Summary
Her beskriver vi en in vitro Live-imaging metode for å visualisere intracellulære transport av organeller og smugling av plasma membran proteiner i murine astrocytter. Denne protokollen presenterer også en bildeanalyse metodikk for å bestemme laste transport ruter og Kinetics.
Abstract
Astrocytter er blant de mest tallrike celletyper i den voksne hjernen, hvor de spiller nøkkelroller i et mangfold av funksjoner. Som en sentral aktør i hjernen homeostase, astrocytter forsyne neurons med vitale metabolitter og buffer ekstracellulære vann, ioner og glutamat. En integrert del av "Tri-partite" synapse, astrocytter er også avgjørende i dannelsen, beskjæring, vedlikehold, og modulering av synapser. For å aktivere disse svært interaktive funksjoner, astrocytter kommunisere seg imellom og med andre gliacellene celler, neurons, hjernen blodkar, og ekstracellulære miljø gjennom en rekke spesialiserte membran proteiner som inkluderer celle vedheft molekyler, akvaporiner, ion kanaler, signalstoffer transportører, og gap Junction molekyler. For å støtte denne dynamiske Flux, astrocytter, som neurons, stole på tett koordinert og effektiv intracellulære transport. I motsetning til neurons, der intracellulære smugling har blitt omfattende avgrenset, mikrotubulinettverket transport i astrocytter har vært mindre studert. Likevel, EXO-og endocytic smugling av celle membran proteiner og intracellulære organelle transport appartefakter astrocytter ' normal biologi, og disse prosessene er ofte påvirket i sykdom eller som følge av skade. Her presenterer vi en grei protokoll til kultur av høy kvalitet murine astrocytter, å fluorescensmerkete etikett astrocytic proteiner og organeller av interesse, og å registrere deres intracellulære transport dynamikk ved hjelp av time-lapse konfokalmikroskopi mikroskopi. Vi viser også hvordan du kan trekke ut og kvantifisere relevante transport parametre fra ervervet filmene ved hjelp av tilgjengelig bildeanalyse programvare (dvs. ImageJ/FIJI) plugins.
Introduction
Astrocytter er de mest tallrike cellene i det voksne sentralnervesystemet, hvor de utfører unike utviklings-og homøostatisk funksjoner1. Astrocytter modulere Synaptic utvikling gjennom direkte kontakt med pre-og postsynaptic terminaler som en del av Tri-partite synapse, som inneholder signalstoffer reseptorer, transportører, og celle vedheft molekyler som letter synapse formasjon og Nevron-astrocytt kommunikasjon2. I tillegg astrocytter aktivt kontrollere Synaptic overføring og hindre neuronal excitotoxicity ved raskt å fjerne eksitatoriske nevrotransmittere fra Synaptic kløft, resirkulering nevrotransmittere, og deltar i Synaptic beskjæring3 , 4 andre priser , 5 andre priser , 6. for å aktivere disse svært interaktive funksjoner, astrocytter kommunisere seg imellom, med andre gliacellene celler, og med neurons gjennom spesialiserte membran proteiner, inkludert celle vedheft molekyler, akvaporiner, ion kanaler, signal-transportører, og gap knutepunkt molekyler. Astrocytter aktivt endre overflaten nivåer av disse proteinene som svar på svingninger i deres intra-og ekstracellulære miljø7. Videre endringer i nivåer og fordeling av mitokondrier, lipid dråper, og degradative og gjenvinning organeller modulere energiforsyning, metabolitten tilgjengelighet, og cellulære clearing prosesser som er avgjørende for astrocytt funksjon og Overlevelse.
De dynamiske endringene i membran protein og organelle smugling og posisjonering i astrocytter er tilrettelagt av den felles funksjon av motor proteiner og adaptere som fremmer Last motilitet8,9. Tilsvarende er overflate nivåer av membran proteiner modulert gjennom internalisering og resirkulering hendelser10. Disse cargos transporteres via en intrikat nettverk av utgangen, mikrotubuli, og muligens mellomliggende filamenter spor8. Studier basert på immunofluorescence farging av end-binding protein 1 (EB1), som akkumuleres på den voksende mikrotubulinettverket pluss ender, tyder på at i astrocytter bunter av mikrotubuli stråle ut fra perinucleus og forlenge deres pluss ende mot periferien11. Men en omfattende undersøkelse av organiseringen og polariteten til mikrotubuli og andre cytoskjelettkomponenter elementer ved hjelp av Live-celle Imaging mangler fortsatt. Mens mange av mekanismene bak dynamikken i organeller og membran proteiner har blitt grundig studert i neurons og andre celletyper, er Last motilitet i astrocytter mindre godt forstått. De fleste av våre nåværende kunnskaper om endringer i protein og organelle distribusjon i astrocytter er basert på tradisjonell antistoff-basert merking av fast forberedelse, som utelukker presis romlig og timelig undersøkelse av Last dynamikk7, det er 12.
Her beskriver vi en metode for å merke membran proteiner og organeller for Live Imaging i høy renhet primære mus astrocytt kulturer. Ved hjelp av denne protokollen, gir vi eksempler der vi spore dynamisk lokalisering av grønne fluorescerende protein (GFP)-Tagged membran proteiner i transfekterte astrocytter, inkludert gapet krysset protein connexin 43 (Cx43-GFP) og eksitatoriske aminosyre transporter 1 (EAAT1-GFP). Vi beskriver også bruken av en fluorescerende acidotropic sonde for å visualisere Sure organeller og følge deres dynamikk i menneskehandel i live astrocytter. Til slutt viser vi hvordan du analyserer data for tidsforløp for å trekke ut og evaluere transport parametere for individuelle cargos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr prosedyrer ble utført med godkjennelse av University of North Carolina i Chapel Hill Animal Care and use Committee (IACUC).
1. Brain disseksjon og kultur av primær mus astrocytter
Merk: følgende protokoll ble tilpasset fra publiserte metoder, som følger den opprinnelige prosedyren utviklet av McCarthy og deVellis13,14,15. Blandet cellekulturer av McCarthy/deVellis (MD) astrocytter er utarbeidet fra postnatal dag 2 − 4 (P2 − P4) mus barken, behandlet med en anti-mitotisk faktor, og renset for å gi den endelige beriket astrocytt kultur. Fire barken fra mus pups av enten sex er tilstrekkelig til å generere en T75 vev kultur kolbe kultur.
- Coat bunnen av T75 flasker (100% vinklet nakke tilgang, 0,22 μm hydrofobe ventilert filter deksel) med Poly-D-lysin (1 mg/mL i 0,1 M Tris buffer, pH 8,5) og ruge ved 37 ° c i 24 timer før start av disseksjon.
- Før du begynner disseksjon prosedyren, varme 30 mL astrocytt kultur Media (Dulbecco ' s modifiserte Eagle ' s medium [DMEM] høy glukose, 10% varme-deaktivert fosterets storfe serum, 1% penicillin/Streptomycin) ved 37 ° c og tine en 5 mL alikvot av 2,5% Trypsin på isen. Forbered to dissekere retter (60 mm diameter) på isen fylt med 6 mL av Hank ' s balansert saltløsning (HBSS) uten ca2 + eller mg2 +.
- Desinfisere alle kirurgiske verktøy (fine tip pinsett, dissekere saks, Vännäs saks rett, Graefe tang med buede tips) i 70% etanol før og i mellom hver disseksjon.
- Spray hodet og halsen på P2 − P4 mus valper med 70% etanol før raskt euthanizing dem ved halshogging med kirurgisk saks. Utfør en bakre til fremre midtlinjen innsnitt langs hodebunnen for å avdekke skallen. Skjær forsiktig skallen fra halsen til nesen.
- Utfør to ekstra lateral snitt bedre enn øynene. Ved hjelp av fine tips pinsett vende forsiktig skallen klaffene til side. Fjern hjernen og legg den i den første dissekere parabolen fylt med iskald HBSS uten ca2 + eller mg2 +. Hold parabolen på isen og fortsette høsting resten av hjernen.
Merk: Utfør resten av disseksjon prosedyren under et dissekere omfang. - Fjern olfactory pærer ved hjelp av Vännäs saks eller fin pinsett (figur 1AI). Med den buede spissen tang i skjæringspunktet mellom de tverrgående og interhemispheric sprekker, forsiktig sette inn et andre par buet tupp tang mellom cortex og Diencephalon, langsomt åpne pinsett for å skille cerebral halvkuler fra resten av hjernen (figur 1Aii, Aiii). Fjern uønsket vev (figur 1AIV).
- For hver kortikale halvkule, forsiktig fjerne hjernehinnene med fine spissen pinsett. Alternativt kan du fjerne hippocampus fra barken. Overfør dissekert musen barken til en annen rett fylt med iskald HBSS uten ca2 + eller mg2 + og holde den på isen mens dissekere de resterende hjerner.
Merk: Gjennomfør de neste trinnene under aseptisk forhold i en laminær strømnings hette. - Skjær dissekert barken i små biter (ca. 2 − 4 mm) ved hjelp av steril, skarp kirurgisk saks eller skalpell. Overfør det dissekert vevet til et 50 mL konisk rør som inneholder enzym løsning (22,5 mL HBSS uten ca2 + eller mg2 +, 2,5 ml 2,5% Trypsin). Ruge ved 37 ° c i 30 min med mild inversjon hver 10 min.
- Samle fordøyd vev ved sentrifugering på 300 x g i 5 min og fjerne enzymet løsning ved dekantering (ikke bruk et vakuum aspirator). Tilsett 10 mL astrocytt kultur medier og distansere vevet inn i enkeltceller ved å pipettering oppløsningen 20 − 30x ved hjelp av en 10 mL serologisk pipette.
- Filter celle suspensjonen gjennom en 70 μm celle sil for å minimere celle klumper og ufordøyd vev. Samle Filtrer i et rent 50 mL konisk rør og Juster det totale volumet til 20 mL med astrocytt kultur medier. På dette stadiet evaluerer du effektiviteten til kortikale dissosiasjon ved å blande 10 μL av celle fjæringen med 10 μL av trypan blå og telle celler med en hemocytometer.
Merk: en tilberedning fra fire P2 − P4 muse barken gir 10 − 15 x 106 enkeltceller. - Aspirer den Poly-D-lysin belegg løsning fra T75 kulturen kanner og vask to ganger med sterilt vann. Plate den 20 mL celle fjæring og ruge ved 37 ° c og 5% CO2.
2. rensing og vedlikehold av astrocytt kulturer
Merk: Utfør alle medie endringer under aseptisk forhold i en laminær strømnings hette med steril filtrert (0,22 μm filter membran) astrocytt medier varmet til 37 ° c.
- Bytt ut celle mediene 48 h etter plating (dag in vitro 2, DIV2).
- På DIV5, erstatte Media med ferske astrocytt kultur Media supplert med 10 μM cytosin arabinoside (AraC).
Merk: dette trinnet forenkler fjerningen av forurensende celler, inkludert fibroblaster og andre gliacellene celler. Det er viktig å behandle kulturer med AraC ikke lenger enn 48 h som lengre inkubasjons ganger vil redusere astrocytt levedyktighet. - For DIV7, endre Media å astrocytt kulturen media uten AraC og begynne å sjekk kulturen confluency daglig. Når cellene har nådd 80% samløpet, pels to-T75 kanner for hver urenset astrocytt kultur kolbe med Poly-D-lysin og ruge ved 37 ° c i minst 8 t til over natten.
- Den påfølgende dagen begynner astrocytt rensing ved å riste kulturen flasker ved 180 RPM i 30 min i en 37 ° c orbital riste inkubator. Fjerne mediet og ombytte den med frisk astrocytt kulturen Media. Rist celler ved 240 RPM for 6 timer i en 37 ° c orbital riste inkubator. Prewarm 1x fosfat-bufret saltvann (PBS), astrocytt kultur Media, og 0,25% Trypsin-EDTA til 37 ° c 20 − 30 min før utløpet av riste perioden.
Merk: co2inkubasjons er ikke nødvendig under risting trinn. Hvis ønskelig, Media innsamlet etter 30-min og 6-h risting trinnene kan brukes til kultur mikroglia og oligodendrocytes, henholdsvis. AraC behandling av blandet kultur vil imidlertid redusere overflod av de andre gliacellene celler. - Fjern kulturen flasker fra shaker og umiddelbart erstatte Media med 10 mL varm 1x PBS per kolbe. Fjern PBS og tilsett 3 mL 0,25% Trypsin-EDTA per kolbe. Ruge ved 37 ° c og 5% CO2, sjekker hver 5 min for avløsning.
- Når cellene har løsrevet fra flasken, stopp trypsinization ved å legge 10 mL astrocytt kultur medier. Overfør frittliggende astrocytter til en 50 mL konisk rør og pellet celler ved sentrifugering ved 300 x g i 5 min. aspirer supernatanten og re-suspendere cellene i 40 ml astrocytt kultur Media.
- Vask Poly-D-lysin-belagt T75 kanner to ganger med sterilt vann og plate 20 mL av renset astrocytt suspensjon. Tilbake til 37 ° c og 5% CO2 inkubator. Endre astrocytt kultur Media annenhver dag for ytterligere 10 dager til astrocytter eldre.
Merk: hver T75 kolbe av renset astrocytter bør være tilstrekkelig til å produsere 2 nye T75 flasker med 3 x 105 celler hver på plating. - Gjenta trinn 2,5 − 2.7 for påfølgende omganger eller til plate astrocytter for mikroskopi.
Merk: renheten av astrocytt kulturer etter tilsetning av AraC og etter rensing kan vurderes kvalitativt gjennom brightfield mikroskopi, eller mer presist ved kvantifisere prosentandelen av gliacellene fibrillary yre protein (GFAP)-positive celler per synsfelt i fluorescerende bilder (figur 1B, C).
3. transfeksjoner av fluorescensmerkete merket plasmider
- Dagen før transfeksjoner eller merking, seedet astrocytter på ønsket tetthet for Imaging 24-48 h post-transfeksjoner. En anbefalt tetthet for 24-brønn plater eller 14 mm glassbunn brønner er 2 x 104 celler/brønn.
Merk: denne protokollen er optimalisert for transfeksjoner av astrocytter belagt på 12 mm glass coverslips på 24-brønn plater eller 14 mm glassbunn brønner ved hjelp av en lipofection-basert metode. Reagenser bør skaleres avhengig av størrelsen på kultur fatet der astrocytter vokser. - Fortynne lipofection reagens (materialfortegnelsen) i redusert serum Media (tabell av materialer). For å optimalisere forholdet mellom lipofection reagens og DNA, test en rekke adekvat fortynninger. Hvis du for eksempel bruker reagens som er ansatt i denne protokollen (innholdsfortegnelsen), fortynnet 2, 3, 4 og 5 μL av lipofection reagens i 50, μL av reduserte serum medier.
- Fortynne 5 mikrogram av høy renhet DNA i 250 til μL av redusert serum Media. Tilsett 5 μL lipofection Enhancer reagens (tabell av materialer). Kombiner røret som inneholder lipofection reagens med et likt volum av DNA-lipofection Enhancer mix. Bland med pipettering og ruge ved romtemperatur (RT) i 15 min.
- Fjerne astrocytt kulturen Media og sammenlegge transfeksjoner blande (steg 3,3) å celler dråpevis. Etter en 6-h inkubasjons ved 37 ° c og 5% CO2, Erstatt transfeksjoner komplekset med et passende volum av astrocytt kultur medier (2 ml for 14 mm glassbunn retter). Ruge for ytterligere 24 − 72 timer før du går videre til bilde oppkjøpet. Nøye overvåke varigheten av inkubasjons skritt for å oppnå den beste balansen mellom protein uttrykk og celle levedyktighet.
4. merking av sen endosomes/lysosomer ved hjelp av fluorescerende sonder
Merk: noen cargos kan merkes med fluorescerende fargestoffer med høy affinitet for Last spesifikke proteiner. Følgende eksempel tillater merking av sen endosomes/lysosomer med en fluorescerende acidotropic sonde.
- Fortynne lysosomal (tabell av materialer) i 200 μL av astrocytt kultur medier til en arbeids konsentrasjon på 1 μM og gjelder for astrocytter fra trinn 3,1 ved en tetthet på 2 x 104 celler/brønn. Ruge for 30 min ved 37 ° c.
- Vask cellene en gang med varmt astrocytt kultur Media og erstatte med Imaging Media (tabell over materialer). Fortsett til live Imaging umiddelbart.
5. image oppkjøpet ved hjelp av et time-lapse Imaging system
Merk: time-lapse Live Imaging bør gjøres ved hjelp av et fluorescens mikroskop utstyrt med et høyhastighetskamera, klart fokus, inkubasjons kammer, og en 40x olje mål med høy numerisk blenderåpning (f. eks plan-Apochromat 1.4 NA). Et utvalg av oppkjøpet programvare er tilgjengelig for time-lapse Imaging. Valg av mikroskopi system og oppkjøp programvare bør være basert på deres tilgjengelighet og egnethet for målene for den aktuelle studien. Nedenfor finner du noen generelle retningslinjer.
- Plasser kultur kammeret eller parabolen i riktig adapter på mikroskop scenen. Ved hjelp av epifluorescence lys, Velg cellen (e) som uttrykker fluorescerende proteiner eller sonde til posten. Juster lysstoffrør belysningen for å visualisere valgt (e) celle (er) ved hjelp av det digitale kameraet. Unngå å bruke høy belysning som kan forårsake photobleaching og Phototoksisitet. Juster fokus og zoom.
- Tilegne seg enkelt Z-stack time-lapse serien med en frekvens på 1 ramme hver 2 s for tidsintervaller varierer mellom 300 s og 500 s ved hjelp av zoom og bestemte fokus funksjoner.
Merk: dynamikk i menneskehandel (hastighet, bevegelses frekvens osv.) vil variere avhengig av protein av interesse, og dermed kan tiden løpet av oppkjøpet krever justering. For eksempel, mitokondrier er færre aktive enn lysosomer og forevise hyppig pause. I dette tilfellet er det mer hensiktsmessig å justere anskaffelses parametrene til 1 ramme hver 5 s for 800 s. - Spar tid-lapse bilder og eksportere dem som AVI eller TIFF stack-filer.
6. bildeanalyse
Merk: bildeanalyse ble utført ved hjelp av KymoToolBox plugin for ImageJ/Fiji16. Detaljert trinn-for-trinn skriftlige instruksjoner er tilgjengelig på nettet17. Følgende forkortede trinn bør være tilstrekkelig til å opprette kymographs og trekke ut partikkel transport parametrene.
- Åpen tid-lapse image orden inne ImageJ/Fiji programvare. Importer bilder fra fil- menyen som AVI-eller TIFF stack-filer. Konverter bildene til 8-biters eller 16-biters ved å velge en av disse bildetypene ved hjelp av type verktøyet fra bilde menyen. Hvis du arbeider med RGB-filer, kan du dele kanaler ved hjelp av del kanal verktøyet som er tilgjengelig under farge funksjonen i bilde menyen.
- Hvis du vil generere en kymograph (representasjon i posisjon og tid for partikkel baner), tegner du hvert spor der partiklene beveger seg ved å spore en linje langs baner av partiklene ved hjelp av segmentert linje verktøy. For å tildele riktig retning av bevegelsen, tegner du polystrek med samme ønskede retnings konvensjon for alle filmer, slik at polariteten er konsistent innenfor og på tvers av alle celler som blir studert. For eksempel, tegne polystrek fra midten av cellen mot periferien eller vice versa. Juster linjebredden slik at den samsvarer med tykkelsen på sporet, ved å dobbeltklikke på linje verktøyet.
- Kjør Draw Kymo makro av KymoToolBox plugin ved hjelp av en linjebredde på 10. En melding som spør om å kalibrere bildet i tid (antall bilder, bildefrekvens) og mellomrom (x, y oppløsning) vises. Når kalibrert, kymographs er generert og kan lagres som TIFF-filer for data presentasjon eller videre partikkel analyse.
- Tildel partikkel baner ved å spore hver partikkel manuelt i kymograph ved hjelp av segmentert linje verktøy for hele anskaffelses varigheten. Ta opp hver partikkel bane som en region av interesse (ROI) ved hjelp av ROI Manager -verktøyet som finnes i analyser/verktøy- menyen. Lagre alle ROIs per time-lapse video for videre analyse.
Merk: det er viktig å tildele riktig bane for individuelle partikler på kymograph for å oppnå den mest nøyaktige beregningen av transport parametre.- Kjør analyser Kymo makro av KymoToolBox plugin. Et vindu vil åpne ber om å definere "utover" retning av partikkel bevegelse (fra venstre til høyre eller vice versa) fra rullegardinmenyen. Dette valget avhenger av plasseringen av fluorescerende cargos avbildet i forhold til kjernen eller celle periferien, som fastsatt i trinn 6,2. For eksempel, hvis kjernen er plassert til venstre for cargos, og polystrek i trinn 6,2 ble trukket bort fra kjernen, definere den ytre partikkel bevegelse som "fra venstre til høyre".
- Definer grensen hastighet (minimum hastighet som en Last anses aktive) i analyser Kymo vinduet. For cargos som beveger seg ved raske intracellulære transport hastigheter, er 0,1 μm/sekund et passende valg. Endre denne verdien for å justere programvare følsomheten til hver Last av interesse. Juster linjebredden slik at den samsvarer med tykkelsen på hver partikkel bane.
- Velg Logg alle data og Logg ekstrapolert koordinatene alternativer i analyser kymo -vinduet. Dette vil beregne ulike Last transport parametre, inkludert gjennomsnittlig hastighet, innover hastighet, utover hastighet, Kumulativ distanse, tilbakelagt distanse i enten innover eller utover, antall brytere for hver partikkel, prosentandel av tiden beveger seg i hver retning eller pause, etc. Data som beregnes for individuelle spor blir deretter gruppert per kymograph og lagret i tekstfiler som er spesifikke for hvert bilde.
Merk: Vis farget Kymo alternativ for å analysere Kymo makro genererer en fargekodet overlapping av banen over den opprinnelige kymograph. Partikler som reiser utover er farget i grønt, innover i rødt, og stasjonære partikler i blått. Alternativet rapport koordinater på opprinnelig stakk i analyser Kymo -makroen genererer en fargekodet overlapping av plasseringen til det ekstrapolert objektet på den opprinnelige video-og kymograph.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen for å etablere primær mus MD astrocytter skissert ovenfor bør gi reproduserbar, høy kvalitet kulturer. Selv om kulturer i utgangspunktet inneholder en blanding av astrocytter, fibroblaster og andre gliacellene celler, inkludert mikroglia og oligodendrocytes (figur 1bi, BIV; røde pilspisser), minimerer tillegg av AraC til den blandede KULTUREN mellom DIV5-DIV7 spredning av disse miljøgifter celler. Den kombinerte AraC behandling og risting-basert rensing strategi beriker renheten av astrocytt kulturer (figur 1bii) over tradisjonelle protokoller som bare inkluderer rensing trinnene (figur 1BV; blå pilspisser)13. Forventet morfologi og sammensetning (vurdert av GFAP og 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole [DAPI] farging) av renset astrocytt kulturer behandlet med AraC eller venstre ubehandlet er vist i figur 1regning, BVI. Kvantifisering av prosentandelen av GFAP+ celler per synsfelt (forholdet mellom antall celler med GFAP farging til totalt antall celler IDENTIFISERT av DAPI farging) viser en økning på over 27% i renhet med AraC kosttilskudd (figur 1 C). denne høy-renhet mus astrocytt kulturen er egnet for evaluering av RNA og protein uttrykk, celle morfologi, og andre funksjonelle analyser.
Vi brukte lipofection-baserte transfeksjoner å uttrykke GFP-Tagged versjoner av gapet krysset protein Cx43 og EAAT1 transportør i murine astrocytter. Denne metodikken tillater forbigående uttrykk for proteiner på nivåer som er optimale for levende celle bilde uten å forårsake toksisitet eller påvirker astrocytt levedyktighet (figur 2A, E). På samme måte, bruk av en fluorescerende sonde tillatt rask og effektiv merking av Sure Endo-lysosomal organeller (figur 2i) for å spore sine dynamikk i astrocytter.
Figur 2 viser representative resultater av analysene av Last dynamikk i astrocytter midlertidig TRANSFEKTERTE med EAAT1-GFP, CX43-GFP, eller merket med en selektiv fargestoff som gjenkjenner Sure endolysosomal blemmer. Hver av disse cargos dukket opp som en fluorescerende punctum dekorere perinukleære antinøytrofile regionen, stoffer og prosesser av astrocytter (figur 2a, E, I, venstre paneler). Tidsforløp data ble brukt til å generere kymographs som sporer Last bevegelse i tid og rom (figur 2A, E, I, høyre paneler). I disse kymographs er anterograd og retrograd bevegelse av den indikerte lasten representert ved baner med negative (grønne linjer) og positive (røde linjer) bakker, henholdsvis. Stasjonære blemmer vises som vertikale baner (blå linjer). Kymograph analyse avslørte at de tre typer Last analysert gjennomgår toveis transport med sporadisk rask, processive kjører i begge retninger. Videre avslørte kvantifisering av Flux av en Last gjennom et område av astrocytt (rød boks) forskjeller i prosentandelen av aktive partikler blant cargos. For eksempel, mens 70% av EAAT1-GFP puncta er stasjonære (figur 2B), mindre enn 20% av Cx43-GFP (figur 2F) og 45% av sonde-merket endolysosomal cargos (figur 2J) er ikke-aktive. Disse forskjellene i motilitet blant cargos er trolig representative for deres normale, Baseline motilitet i regionen av astrocytt der filmene ble anskaffet.
Den presise tilordningen av endringen i X-Y-posisjon langs heltids skala for hver partikkel innhentet fra kymograph kan også brukes til å evaluere andre bevegelses parametre, for eksempel frakt hastighet (figur 2C, G, K) og løpe lengde (avstand reist) (figur 2D, H, L). Motion parametre kan videre analyseres for individuelle cargos å bestemme endringer i retningen av bevegelse (anterograd vs retrograd bevegelse) samt reversering i partikkel retning av bevegelse, antall pauser, etc. Resultatene fra disse typer analyser kan gi meningsfull kvantitativ informasjon om endringer i cellulær distribusjon av organeller og membran proteiner i astrocytter under basal eller unormale forhold i intra-og ekstracellulære Miljø.
Figur 1: etablering av primær mus astrocytt kulturer.
(A) trinn som kreves for Disseksjon av P2 − P4 mus hjerner. (B) (i, IV) Brightfield bilder av blandede gliacellene kulturer behandlet (i) og ikke-behandlet (IV) med AraC. Røde pilspisser indikerer forurensning mikroglia. (II, v) Bilder av renset astrocytt kulturer behandlet (II) og ikke-behandlet (v) med AraC. Blå pilspisser indikerer forurensning oligodendrocytes. (III, vi) Konfokalmikroskopi bilder av renset astrocytt kulturer behandlet (III) og ikke-behandlet (vi) med AraC. Grønn viser GFAP farging og DAPI (blå) merker alle kjerner. (C) prosent av GFAP-positive celler. Data representerer gjennomsnittlig ± SEM. * * * p < 0,001, ikke sammenkoblet t-test. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: kvantitative analyser av Last dynamikk i astrocytter.
(A, E, i) Venstre panel: astrocytter uttrykker EAAT1-GFP (A), Cx43-GFP (E) eller behandlet med en sonde som etiketter sent endosomes og lysosomer (I). Røde bokser angir områder som brukes til å analysere partikkel dynamikk. Høyre paneler: original og fargekodet kymographs som viser baner for den indikerte cargos. Røde linjer representerer retrograd-bevegelige cargos, grønne linjer anterograd cargos, og blå linjer ikke-aktive cargos. (B, F, J) Prosent av stasjonære og aktive partikler. (C, G, K) Kvantifisering av anterograd og retrograd hastighet og (D, H, L) løpe lengde. Data representerer gjennomsnittlig ± SEM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en eksperimentell tilnærming til å uttrykke, visualisere og spore fluorescensmerkete merkede organeller og membran proteiner av interesse ved hjelp av time-lapse video mikroskopi i høy renhet primær mus kortikale MD astrocytter. Vi skisserer også en metodikk for måling av partikkel dynamikk. Direkte visualisering av protein og organelle dynamikk i primære astrocytter gir et kraftig verktøy for å studere regulering av intracellulære transport i disse cellene in vitro.
Metodene for å etablere Mouse MD astrocytt kulturer beskrevet ovenfor kombinerer skritt fra andre publiserte protokoller13,14,15, som resulterer i både en enklere metode og i høyere renhet og kvalitet Kulturer. Kombinasjonen av AraC15 behandling og risting-basert rensing13,14 kan gi astrocytt kulturer med en renhet så høyt som 98% (vurdert av forholdet mellom GFAP+ celler totalt celler), som i vårt eksempel resulterer i en 27% økning i renhet over kulturer utsatt for rensing trinnene bare (figur 1B, C). Den høye renhet kulturer av mus astrocytter innhentet med denne metoden er lik verdiene rapportert for rotte astrocytt kulturer (vurdert av enzymatisk analyser og elektron mikroskopi) av McCarthy og deVellis14. Men McCarthy/deVellis-metoden, som ikke inkluderer AraC-behandling, krever et lengre risting (15 − 18 timer) og to ekstra runder med rensing14.
I vårt eksempel viser vi at denne protokollen er tilstrekkelig følsom for å fange forskjeller i motilitet blant ulike membran proteiner og organeller i astrocytter, som sannsynligvis er representative for deres individuelle intracellulære reiseruter og mobilnettet Funksjonen. Selv om vårt eksempel demonstrerer nytten av denne protokollen ved basal forhold, kan denne metodikken enkelt tilpasses for å måle transport parametre innenfor et bredt spekter av forskningsspørsmål. For eksempel kan lignende protokoller med mindre modifikasjoner brukes til å karakterisere transport hendelser i astrocytter in vitro som svar på intra-eller ekstracellulære miljø, som for eksempel cellulær skade, toksisitet, sykdomsfremkallende mutasjoner, Synaptic aktivitet (i blandede kulturer av neurons og astrocytter), etc. Likeledes kan co-uttrykk og visualisering av flere cargos eller organeller, hver individuelt merket med ulike fluorophores, også brukes til å vurdere dynamiske endringer i co-lokalisering og kompleks formasjon, forbigående interaksjoner mellom organeller og endocytic og membran gjenvinning av transport hendelser.
Suksessen av metodikken som presenteres her først og fremst er avhengig av evnen til å oppnå høy kvalitet astrocytt kulturer og i effektiv merking av lasten (e) av interesse. Når benytte denne prosedyren for Live Imaging, er det viktig å nøye overvåke fluorescerende uttrykk for å bestemme optimal post-transfeksjoner inkubasjonstid. I gjennomsnitt fant vi ut at for cargos analysert en 24-h inkubasjonsperiode resulterer i god signal intensitet for Live Imaging oppkjøp. Langvarig inkubasjons av transfekterte astrocytter kan resultere i høye uttrykk for fluorescensmerkete merkede proteiner, som kan indusere protein aggregering, og dermed endre Last lokalisering og dynamikk, og redusere helsen til kulturer. Astrocytter er svært sårbare for fysiske skader og endringer i kulturmiljøet, noe som kan føre til induksjon av transcriptional og cellulære responser, inkludert reaktivitet. Derfor er det avgjørende å redusere tidsintervallene mellom vasketrinn, og for å minimere eksponering av kulturer til luft og til betydelige endringer i temperatur eller lys intensitet over inkubasjons og anskaffelses periodene.
Oppsummert metodene som presenteres her kan brukes til å evaluere og kvantifisere dynamiske endringer i protein og organelle lokalisering i astrocytter. De gir verdifulle verktøy som tillater undersøkelse av endringer i astrocytic svar under fysiologiske og patologiske tilstander.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
DNL ble støttet av University of North Carolina ved Chapel Hill (UNC) School of Medicine som en Simmons Scholar. TWR ble støttet av UNC PREP Grant R25 GM089569. Arbeid ved hjelp av UNC nevrovitenskap Center mikroskopi Core Facility ble støttet, delvis av midler fra NIH-NINDS nevrovitenskap Center support Grant P30 NS045892 og NIH-NICHD Intellectual og utviklingsmessige funksjonshemminger Research Center support Grant U54 HD079124.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Scientific | 75-203-637 | Sorvall ST8 Centrifuge |
| Cell Culture Grade Water | Gen Clone | 25-511 | |
| Cell Culture Microscope | Zeiss | WSN-AXIOVERT A1 | Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities |
| Cytosine Arabinoside | Sigma | C1768-100MG | (AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage |
| DAPI | Sigma | D9542-5MG | Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining. |
| Dissecting Microscope | Zeiss | Stemi 305 | |
| Dissecting Scissors | F.S.T | 14558-09 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gen Clone | 25-500 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100-106 | Heat-Inactivated |
| FIJI (Fiji is Just Image J) | NIH | Version 1.52i | |
| Fine Tip Tweezers | F.S.T | 11254-20 | Style #5 |
| Fluorescence light source | Excelitas | 012-63000 | X-Cite 120Q |
| GFAP antibody | Cell Signaling | 3670S | GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody |
| Glass Bottom Dishes | Mattek corporation | P35G-1.5-14-C | 35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated |
| Graefe Forceps | F.S.T | 11054-10 | Graefe Iris Forceps with curved tips |
| Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes) | Life Technologies | L7526 | LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice. |
| Hank's Balanced Salt Solution (10x) | Gibco | 14065-056 | Magnesium and calcium free |
| Imaging Media | Life Technologies | A14291DJ | Live Cell Imaging Solution |
| Inverted Confocal Microscope | Zeiss | LSM 780 | |
| KymoToolBox | https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox | ||
| Lipofection Enhancer Reagent | Life Technologies | 11514015 | Plus Reagent |
| Lipofection Reagent | Life Technologies | 15338100 | Lipofectamine LTX reagent |
| Orbital shaking incubator | New Brunswick Scientific | 8261-30-1008 | Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control |
| Penicillin/Strepomycin solution (100x) | Gen Clone | 25-512 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Gen Clone | 25-507x | |
| Poly-D-Lysine Hydrobromide | Sigma | P7405 | Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing |
| Reduced serum medium | Gibco | 31985-062 | OPTI-MEM |
| Tissue Culture Flasks | Olympus Plastics | 25-209 | 75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap |
| Tissue culture incubator | Thermo Scientific | 51030285 | HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control |
| Tris-Base | Sigma | T1503 | 8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5 |
| Tris-HCl | Sigma | T3253 | 4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5 |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
| Vacuum-Driven Filter Systems | Olympus Plastics | 25-227 | 500 ml, PES membrane, 0.22 µm |
| Vannas scissors straight | Roboz | RS-5620 |
References
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends in Neurosciences. 22 (5), 208-215 (1999).
- Zuchero, J. B., Barres, B. A. Glia in mammalian development and disease. Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).
- Allaman, I., Bélanger, M., Magistretti, P. J. Astrocyte-neuron metabolic relationships: for better and for worse. Trends in Neurosciences. 34 (2), 76-87 (2011).
- Chung, W. S., Barres, B. A. The role of glial cells in synapse elimination. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 438-445 (2012).
- Chung, W. S., Allen, N. J., Eroglu, C. Astrocytes Control Synapse Formation, Function, and Elimination. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 020370 (2015).
- Shin, J. W., et al. Distribution of glutamate transporter GLAST in membranes of cultured astrocytes in the presence of glutamate transport substrates and ATP. Neurochemistry Research. 34 (10), 1758-1766 (2009).
- Potokar, M., et al. Cytoskeleton and vesicle mobility in astrocytes. Traffic. 8 (1), 12-20 (2007).
- Potokar, M., et al. Regulation of AQP4 surface expression via vesicle mobility in astrocytes. Glia. 61 (6), 917-928 (2013).
- Potokar, M., Lacovich, V., Chowdhury, H. H., Kreft, M., Zorec, R. Rab4 and Rab5 GTPase are required for directional mobility of endocytic vesicles in astrocytes. Glia. 60 (4), 594-604 (2012).
- Chiu, C. T., et al. HYS-32-Induced Microtubule Catastrophes in Rat Astrocytes Involves the PI3K-GSK3beta Signaling Pathway. PLoS ONE. 10 (5), 0126217 (2015).
- Basu, R., Bose, A., Thomas, D., Das Sarma, J. Microtubule-assisted altered trafficking of astrocytic gap junction protein connexin 43 is associated with depletion of connexin 47 during mouse hepatitis virus infection. Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 14747-14763 (2017).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visual Experiments. (71), e50079 (2013).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
- Tedeschi, B., Barrett, J. N., Keane, R. W. Astrocytes produce interferon that enhances the expression of H-2 antigens on a subpopulation of brain cells. The Journal of Cell Biology. 102 (6), 2244-2253 (1986).
- Zala, D., et al. Vesicular glycolysis provides on-board energy for fast axonal transport. Cell. 152 (3), 479-491 (2013).
- Cordelières, F. P. IJ KymoToolBox. , Available from: https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox (2016).
