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Neuroscience

可视化和分析星形细胞中细胞内器官和其他货物的细胞内传输

doi: 10.3791/60230 Published: August 28, 2019
* These authors contributed equally

Summary

在这里,我们描述了一种体外活成像方法,用于可视化细胞器的细胞内传输和在小鼠星形细胞中贩运血浆膜蛋白。该协议还提出了一种图像分析方法,以确定货物运输路线和动力学。

Abstract

星形细胞是成人大脑中最丰富的细胞类型之一,它们在多种功能中起着关键作用。作为大脑平衡的中心角色,星形细胞为神经元提供重要的代谢物和缓冲细胞外水、离子和谷氨酸。星形细胞是"三部分"突触的组成部分,在突触的形成、修剪、维护和调制中也至关重要。为了启用这些高度交互的功能,星形细胞通过包括细胞在内的大量专用膜蛋白,相互之间以及与其他胶质细胞、神经元、脑血管和细胞外环境进行通信粘附分子、水孢素、孔通道、神经递质输送机和间隙结分子。为了支持这种动态通量,星形细胞,像神经元一样,依赖于紧密协调和有效的细胞内传输。与神经元不同,细胞内贩运被广泛划定,星形细胞中基于微管的迁移研究较少。然而,细胞膜蛋白的外泌和内分细胞贩运和细胞内细胞内传输协调星形细胞的正常生物学,这些过程往往在疾病或对损伤的反应中受到影响。在这里,我们提出一个直接的协议,培养高品质的鼠群细胞,荧光标记星形蛋白和感兴趣的细胞器,并记录其细胞内传输动力学使用时移共聚焦显微镜。我们还演示了如何使用可用的图像分析软件(即 ImageJ/FIJI)插件从获取的电影中提取和量化相关的传输参数。

Introduction

星形细胞是成人中枢神经系统中最丰富的细胞,它们在其中执行独特的发育和静默功能1。星形细胞调节突触发育,通过直接接触前和后发触终端作为三部分突触的一部分,其中包含神经递质受体,传输器和细胞粘附分子,促进突触形成和神经元-天体细胞通信2。此外,星形细胞通过快速去除突触裂口的兴奋神经递质,回收神经递质,并参与突触修剪3,积极控制突触传播,防止神经元兴奋性中毒。,4,5,6.为了启用这些高度交互的功能,星形细胞通过专门的膜蛋白(包括细胞粘附分子、水孢素、离子电池通道)相互之间、与其他胶质细胞和神经元之间通信,神经递质传输器和间隙结分子。星形细胞积极改变这些蛋白质的表面水平,以响应其细胞内和细胞外环境的波动7。此外,线粒体、脂液滴和降解和再循环细胞器的水平和分布的变化调节了能量供应、代谢物可用性和细胞清除过程,这些对星形细胞功能和生存。

膜蛋白和细胞器贩运和星形细胞的定位的动态变化是由运动蛋白和适配器的协同功能促进货物运动8,9。同样,膜蛋白的表面水平是通过内化和回收事件10来调节的。这些货物通过一个复杂的网络,由行为蛋白、微管和可能的中间细丝轨道8进行运输。基于最终结合蛋白1(EB1)的免疫荧光染色的研究表明,在星形细胞束的微管中,微管从围核外辐射,并将其加端向外围11.然而,仍然缺乏对微管和其他细胞骨骼元素使用活细胞成像的组织和极性的全面检查。虽然细胞器和膜蛋白动力学背后的许多机制已经在神经元和其他细胞类型中进行了广泛的研究,但星形细胞中的货运活力却不太了解。我们目前关于星形细胞中蛋白质和细胞器分布变化的大部分知识是基于传统的基于抗体的固定制备标签,这排除了对货物动力学进行精确的空间和时间检查7, 12.

在这里,我们描述了一种在高纯度原鼠星形细胞培养中为活成像标记膜蛋白和细胞器的方法。使用该协议,我们提供了示例,其中我们跟踪绿色荧光蛋白 (GFP) 标记膜蛋白在转染星细胞中的动态定位,包括间隙结蛋白 Connexin 43 (Cx43-GFP) 和兴奋氨基酸运输器 1 (EAAT1-GFP)。我们还描述了使用荧光酸度探针来可视化酸性细胞器,并跟踪其在活星形细胞中的贩运动态。最后,我们演示了如何分析延时数据,以提取和评估单个货物的运输参数。

Protocol

所有动物程序都是在北卡罗来纳大学教堂山动物护理和使用委员会(IACUC)批准下进行的。

1. 脑解剖和原小鼠星形细胞培养

注:以下协议改编自已发表的方法,遵循麦卡锡和德韦利斯13、14、15开发的原始程序。麦卡锡/德韦利斯(MD)星形细胞的混合细胞培养从产后2⁄4(P2+P4)小鼠皮质制备,用抗线粒因子处理,并纯化,产生最终丰富的星细胞培养物。两个性别的小鼠小狗的四个皮质足以产生一个T75组织培养瓶培养。

  1. 用多D-赖盐(0.1M Tris缓冲液中的1mg/mL,pH 8.5)涂覆T75烧瓶的底部(100%角颈部通道,0.22μm疏水性通风过滤盖),并在37°C下孵育24小时,然后开始解剖。
  2. 在开始解剖程序之前,在37°C下加热30 mL的星形细胞培养基(Dulbeco的改性Eagle的介质[DMEM]高葡萄糖,10%热灭活胎儿牛血清,1%青霉素/链霉素),在37°C下解冻5 mL aliquote的2.5%胰蛋白酶。在装满汉克平衡盐溶液(HBSS)6 mL的冰上准备两个解剖盘(直径60毫米),没有Ca2+或Mg2+。
  3. 在每个解剖之前和之间,用70%乙醇消毒所有手术工具(细尖钳子、解剖剪刀、Vannas剪刀直、Graefe 钳子和弯曲的刀头)。
  4. 用70%乙醇喷洒P2-P4小鼠幼崽的头部和颈部,然后用手术剪刀快速将其安乐死。沿头皮进行后到中线切口,以暴露头骨。小心地把头骨从脖子切到鼻子。
  5. 执行两个优于眼睛的附加侧切口。使用细尖钳子轻轻地翻转头骨活门到一侧。取出大脑,并将其放入第一个解剖盘中,里面装满了冰冷的HBSS,没有Ca2+或Mg2+。把盘子放在冰上,继续收获大脑的其余部分。
    注:在解剖范围内执行解剖过程的其余部分。
  6. 使用 Vannas 剪刀或细钳子去除嗅球(图 1Ai)。在横半球和半球裂缝的交点处,在皮层和脑电位之间轻轻插入第二对弯曲的尖钳,缓慢地打开钳子,将脑半球与其他大脑 (图 1Aii, Aiii)。取出不需要的组织 (图 1Aiv)。
  7. 对于每个皮质半球,小心地用细尖钳子去除脑皮。或者,从皮质中取出海马。将解剖的小鼠皮质转移到第二个装满冰冷的HBSS的盘子里,而不加Ca2+或Mg2+,并在解剖剩余大脑时将其保存在冰上。
    注:在层流罩的无菌条件下执行后续步骤。
  8. 使用无菌锐利的手术剪刀或手术刀将解剖的皮质切成小块(约 2⁄4 mm)。将解剖组织转移到含有酶溶液的50 mL锥形管中(22.5 mL HBSS,不含Ca2+或Mg 2+,2.5 mL 2.5%胰蛋白酶)。在 37°C 孵育 30 分钟,每 10 分钟进行一次温和的反转。
  9. 在300 x g下离心收集消化组织5分钟,通过去皮去除酶溶液(不要使用真空吸气器)。加入10 mL的星形细胞培养培养培养,并使用10 mL血清学移液将溶液移液20-30x,将组织分离到单个细胞中。
  10. 通过70μm细胞过滤器过滤细胞悬浮液,以尽量减少细胞团块和未消化的组织。将滤液收集到干净的 50 mL 锥形管中,使用星形培养培养物将总体积调整到 20 mL。此时,通过将细胞悬浮液的 10 μL 与 10 μL 的锥形蓝色混合,并将计数细胞与血细胞计混合,以评估皮质分离的效率。
    注:四个 P2_P4 小鼠皮质的一个制剂可产生 10×15 x 106个单个细胞。
  11. 从 T75 培养瓶中吸出聚D-莱辛涂层溶液,用无菌水洗涤两次。板20mL细胞悬浮液,并在37°C和5%CO2孵育。

2. 星形细胞培养物的净化与维护

注:使用无菌过滤(0.22 μm过滤膜)星形细胞介质加热至37°C,在层流罩中执行无菌条件下的所有介质变化。

  1. 电镀后48小时更换细胞介质(天体外2,DIV2)。
  2. 在 DIV5 中,用新的星形细胞培养介质替换介质,辅以 10 μM 细胞氨酸阿拉伯苷 (AraC)。
    注:此步骤有助于去除污染物细胞,包括成纤维细胞和其他胶质细胞。重要的是对待与AraC的培养不超过48小时,因为较长的孵育时间将减少星形细胞的生存能力。
  3. 在 DIV7 中,将媒体更改为无 AraC 的星形文化介质,并开始每天检查文化汇合。一旦细胞达到80%的汇合,用多D-流氨酸为每个未纯化的星形细胞培养瓶涂上两-T75烧瓶,并在37°C孵育至少8小时至一夜之间。
  4. 第二天,在37°C的轨道摇动培养箱中,在180rpm下摇动培养瓶30分钟,开始星形细胞纯化。移除介质,并将其替换为新的星形培养介质。在37°C轨道摇动培养箱中,在240rpm下摇动细胞6小时。预温 1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS),星形细胞培养基,和 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 到 37 °C 20–30 分钟之前,摇动期结束。
    注:摇动步骤中不需要CO2孵化。 如果需要,在30分钟和6小时摇动步骤后收集的介质可用于分别培养微胶质和寡核苷酸。然而,对混合培养的AraC处理将减少其他胶质细胞的丰度。
  5. 从摇床中取出培养瓶,并立即用每个烧瓶 10 mL 的 1x 热 PBS 更换介质。去除PBS,每瓶加入3 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA。在37°C和5%CO2孵育,每5分钟检查一次分离。
  6. 一旦细胞从烧瓶中分离,通过添加10 mL的星形细胞培养培养物来停止胰蛋白酶化。将分离的星形细胞转移到50 mL锥形管和颗粒细胞,在300 x g下离心5分钟。 摄吸摄上清液,在40 mL的星细胞培养培养中重新悬浮细胞。
  7. 用无菌水和纯化星形细胞悬浮液板20 mL清洗两次涂覆的聚D-lysin涂层T75烧瓶。返回 37°C 和 5% CO2 培养箱。每两天改变星形细胞培养介质10天,直到星形细胞成熟。
    注:每个纯化星形细胞的T75瓶应足以产生2个新的T75烧瓶,每个在电镀时有3个x105个细胞。
  8. 重复步骤 2.5_2.7 进行后续刀路或板星形细胞进行显微镜。
    注:添加AraC和随后纯化后星形细胞培养物的纯度可通过明场显微镜进行定性评估,或者通过量化胶质纤维酸蛋白(GFAP)阳性百分比进行更精确的评估荧光图像中每个视场的细胞(图1B,C)。

3. 荧光标记质粒的转染

  1. 转染或标记前一天,种子星形细胞在所需的密度为成像24-48 h转染后。24 孔板或 14 mm 玻璃底井的推荐密度为 2 x 104单元/孔。
    注:此方案针对在 24 孔板或 14 mm 玻璃底井上 12 mm 玻璃盖上镀的星形细胞的转染进行了优化,采用基于唇裂的方法。试剂应根据星形细胞生长的培养皿的大小进行缩放。
  2. 在减液介质(材料表)中稀释唇裂试剂(材料表)。为了优化脂液酸试剂与DNA的比例,测试一系列适当的稀释剂。例如,如果使用本协议(材料表)中使用的试剂),在50μL的减血清介质中稀释2、3、4和5μL的利发试剂。
  3. 在250μL的减血清培养剂中稀释5μg的高纯度DNA。加入5μL的利菲增强剂试剂(材料表)。将含有脂裂试剂的管与同等体积的脱氧核糖核酸增强剂组合。通过移液混合,在室温 (RT) 下孵育 15 分钟。
  4. 去除星形细胞培养培养,并添加转染混合物(步骤3.3)到细胞滴落。在37°C和5%CO2下孵育6小时后,用适当体积的星形培养基(14 mm玻璃底盘2 mL)替换转染复合物。在继续采集图像之前,再孵育 24⁄72 小时。密切监测孵育步骤的持续时间,在蛋白质表达和细胞活力之间实现最佳平衡。

4. 使用荧光探针标记晚期内体/乳胶体

注:有些货物可以使用荧光染料进行标记,对货物特定蛋白质具有高亲和力。以下示例允许使用荧光酸刺激探针标记晚期内体/乳液体。

  1. 将星体培养培养的200 μL中的脂素贴标探针(材料表)稀释至工作浓度为1 μM,并应用于步骤3.1,密度为2 x 104细胞/井。在37°C下孵育30分钟。
  2. 用温暖的星形培养基洗一次细胞,用成像介质(材料表)代替。立即进行实时成像。

5. 使用延时成像系统采集图像

注:延时现场成像应使用配备高速摄像机、明确对焦、孵育室和具有高数值孔径的 40 倍油镜的荧光显微镜进行(例如,Plan-Apochromat 1.4NA)。有多种采集软件可用于延时成像。显微镜系统和采集软件的选择应基于其可用性和是否适合特定研究的目标。下文提供了一些一般性准则。

  1. 将培养室或培养皿放在显微镜舞台上的适当适配器中。使用荧光光,选择表达荧光蛋白的细胞或探针进行记录。调整荧光样品照明,使用数码相机可视化所选细胞。避免使用可能导致光漂白和光毒性的高照明。调整对焦和缩放。
  2. 使用变焦和明确对焦功能,以每 2 秒 1 帧的频率获取单个 Z 堆栈延时序列,其时间间隔范围为 300 s 到 500s。
    注:贩运动力学(速度、运动频率等)会因感兴趣的蛋白质而异,因此,获取的时间过程可能需要调整。例如,线粒体比溶于溶体更不具有可活动性,并且经常出现停顿。在这种情况下,将采集参数调整为每 5 s 1 帧(800 s)更为合适。
  3. 保存延时图像并将其导出为 AVI 或 TIFF 堆栈文件。

6. 图像分析

注:图像分析是使用KymoToolBox插件为图像J/Fiji16。详细的分步书面说明可在线17。以下缩写步骤应足以创建图形和提取粒子传输参数。

  1. 在 ImageJ/Fiji 软件中打开延时图像序列。从文件菜单中导入图像作为 AVI 或 TIFF 堆栈文件。使用"图像"菜单中的"类型"工具选择以下图像类型之一,将图像转换为 8 位或16 位。如果使用 RGB 文件,请使用"图像"菜单中的"颜色"功能下的"拆分通道"工具拆分通道。
  2. 要生成 kymograph(粒子轨迹的位置和时间表示),请使用分段线工具沿粒子的轨迹跟踪粒子的轨迹,从而绘制粒子移动的每个轨迹。要正确分配运动的方向性,请对所有影片使用相同的所需方向约定绘制折线,以便在所研究的所有单元格内和各单元格之间保持极性一致。例如,从单元格中心向外围绘制折线,反之亦然。通过双击"线"工具调整线宽以匹配轨道的厚度。
  3. 使用 10 的线宽运行 KymoToolBox 插件的绘制 Kymo宏。将显示提示,要求及时校准图像(帧数、帧速率)和空间(x,y 分辨率)。校准后,将生成 Kymograph,并可以保存为 TIFF 文件,用于数据演示或进一步粒子分析。
  4. 在采集期间,使用分段线工具手动跟踪测速仪中的每个粒子,从而分配粒子轨迹。使用"分析/工具"菜单中的ROI 管理器工具将每个粒子轨迹记录为感兴趣的区域 (ROI)。为每个延时视频保存所有 ROIs,以便进一步分析。
    注: 在测速仪上为单个粒子分配正确的轨迹,以实现最精确的传输参数计算至关重要。
    1. 运行 KymoToolBox 插件的分析Kymo宏。将打开一个窗口,要求从下拉菜单中定义粒子运动的"向外"方向(从左到右或反之亦然)。此选择取决于步骤 6.2 中确定的相对于细胞核或细胞外围的荧光货物的位置。例如,如果原子核位于货物左侧,而步骤6.2中的折线从原子核上绘制,则将外向粒子运动定义为"从左到右"。
    2. 在"分析 Kymo"窗口中定义限制速度(货物被视为移动器的最低速度)。对于以快速细胞内运输速度移动的货物,0.1 μm/秒是一个合适的选择。修改此值以调整软件对每个感兴趣的货物的敏感度。调整线宽以匹配每个粒子轨迹的厚度。
    3. 在"分析 kymo"窗口中选择"记录所有数据记录外推坐标选项"。这将计算各种货物运输参数,包括平均速度、向内速度、向外速度、累积行驶距离、向内或向外行驶的距离、每个粒子的开关数、时间百分比向每个方向移动或暂停等。然后,根据 kymograph 将各个轨道计算的数据集中起来,并保存在特定于每个图像的文本文件中。
      注:分析 Kymo的"显示彩色 Kymo"选项生成路径在原始 Kymograph 上的彩色编码叠加。向外移动的粒子以绿色着色,向内以红色着色,以蓝色为静止粒子。"分析 Kymo"宏的"原始堆栈上的报表坐标"选项生成外推对象在原始延时视频和 kymograph 上位置的颜色编码叠加。

Representative Results

上文概述的建立原小鼠MD星形细胞的协议应产生可重复的高质量培养物。虽然培养物最初包含星形细胞、成纤维细胞和其他胶质细胞的组合,包括微胶质和寡核苷酸细胞(图1Bi,Biv;红色箭头),但将AraC添加到DIV5-DIV7之间的混合培养物中,将这些污染物细胞的增殖。结合AraC处理和基于晃动的纯化策略丰富了星形细胞培养物的纯度(图1Bii),比传统协议只包括纯化步骤(图1Bv;蓝色)箭头)13.用AraC治疗或未治疗的纯化星形细胞培养物的预期形态和组成(由GFAP和4',6-二酰胺-2-phenylindole[DAPI]染色)如图1 Biii,Bvi所示。每个视场的GFAP+细胞百分比(GFAP染色细胞数量与DAPI染色识别的细胞总数之比)显示,使用AraC补充剂,纯度增加超过27%(图1 C.这种高纯度小鼠星形细胞培养,适用于RNA和蛋白质表达、细胞形态和其他功能测定的评估。

我们使用基于脂肪的转染来表达在鼠星细胞中间隙结蛋白Cx43和EAAT1传输器的GFP标记版本。该方法允许在不引起毒性或影响星形细胞生存能力的情况下,在最适宜活细胞成像的水平上暂时表达蛋白质(图2A,E)。同样,使用荧光探针可以快速有效地标记酸性内皮细胞器(图2I),以跟踪其在星形细胞中的动力学。

图2显示了用EAAT1-GFP、Cx43-GFP暂时转染或带有识别酸性内分体囊泡的选择性染料标记的星形细胞中货物动力学分析的代表性结果。这些货物中的每一个都作为荧光双子,装饰着近核区域、细胞醇和星形细胞的过程(图2A,E,I,左面板)。延时数据用于生成跟踪货物时间和空间运动的图形(图2A、E、I、右侧面板)。在这些图形中,指示货物的逆向和逆行运动分别由负(绿线)和正(红线)斜率的轨迹表示。固定囊泡显示为垂直轨迹(蓝线)。Kymograph 分析表明,分析的三种货物类型进行双向运输,偶尔在双向运行快速、过程运行。此外,通过星形细胞(红色盒子)区域量化货物通量,显示货物之间活动颗粒百分比的差异。例如,虽然 70% 的 EAAT1-GFP 双环是静止的(图 2B),但 Cx43-GFP(图 2F)和 45% 的贴有探测标记的内溶于子货物(图2J)则为非活动量。货物之间在运动力上的这些差异可能代表了它们在获得电影的星形细胞区域的正常基线运动。

从kymograph获得的每个粒子沿全时刻度沿X-Y位置变化的精确映射也可用于评估其他运动参数,如货物速度(图2C,G,K)和运行长度(距离)旅行) (图 2D, H, L).可以进一步分析单个货物的运动参数,以确定运动方向的变化(逆向运动与逆行运动)以及粒子运动方向的反转、暂停次数等。这些类型的分析结果可以提供有意义的定量信息,说明在细胞内和细胞外的基础或异常条件下,星形细胞细胞和膜蛋白的细胞分布变化环境。

Figure 1
图1:建立原小鼠星形细胞培养物。
A) 解剖 P2_P4 小鼠大脑所需的步骤.(Bi, iv) 混合胶质文化与 AraC 一起处理 (i) 和未处理 (iv) 的光明场图像。红色箭头表示污染物微胶质。(ii,v)使用AraC处理的纯化星形细胞培养物的图像 (ii) 和未经处理的 (v) .蓝色箭头表示污染物寡核苷酸。(iii,vi)与AraC一起处理的纯化星形细胞培养物的共聚焦图像 (iii) 和未经处理 (vi) 的共聚焦图像.绿色显示 GFAP 染色和 DAPI(蓝色)标签的所有核。(C) GFAP阳性细胞的百分比.数据表示平均值 = SEM._p < 0.001,未配对 t 检验。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:星形细胞中货物动力学的定量分析。
A,E,I)左侧面板:表示 EAAT1-GFP (A)、Cx43-GFP (E) 的星形细胞,或用标记晚期内皮体和裂解体 (I ) 的探针处理。红色框表示用于分析粒子动力学的区域。右侧面板:显示指示货物轨迹的原始和颜色编码的图形。红线代表逆行运输货物、绿线逆行移动货物和蓝线非移动货物。(B,F,J)固定粒子和活动粒子的百分比。(C,G,K)反逆速和逆行速度和 (D, H,L) 运行长度的量化.数据表示均值 = SEM。请点击此处查看此图的较大版本。

Discussion

在这里,我们描述了一种实验性方法,用于在高纯度原生小鼠皮质MD星形细胞中使用延时视频显微镜来表达、可视化和跟踪荧光标记的细胞器和膜蛋白。我们还概述了测量粒子动力学的方法。在原星形细胞中直接显示蛋白质和细胞器动力学,为研究这些细胞体内细胞内迁移的调节提供了一个有力的工具。

上述建立小鼠MD星形细胞培养的方法结合了其他已公布的协议13、14、15的步骤,这既产生了更简单的方法,又提高了纯度和质量文化。AraC15治疗和基于晃动的纯化 13、14 可产生纯度高达 98%的星形细胞培养物(根据 GFAP+细胞总细胞的比例进行评估),在我们的示例中,这可产生仅受纯化步骤的培养物纯度提高27%(图1B,C)。用这种方法获得的小鼠星形细胞的高纯度培养物与麦卡锡和德韦利斯14为大鼠星形细胞培养物报告的值(通过酶测定和电子显微镜评估)相似。然而,麦卡锡/德韦利斯方法,不包括AraC治疗,需要更长的摇动步骤(15-18小时)和两轮额外的纯化14。

在我们的示例中,我们表明此方案足够敏感,能够捕获星形细胞中各种膜蛋白和细胞器之间的运动性差异,这些细胞可能代表其个体的细胞内行程和细胞功能。尽管我们的示例演示了此协议在基础条件下的效用,但这种方法可以很容易地调整,以在广泛的研究问题中测量传输参数。例如,具有轻微修改的类似协议可用于描述体外星形细胞中的迁移事件,以响应细胞内或细胞外环境,如细胞损伤、毒性、致病突变、突触活性(在神经元和星形细胞的混合培养物等。同样,多个货物或细胞器的共同表达和可视化,每个单独标记不同的荧光团,也可用于评估共同定位和复杂形成的动态变化,细胞器之间的瞬态相互作用,以及内分泌和膜回收运输活动。

这里介绍的方法的成功主要取决于获得高质量星形培养的能力和对感兴趣的货物进行有效标记的能力。在利用这个程序进行活成像时,密切监测荧光表达以确定转染后的最佳潜伏时间非常重要。平均而言,我们发现,对于分析的货物,24小时潜伏期为活成像采集提供良好的信号强度。转染星形细胞的长期孵育会导致荧光标记蛋白的高表达,从而诱导蛋白质聚集,从而改变货物定位和动力学,并削弱培养物的健康。星形细胞非常容易受到身体损伤和培养环境变化的影响,这可能导致转录和细胞反应的诱导,包括反应。因此,减少洗涤步骤之间的时间间隔,并尽量减少培养物在空气中的暴露,以及孵化和采集期间温度或光强度的显著变化至关重要。

总之,这里介绍的方法可用于评估和量化星形细胞中蛋白质和细胞器定位的动态变化。它们提供了宝贵的工具,允许检查在生理和病理条件下的天体细胞反应的变化。

Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

DNL作为西蒙斯学者得到北卡罗来纳大学教堂山分校(UNC)医学院的支持。TWR得到了UNCPREP赠款R25 GM089569的支持。使用UNC神经科学中心显微镜核心设施的工作部分得到了NIH-NINDS神经科学中心支持赠款P30 NS045892和NIH-NICHD智力和发育障碍研究中心支持赠款U54的支持支持。HD079124。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.5% Trypsin (10x) Gibco 15090-046
Benchtop Centrifuge Thermo Scientific 75-203-637 Sorvall ST8 Centrifuge
Cell Culture Grade Water Gen Clone 25-511
Cell Culture Microscope Zeiss WSN-AXIOVERT A1 Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities
Cytosine Arabinoside Sigma C1768-100MG (AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage
DAPI Sigma D9542-5MG Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining.
Dissecting Microscope Zeiss Stemi 305
Dissecting Scissors F.S.T 14558-09
Dulbecco's Modified Eagle Medium Gen Clone 25-500
Fetal Bovine Serum Gemini 100-106 Heat-Inactivated
FIJI (Fiji is Just Image J) NIH Version 1.52i
Fine Tip Tweezers F.S.T 11254-20 Style #5
Fluorescence light source Excelitas 012-63000 X-Cite 120Q
GFAP antibody Cell Signaling 3670S GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody
Glass Bottom Dishes Mattek corporation P35G-1.5-14-C 35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated
Graefe Forceps F.S.T 11054-10 Graefe Iris Forceps with curved tips
Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes) Life Technologies L7526 LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice.
Hank's Balanced Salt Solution (10x) Gibco 14065-056 Magnesium and calcium free
Imaging Media Life Technologies A14291DJ Live Cell Imaging Solution
Inverted Confocal Microscope Zeiss LSM 780
KymoToolBox https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox
Lipofection Enhancer Reagent Life Technologies 11514015 Plus Reagent
Lipofection Reagent Life Technologies 15338100 Lipofectamine LTX reagent
Orbital shaking incubator New Brunswick Scientific 8261-30-1008 Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control
Penicillin/Strepomycin solution (100x) Gen Clone 25-512
Phosphate Buffered Saline (10x) Gen Clone 25-507x
Poly-D-Lysine Hydrobromide Sigma P7405 Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing
Reduced serum medium Gibco 31985-062 OPTI-MEM
Tissue Culture Flasks Olympus Plastics 25-209 75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap
Tissue culture incubator Thermo Scientific 51030285 HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control
Tris-Base Sigma T1503 8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5
Tris-HCl Sigma T3253 4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Gibco 25200072
Vacuum-Driven Filter Systems Olympus Plastics 25-227 500 ml, PES membrane, 0.22 µm
Vannas scissors straight Roboz RS-5620

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References

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可视化和分析星形细胞中细胞内器官和其他货物的细胞内传输
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Creighton, B. A., Ruffins, T. W., Lorenzo, D. N. Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes. J. Vis. Exp. (150), e60230, doi:10.3791/60230 (2019).More

Creighton, B. A., Ruffins, T. W., Lorenzo, D. N. Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes. J. Vis. Exp. (150), e60230, doi:10.3791/60230 (2019).

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