Her beskriver vi en in vitro Live-imaging metode for å visualisere intracellulære transport av organeller og smugling av plasma membran proteiner i murine astrocytter. Denne protokollen presenterer også en bildeanalyse metodikk for å bestemme laste transport ruter og Kinetics.
Astrocytter er blant de mest tallrike celletyper i den voksne hjernen, hvor de spiller nøkkelroller i et mangfold av funksjoner. Som en sentral aktør i hjernen homeostase, astrocytter forsyne neurons med vitale metabolitter og buffer ekstracellulære vann, ioner og glutamat. En integrert del av “Tri-partite” synapse, astrocytter er også avgjørende i dannelsen, beskjæring, vedlikehold, og modulering av synapser. For å aktivere disse svært interaktive funksjoner, astrocytter kommunisere seg imellom og med andre gliacellene celler, neurons, hjernen blodkar, og ekstracellulære miljø gjennom en rekke spesialiserte membran proteiner som inkluderer celle vedheft molekyler, akvaporiner, ion kanaler, signalstoffer transportører, og gap Junction molekyler. For å støtte denne dynamiske Flux, astrocytter, som neurons, stole på tett koordinert og effektiv intracellulære transport. I motsetning til neurons, der intracellulære smugling har blitt omfattende avgrenset, mikrotubulinettverket transport i astrocytter har vært mindre studert. Likevel, EXO-og endocytic smugling av celle membran proteiner og intracellulære organelle transport appartefakter astrocytter ‘ normal biologi, og disse prosessene er ofte påvirket i sykdom eller som følge av skade. Her presenterer vi en grei protokoll til kultur av høy kvalitet murine astrocytter, å fluorescensmerkete etikett astrocytic proteiner og organeller av interesse, og å registrere deres intracellulære transport dynamikk ved hjelp av time-lapse konfokalmikroskopi mikroskopi. Vi viser også hvordan du kan trekke ut og kvantifisere relevante transport parametre fra ervervet filmene ved hjelp av tilgjengelig bildeanalyse programvare (dvs. ImageJ/FIJI) plugins.
Astrocytter er de mest tallrike cellene i det voksne sentralnervesystemet, hvor de utfører unike utviklings-og homøostatisk funksjoner1. Astrocytter modulere Synaptic utvikling gjennom direkte kontakt med pre-og postsynaptic terminaler som en del av Tri-partite synapse, som inneholder signalstoffer reseptorer, transportører, og celle vedheft molekyler som letter synapse formasjon og Nevron-astrocytt kommunikasjon2. I tillegg astrocytter aktivt kontrollere Synaptic overføring og hindre neuronal excitotoxicity ved raskt å fjerne eksitatoriske nevrotransmittere fra Synaptic kløft, resirkulering nevrotransmittere, og deltar i Synaptic beskjæring3 , 4 andre priser , 5 andre priser , 6. for å aktivere disse svært interaktive funksjoner, astrocytter kommunisere seg imellom, med andre gliacellene celler, og med neurons gjennom spesialiserte membran proteiner, inkludert celle vedheft molekyler, akvaporiner, ion kanaler, signal-transportører, og gap knutepunkt molekyler. Astrocytter aktivt endre overflaten nivåer av disse proteinene som svar på svingninger i deres intra-og ekstracellulære miljø7. Videre endringer i nivåer og fordeling av mitokondrier, lipid dråper, og degradative og gjenvinning organeller modulere energiforsyning, metabolitten tilgjengelighet, og cellulære clearing prosesser som er avgjørende for astrocytt funksjon og Overlevelse.
De dynamiske endringene i membran protein og organelle smugling og posisjonering i astrocytter er tilrettelagt av den felles funksjon av motor proteiner og adaptere som fremmer Last motilitet8,9. Tilsvarende er overflate nivåer av membran proteiner modulert gjennom internalisering og resirkulering hendelser10. Disse cargos transporteres via en intrikat nettverk av utgangen, mikrotubuli, og muligens mellomliggende filamenter spor8. Studier basert på immunofluorescence farging av end-binding protein 1 (EB1), som akkumuleres på den voksende mikrotubulinettverket pluss ender, tyder på at i astrocytter bunter av mikrotubuli stråle ut fra perinucleus og forlenge deres pluss ende mot periferien11. Men en omfattende undersøkelse av organiseringen og polariteten til mikrotubuli og andre cytoskjelettkomponenter elementer ved hjelp av Live-celle Imaging mangler fortsatt. Mens mange av mekanismene bak dynamikken i organeller og membran proteiner har blitt grundig studert i neurons og andre celletyper, er Last motilitet i astrocytter mindre godt forstått. De fleste av våre nåværende kunnskaper om endringer i protein og organelle distribusjon i astrocytter er basert på tradisjonell antistoff-basert merking av fast forberedelse, som utelukker presis romlig og timelig undersøkelse av Last dynamikk7, det er 12.
Her beskriver vi en metode for å merke membran proteiner og organeller for Live Imaging i høy renhet primære mus astrocytt kulturer. Ved hjelp av denne protokollen, gir vi eksempler der vi spore dynamisk lokalisering av grønne fluorescerende protein (GFP)-Tagged membran proteiner i transfekterte astrocytter, inkludert gapet krysset protein connexin 43 (Cx43-GFP) og eksitatoriske aminosyre transporter 1 (EAAT1-GFP). Vi beskriver også bruken av en fluorescerende acidotropic sonde for å visualisere Sure organeller og følge deres dynamikk i menneskehandel i live astrocytter. Til slutt viser vi hvordan du analyserer data for tidsforløp for å trekke ut og evaluere transport parametere for individuelle cargos.
Her beskriver vi en eksperimentell tilnærming til å uttrykke, visualisere og spore fluorescensmerkete merkede organeller og membran proteiner av interesse ved hjelp av time-lapse video mikroskopi i høy renhet primær mus kortikale MD astrocytter. Vi skisserer også en metodikk for måling av partikkel dynamikk. Direkte visualisering av protein og organelle dynamikk i primære astrocytter gir et kraftig verktøy for å studere regulering av intracellulære transport i disse cellene in vitro.
<p class="jove_content"…The authors have nothing to disclose.
DNL ble støttet av University of North Carolina ved Chapel Hill (UNC) School of Medicine som en Simmons Scholar. TWR ble støttet av UNC PREP Grant R25 GM089569. Arbeid ved hjelp av UNC nevrovitenskap Center mikroskopi Core Facility ble støttet, delvis av midler fra NIH-NINDS nevrovitenskap Center support Grant P30 NS045892 og NIH-NICHD Intellectual og utviklingsmessige funksjonshemminger Research Center support Grant U54 HD079124.
2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | |
Benchtop Centrifuge | Thermo Scientific | 75-203-637 | Sorvall ST8 Centrifuge |
Cell Culture Grade Water | Gen Clone | 25-511 | |
Cell Culture Microscope | Zeiss | WSN-AXIOVERT A1 | Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities |
Cytosine Arabinoside | Sigma | C1768-100MG | (AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage |
DAPI | Sigma | D9542-5MG | Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining. |
Dissecting Microscope | Zeiss | Stemi 305 | |
Dissecting Scissors | F.S.T | 14558-09 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gen Clone | 25-500 | |
Fetal Bovine Serum | Gemini | 100-106 | Heat-Inactivated |
FIJI (Fiji is Just Image J) | NIH | Version 1.52i | |
Fine Tip Tweezers | F.S.T | 11254-20 | Style #5 |
Fluorescence light source | Excelitas | 012-63000 | X-Cite 120Q |
GFAP antibody | Cell Signaling | 3670S | GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody |
Glass Bottom Dishes | Mattek corporation | P35G-1.5-14-C | 35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated |
Graefe Forceps | F.S.T | 11054-10 | Graefe Iris Forceps with curved tips |
Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes) | Life Technologies | L7526 | LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice. |
Hank's Balanced Salt Solution (10x) | Gibco | 14065-056 | Magnesium and calcium free |
Imaging Media | Life Technologies | A14291DJ | Live Cell Imaging Solution |
Inverted Confocal Microscope | Zeiss | LSM 780 | |
KymoToolBox | https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox | ||
Lipofection Enhancer Reagent | Life Technologies | 11514015 | Plus Reagent |
Lipofection Reagent | Life Technologies | 15338100 | Lipofectamine LTX reagent |
Orbital shaking incubator | New Brunswick Scientific | 8261-30-1008 | Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control |
Penicillin/Strepomycin solution (100x) | Gen Clone | 25-512 | |
Phosphate Buffered Saline (10x) | Gen Clone | 25-507x | |
Poly-D-Lysine Hydrobromide | Sigma | P7405 | Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing |
Reduced serum medium | Gibco | 31985-062 | OPTI-MEM |
Tissue Culture Flasks | Olympus Plastics | 25-209 | 75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap |
Tissue culture incubator | Thermo Scientific | 51030285 | HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control |
Tris-Base | Sigma | T1503 | 8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5 |
Tris-HCl | Sigma | T3253 | 4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5 |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
Vacuum-Driven Filter Systems | Olympus Plastics | 25-227 | 500 ml, PES membrane, 0.22 µm |
Vannas scissors straight | Roboz | RS-5620 |