубку одну 5-мм капотом из нержавеющей стали.
6. Вихрь трубки при 3000 об/мин на 60 с. Перенесите трубку на мокрый лед и продолжайте к следующему образцу.
7. Поместите все образцы трубок в коробку и встряхните коробку центрифуги на рокере при 1000 об/мин, 4 кв. м на 1 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Исследователи могут обнаружить, что размещение коробки вертикальной может способствовать лучшему смешиванию с бисочницей.
8. Центрифуга труб на 10000 х г и 4 кв кв 15 мин.
9. Перенесите супернационты в свежую трубку и избегайте жирового слоя сверху.
10. Определите общую концентрацию белка. От 10 до 30 раз разбавления белка лизат идеально подходят для теста BCA.
11. Aliquot образца в 1,5 мл микроцентрифуговых труб и хранить при -80 градусах Цельсия до дальнейшего анализа.

Representative Results

Здесь мы показываем репрезентативную визуализацию изображения геля РНК, извлеченную из передних лап мышей ЦРУ на рисунке 2A. 28S rRNA и диапазон 18S rRNA указывают на то, что все образцы имеют достаточное количество нетронутой РНК. Далее мы показываем репрезентативный участок рассеяния общих концентраций белка на основе анализа белка BCA на рисунке 2B. Общие концентрации протеина от наивных мышей, мышей СИА или мышей СИА при различных методах лечения сопоставимы между группами. Для определения концентраций воспалительных цитокинов и хемокинов в белковом экстракте были проведены анализы Luminex. Мы показываем репрезентативный участок рассеяния концентраций нормализованных цитокинов и хемокин (пг/мг общего белка) на рисунке 2C. По сравнению с наивными мышами, несколько цитокинов повышены у мышей ЦРУ и лечение анти-IL17A антитела значительно подавляет производство нескольких цитокинов. Для оценки изменений транскриптома в ЦРУ и связанных с лечением эффектов был проведен анализ микроаррей. Мы показываем репрезентативную диаграмму графика генов значительно увеличено в мышах CIA сравненный к наивным мышам в рисунке 2D.

Рисунок 1: Оборудование, необходимое для распыления руновых лап. (A) Воспаленные или невоспаленные лапы от ЦРУ или наивных мышей. (B) жидкий азот Dewar используется для заполнения нержавеющей стали ванну морозильной камеры мельницы. (C) Собранный морозильный завод трубки набор. (D) Морозильник мельница трубки нож. (E) Пульверизированная ткань из руновых лап. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Репрезентативные данные по анализу белка и РНК из распыленных муринных лап. (A) Гель изображения визуализации целостности РНК. (B) Общие концентрации белка из разных групп. (C) Выражение chemokine и цитокинов (Luminex) от по-разному групп. (D) Иерархическая кластеризация тепловой карты анализа микроаррей из различных групп лечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Discussion

Хотя есть сильное научное обоснование для оценки молекулярных путей в синовиальных тканях, многие доклады об иммунном профилировании модели ЦРУ были сосредоточены на периферической крови, в то время как данные анализа белка и РНК воспаленных лап довольно ограничены. Есть несколько возможных причин для этого смещения: мурин лодыжки суставы не больше, чем 2 см; пораженные участки состоят из кожи, костной и соединительной ткани, которые часто трудно гомогенизировали с помощью традиционных методов, таких как тканевые шлифовальные машины, пестики и раствор, нарушение сварочным бисером, тритурация или ферментативное пищеварение. Эти методы обычно приводят к неполной гомогенизации, низкой урожайности белка или РНК, или непоследовательное качество из-за протеолитической и нуклеиновой кислоты деградации. Надежный метод, описанный в настоящем документе, обеспечивает детальную процедуру создания однородного распыленного замороженного порошка, чтобы позволить вниз по течению протеомным и транскрипционным усилиям профилирования установить молекулярные подписи заболевания из единого образца Источник.

При выполнении этого метода следует учитывать несколько критических шагов. Во-первых, мурин лапы должны быть сокращены на линии меха во время сбора ткани и большое количество волос следует избегать. Чрезмерное волос может засорить столбцы во время экстракции РНК и вмешиваться в экстракцию белка. Во-вторых, трубки, щипцы и шпательдолжны должны храниться на сухом льду на протяжении всей процедуры, так как повышенная температура в порошках тканей быстро превратит материал в аморфную «грязь» и целостность белка и РНК будет нарушена. В-третьих, необходимо тщательно оптимизировать количество порошка тканей, используемого для извлечения белка или РНК. Больше порошка ткани не всегда может обеспечить более высокий выход но может причинить дополнительные проблемы в обработке downstream включая закупорку колонки изоляции RNA, изменяя коэффициент DNase/ДНК (если этот шаг использован) для того чтобы предотвратить полную деградацию дна. Наконец, нормализация ввода белка и РНК должна быть неотъемлемой частью рабочего процесса и анализа данных. Вариабельность нагрузки тканей может значительно замаскировать изменения в относительном уровне белка и РНК. В дополнение к общему белку или общей РНК, экспрессия генов домашнего хозяйства также может рассматриваться в качестве якорей для нормализации.

Благодаря обширному процессу проб и ошибок, мы определили некоторые потенциальные частые проблемы для начинающих пользователей этого метода. Там может быть низкая доходность РНК. Это часто является результатом перегрузки колонки слишком много ткани экстракта. Количество ткани на столбец и соотношение RLT/порошка имеют решающее значение для эффективной изоляции РНК. Мы обнаружили, что некоторые коммерческие 96 комплектов извлечения скважин ы не могут работать для этого процесса, как образцы не будут вращаться через столбец с эквивалентной скоростью, тем самым ставя под угрозу эти образцы в вниз по течению стирки и elution шаги. В анализе Luminex может быть высокая изменчивость концентрации белка и концентрации цитокинов. Если Есть никаких проблем с BCA или процесс Luminex, это, как правило, вызвано жира или других загрязняющих веществ в экстракт белка. Важно избегать жирового слоя в верхней или нерастворимых веществ в нижней части микроцентрифуговых труб при сборе для извлечения белка. При необходимости повторите спин и соберите супернацианты для анализа ниже по течению.

Поскольку этот метод включает в себя специализированную криогенную морозильную мельницу и большое количество сухого льда и жидкого азота, следует рассмотреть дополнительные меры безопасности. Надлежащее оборудование для личной защиты, включая защитные очки, лабораторные пальто и криогенные перчатки, всегда следует носить, чтобы предотвратить возможные ожоги и травмы от взрыва. Поколение аэрозолей также должно быть сведено к минимуму и использование вентиляционных корпусов баланса рекомендуется. Наконец, как и любые другие протоколы обработки тканей животных, следует принять меры, чтобы правильно распоряжаться всеми неиспользованными образцами тканей, в то время как многоразовые трубки должны быть обеззаражены до очистки.

Хотя метод имеет много преимуществ по сравнению с обычными методами, он по-прежнему таит в себе некоторые ограничения. Профиль транскриптома из всей лапы мурин значительно перекрывается с профилем транскриптома из биопсии человека (данные не показаны). Дополнительные мРНК из мышц, кожи и костного мозга могут разбавить сигналы от синовиальной ткани. Альтернативным решением является сбор синовиальной ткани мурин с помощью лазерного микродиссекции, который может быть выполнен на встроенных суставах мыши OCT. Однако низкая пропускная мощность и относительно небольшое количество тканей ограничивают широкое применение лазерного микрорассечения. Кроме того, даже при значительной автоматизации, этот метод по-прежнему довольно трудоемким. Для обработки 30-60 образцов с помощью 3-4 следователей требуется не менее 8 ч. Наконец, этот метод требует большого количества жидкого азота (10-15 л для обработки 30-60 образцов).

В предыдущем описании метода была продемонстрирована оценка протеомического и транскрипционного анализа конечной точки. Тем не менее, дополнительные конечные точки, такие как липидомические, метаболомика и малых РНК профилирования может представлять интерес для более широкого сообщества исследований артрита.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mm stainless steel bead	Qiagen	69989
beta-mercaptoethanol	Sigma	M6250	Sample reducing agent that inhibits RNASE enzymes
Bioanalyzer Kit	Agilent	5067-1511	RNA qualification kit
b-mercaptoethanol	Sigma	M6250
Cell Culture Grade Water	Corning	25-055-CI	Water
Cell lysis stock solution	Cell Signaling	9803
Eppendorf Tube	Eppendorf	22363204	Microfuge tubes
Eppendorf tube centrifuge box	Nalgene	5055	Box for holding eppendorf tubes in horizontal tube arrangement
Everlast 247 Variable Speed Rocker	Benchmark Scientific	BR5000
Freezer Mill	Spex Sample Prep	6875	Freezer/Mill for processing paws into pulverized powder
Grinding Vial	Spex Sample Prep	6801	Polycarbonate vial for processing paws into pulverized powder
Pierce BCA kit	Pierce	23225	Kit for Total Protein Quantification
Protease Inhibitor Cocktail set 1	Calbiochem	539131	Protease Inhibitors
Protein BCA Kit	Pierce	23225
Quantigene Kit	Thermofisher	QP1013	bDNA analysis Kit
Refrigerated microcentrifuge	Eppendorf	5417R	Centrifugation
RLT Buffer	Qiagen	79216	RNA extraction buffer
RNeasy mini kit	Qiagen	74104	including RNeasy column, RLT Buffer and RW1 Buffer
Shaker	Benchmark Scientific	BR5000	Rocker/Shaker
Spatula	VWR	10806-412	Spatula for powder transfer
Stainless Steel Bead	Qiagen	69989	Bead for mixing during protein extraction
Tube Extractor	Spex Sample Prep	6884	Extractor for removing the top of grinding vial
Vortexer	VWR	10153-838	Sample mixing