ここでは、マウスアストロサイトにおけるオルガネラの細胞内輸送と血漿膜タンパク質の取引を可視化するインビトロライブイメージング法について述べる。このプロトコルはまた、貨物輸送の旅程と運動学を決定するための画像分析方法論を提示する。
アストロサイトは、成人の脳の中で最も豊富な細胞型の一つです, 彼らは機能の多重性で重要な役割を果たしています.脳恒常性の中心的なプレーヤーとして、アストロサイトは重要な代謝産物と緩衝細胞外水、イオン、グルタミン酸をニューロンに供給します。「三分詞」シナプスの不可欠なコンポーネントは、アストロサイトもシナプスの形成、剪定、メンテナンス、および変調において重要です。これらの高度にインタラクティブな機能を可能にするために、アストロサイトは、細胞を含む多数の特殊な膜タンパク質を介して、他のグリア細胞、ニューロン、脳血管系、および細胞外環境と通信します。接着分子、アクアポリン、イオンチャネル、神経伝達物質トランスポーター、ギャップ接合分子。この動的フラックスをサポートするために、星状細胞は、ニューロンと同様に、緊密に調整され、効率的な細胞内輸送に依存しています。細胞内人身売買が広範囲に減少しているニューロンとは異なり、アストロサイトにおける微小管ベースの輸送はあまり研究されていない。それにもかかわらず、細胞膜タンパク質および細胞内オルガネラ輸送の外細胞および内嚢胞性人身売買は、アストロサイトの正常な生物学を調整し、これらのプロセスはしばしば病気または傷害に反応して影響を受ける。ここでは、高品質のマウスアストロサイトを培養し、目的の星状タンパク質および小器官を蛍光的に標識し、タイムラプス共焦点顕微鏡を用いて細胞内輸送ダイナミクスを記録するための簡単なプロトコルを提示する。また、利用可能な画像解析ソフトウェア(ImageJ/FIJI)プラグインを使用して、取得したムービーから関連するトランスポートパラメータを抽出および定量化する方法についても説明します。
アストロサイトは、成人中枢神経系で最も豊富な細胞であり、そこではユニークな発達および恒容性機能1を実行する。アストロサイトは、シナプス形成を促進する神経伝達物質受容体、トランスポーター、および細胞接着分子を含む三分詞シナプスの一部として、前および後の末端との直接接触を通じてシナプスの発達を調節するとニューロン-星状細胞通信2.さらに、アストロサイトはシナプス伝達を積極的に制御し、シナプス裂から興奮性神経伝達物質を迅速に除去し、神経伝達物質をリサイクルし、シナプス剪定に参加することにより、神経興奮毒性を防ぎます3,4,5,6.これらの非常にインタラクティブな機能を可能にするために、アストロサイトは、他のグリア細胞と、細胞接着分子、アクアポリン、イオンチャネルを含む特殊な膜タンパク質を介してニューロンと、自分自身の間で通信します。神経伝達物質トランスポーター、およびギャップ接接点分子。アストロサイトは、細胞内および細胞外環境の変動に応じて、これらのタンパク質の表面レベルを積極的に変化させる7.さらに、ミトコンドリア、脂質液滴、分解およびリサイクルオルガネラのレベルと分布の変化は、エネルギー供給、代謝物の利用可能性、および星状細胞機能に不可欠な細胞クリアリングプロセスを調節し、生存。
アストロサイトにおける膜タンパク質およびオルガネラの人身売買および位置の動的変化は、貨物運動性を促進する運動タンパク質およびアダプターの協調機能によって促進される8、9。同様に、膜タンパク質の表面レベルは、内部化およびリサイクルイベント10を通じて変調される。これらの貨物は、アクチン、微小管、およびおそらく中間フィラメントトラック8の複雑なネットワークを介して輸送されます。成長する微小管プラス末端に蓄積する末結合タンパク質1(EB1)の免疫蛍光染色に基づく研究は、微小管の鎖束が末端から放射し、そのプラス端を向いて拡張することを示唆している。周辺11.しかし、生細胞イメージングを用いて微小管やその他の細胞骨格素子の組織と極性を総合的に調べると、まだ不足している。オルガネラや膜タンパク質のダイナミクスの基礎となるメカニズムの多くは、ニューロンやその他の細胞型で広く研究されているが、アストロサイトの貨物運動性はあまりよく理解されていない。アストロサイトにおけるタンパク質およびオルガネラ分布の変化に関する我々の現在の知識のほとんどは、貨物ダイナミクス7の正確な空間的および時間的検査を妨げる固定製剤の従来の抗体ベースの標識に基づいている。 12.
ここでは、高純度の一次マウス星状細胞培養におけるライブイメージング用膜タンパク質および小器官に標識する方法について説明する。このプロトコルを使用して、ギャップ接合タンパク質コネキシン43(Cx43-GFP)および興奮性アミノ酸を含むトランスフェクト星状細胞における緑色蛍光タンパク質(GFP)タグ付き膜タンパク質の動的局在を追跡する例を提供します。トランスポーター1(EAAT1-GFP)。また、蛍光酸性プローブを用いて酸性小器官を可視化し、生きた星状細胞におけるその人身売買のダイナミクスに従うことも説明する。最後に、タイムラプスデータを分析して、個々の貨物の輸送パラメータを抽出して評価する方法を示します。
ここでは、高純度一次マウス皮質MDアストロサイトにおけるタイムラプスビデオ顕微鏡を用いて、蛍光タグ付きオルガネラおよび目的の膜タンパク質を発現、視覚化、追跡する実験的アプローチについて説明する。また、粒子ダイナミクスを測定する方法論についても概説する。一次星状細胞におけるタンパク質および小器官ダイナミクスの直接可視化は、インビトロでこれらの細胞におけ?…
The authors have nothing to disclose.
DNLは、シモンズ学者としてチャペルヒル(UNC)医学部のノースカロライナ大学によってサポートされました。TWR は UNC PREP グラント R25 GM089569 によってサポートされました。UNC神経科学センター顕微鏡コア施設を用いる研究は、NIH-NINDS神経科学センター支援助成金P30 NS045892及びNIH-NICHD知的発達障害研究センター支援助成金U54の助成を受け、一部支援を受けた。HD079124
2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | |
Benchtop Centrifuge | Thermo Scientific | 75-203-637 | Sorvall ST8 Centrifuge |
Cell Culture Grade Water | Gen Clone | 25-511 | |
Cell Culture Microscope | Zeiss | WSN-AXIOVERT A1 | Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities |
Cytosine Arabinoside | Sigma | C1768-100MG | (AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage |
DAPI | Sigma | D9542-5MG | Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining. |
Dissecting Microscope | Zeiss | Stemi 305 | |
Dissecting Scissors | F.S.T | 14558-09 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gen Clone | 25-500 | |
Fetal Bovine Serum | Gemini | 100-106 | Heat-Inactivated |
FIJI (Fiji is Just Image J) | NIH | Version 1.52i | |
Fine Tip Tweezers | F.S.T | 11254-20 | Style #5 |
Fluorescence light source | Excelitas | 012-63000 | X-Cite 120Q |
GFAP antibody | Cell Signaling | 3670S | GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody |
Glass Bottom Dishes | Mattek corporation | P35G-1.5-14-C | 35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated |
Graefe Forceps | F.S.T | 11054-10 | Graefe Iris Forceps with curved tips |
Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes) | Life Technologies | L7526 | LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice. |
Hank's Balanced Salt Solution (10x) | Gibco | 14065-056 | Magnesium and calcium free |
Imaging Media | Life Technologies | A14291DJ | Live Cell Imaging Solution |
Inverted Confocal Microscope | Zeiss | LSM 780 | |
KymoToolBox | https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox | ||
Lipofection Enhancer Reagent | Life Technologies | 11514015 | Plus Reagent |
Lipofection Reagent | Life Technologies | 15338100 | Lipofectamine LTX reagent |
Orbital shaking incubator | New Brunswick Scientific | 8261-30-1008 | Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control |
Penicillin/Strepomycin solution (100x) | Gen Clone | 25-512 | |
Phosphate Buffered Saline (10x) | Gen Clone | 25-507x | |
Poly-D-Lysine Hydrobromide | Sigma | P7405 | Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing |
Reduced serum medium | Gibco | 31985-062 | OPTI-MEM |
Tissue Culture Flasks | Olympus Plastics | 25-209 | 75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap |
Tissue culture incubator | Thermo Scientific | 51030285 | HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control |
Tris-Base | Sigma | T1503 | 8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5 |
Tris-HCl | Sigma | T3253 | 4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5 |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
Vacuum-Driven Filter Systems | Olympus Plastics | 25-227 | 500 ml, PES membrane, 0.22 µm |
Vannas scissors straight | Roboz | RS-5620 |