Summary
Este trabalho apresenta um protocolo para realizar um implante estereotódico e neurocirúrgico de matrizes de microeletrodos no marmoset comum. Este método permite especificamente gravações electrofisiológicas em animais de comportamento livre, mas pode ser facilmente adaptado a qualquer outra intervenção neurocirúrgica semelhante nesta espécie (por exemplo, cânula para a administração de medicamentos ou eletrodos para estimulação cerebral).
Abstract
Marmosets (Callithrix jacchus) são pequenos primatas não-humanos que estão ganhando popularidade em pesquisas biomédicas e pré-clínicas, incluindo as neurociências. Phylogenetically, estes animais são muito mais perto dos seres humanos do que roedores. Eles também exibem comportamentos complexos, incluindo uma ampla gama de vocalizações e interações sociais. Aqui, um procedimento Neurosurgical Stereotaxic eficaz para a implantação de matrizes do elétrodo da gravação no marmoset comum é descrito. Este protocolo igualmente detalha as etapas pre-e postoperative do cuidado animal que são exigidos executar com sucesso tal cirurgia. Finalmente, este protocolo mostra um exemplo do potencial local do campo e das gravações da atividade do ponto em um marmoset de comportamento livre 1 semana após o procedimento cirúrgico. Globalmente, este método oferece uma oportunidade para estudar a função cerebral em marmosets acordados e livremente comportando. O mesmo protocolo pode ser prontamente utilizado por pesquisadores que trabalham com outros pequenos primatas. Além disso, pode ser facilmente modificada para permitir outros estudos que necessitem de implantes, como estimulação de eletrodos, microinjeções, implante de optrodes ou cânulas de guia, ou ablação de regiões discretas de tecido.
Introduction
Os saguis comuns (Callithrix jacchus) estão ganhando o reconhecimento como um organismo modelo importante em muitos campos da pesquisa, incluindo a neurociência. Estes primatas do novo mundo representam um importante modelo animal complementar para os roedores e outros primatas não humanos (NHPs), como o macaque rhesus. Como roedores, estes animais são pequenos, fáceis de manipular, e relativamente econômicos para cuidar e raça1,2,3,4, emcomparação com nhps maior. Além disso, estes animais têm uma propensão para geminação e alta fecundidade em relação a outros nhps1,2,3. Outra vantagem que o marmoset tem sobre muitos outros primatas é que as modernas ferramentas de biologia molecular3,4,5,6,7 e um genoma seqüenciado2 ,3,4,5,8 foram usados para modificá-los geneticamente. Ambos os animais Knock-in usando Lentivirus5, e knock-out animais usando nucleases de zinco-dedo (ZFNs) e transcrição ativador-como nucleases EFETORAS (Talens)7, produziram animais fundadores viáveis.
Uma vantagem em relação aos roedores é que os saguões, como primatas, são filogeneticamente mais próximos dos humanos3,5,6,9,10,11. Como os seres humanos, os saguis são animais diurnos que dependem de um sistema visual altamente desenvolvido para orientar muito do seu comportamento10. Além disso, os saguis exibem complexidade comportamental, incluindo uma ampla gama de comportamentos sociais, como o uso de diferentes vocalizações3, permitindo que os pesquisadores endereçam questões não possíveis em outras espécies. De uma perspectiva neurocientífica, os saguis têm lissencefalia cérebros, ao contrário do mais comumente usado Rhesus macaque9. Além disso, os saguis têm um sistema nervoso central similar aos seres humanos, incluindo um córtex pré-frontal mais altamente desenvolvido9. Juntas, todas essas características posicionam os saguis como um modelo valioso para estudar a função cerebral na saúde e na doença.
Um método comum para estudar a função cerebral envolve a implantação de eletrodos em locais anatomicamente específicos por meio de neurocirurgia estereotaxica. Isso permite a gravação cronical da atividade neural em diferentes áreas-alvo em animais acordados e de comportamento livre12,13. A neurocirurgia estereotómica é uma técnica indispensável usada em muitas linhas de pesquisa, pois permite direcionamento preciso de regiões neuroanatômicas. Comparado à literatura do macaque e do roedor, há poucos estudos publicados que descrevem a neurocirurgia Stereotaxic específica ao marmoset, e tendem a fornecer o detalhe escasso das etapas envolvidas na cirurgia. Além disso, aqueles com maior detalhe concentram-se principalmente nos procedimentos para a gravação de eletrofisiologia em animais de cabeça restrita14,15,16,17.
A fim de facilitar a adoção mais ampla de saguis como modelo de organismo na pesquisa em neurociência, o presente método define etapas específicas necessárias para uma neurocirurgia estereotóica bem-sucedida nesta espécie. Além da implantação de matrizes de gravação, conforme detalhado no presente método, a mesma técnica pode ser adaptada para muitas outras extremidades experimentais, incluindo a implantação de eletrodos estimulantes para o tratamento de doenças18 ou condução causalmente comportamento do circuito19; implantação de cânulas guia para extração e quantificação de neurotransmissores20, injeções de reagentes, incluindo aquelas para indução de modelos de doenças12 ou para os estudos de traçado de circuitos15; ablação de regiões discretas do tecido21; implantação de optrodes para estudos optogenéticos22; implantação de janelas ópticas para análise microscópica cortical23; e implantação de matrizes eletrocorticográficas (ECoG)24. Assim, o objetivo geral deste procedimento é delinear as etapas cirúrgicas envolvidas na implantação de matrizes de microeletrodos para gravações eletrofisiológicas crônicas em marmosets de comportamento livre.
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Protocol
Experimentos com animais foram realizados de acordo com o guia nacional de saúde para o cuidado e uso de animais de laboratório e aprovados pelo Comitê de ética do Instituto Santos Dumont (protocolo 02/2015AAS).
1. preparação da cirurgia
- Fixe cada matriz de eletrodo a um suporte de eletrodo compatível com o quadro estereotódico a ser usado.
- Conecte um suporte do elétrodo ao micromanipulador Stereotaxic e ajuste um Microwire às coordenadas interaural. Repita isto para as matrizes e os suportes adicionais do elétrodo, se necessário.
Nota: a coordenada interaural de todo o Microwire pode ser usada para calcular as coordenadas da implantação para a disposição inteira, porque a distância relativa entre os ferromagnéticos é constante. Quando a matriz tem feixes com comprimentos diferentes, a coordenada interaural do fio mais longo é a mais conveniente de usar para definir o zero interaural. - Retire os suportes dos eléctrodos do micromanipulador estereotódico e esterilize os conjuntos (eléctrodo ligado ao suporte do eléctrodo) num armário de luz ultravioleta (UV) durante pelo menos 2 h.
- Prenda uma agulha de 24 G a um suporte estereotódico da sonda, conecte-a ao micromanipulador e defina as coordenadas interaural para a ponta da agulha.
Nota: antes da cirurgia, as coordenadas de todas as craniotomias devem ser predefinidas como um perímetro 200 μm2 maior do que a posição ântero-posterior (AP) e mediolateral (ml) do local de implantação alvo da matriz. Use o conjunto do suporte da agulha-sonda de 24 G para determinar a posição das craniotomias no crânio com base nas coordenadas interaural zero. - Retire o suporte da sonda do micromanipulador e esterilize a montagem em um armário UV por pelo menos 2 h.
- Reúna 6 − 8 parafusos de titânio ou aço inoxidável. Solda um fio terra para metade deles.
- Organize e esterilize todos os restantes instrumentos, equipamentos e materiais descartáveis necessários para a cirurgia.
2. procedimentos pré-operatórios
Nota: dois saguis machos adultos (Callithrix jacchus) com peso de 320 – 370 g foram utilizados neste estudo. Assegure-se de que o animal não tenha comido durante 6 h antes da indução da anestesia.
- Anestesie o animal com injeção intramuscular de atropina (0, 5 mg/kg) para reduzir salivação e secreções brônquicas. Verifique a falta de respostas do pedal.
- Após 5 min aplicar cetamina (10 − 20 mg/kg) intramuscularmente.
- Raspar a cabeça do animal usando um aparador de barbeiro elétrico.
- Administrar tramadol (2 mg/kg) intramuscularmente como um analgésico geral.
- Intubar o animal.
- Usando uma máscara, expor o marmoset ao isoflurano no oxigênio de 1 − 2% com uma taxa de fluxo de 1 − 5 L/min para induzir a anestesia profunda. Quando o animal é profundamente anestesiado, reduza e mantenha o isoflurano em 1 − 3 L/min.
- Prenda uma faixa elástica à mesa cirúrgica com fita adesiva.
- Posicione o marmoset em uma posição supina com a cabeça para o técnico e coloc a faixa elástica na boca do marmoset atrás de seus caninos.
Nota: é melhor posicionar a cabeça de tal forma que a superfície dorsal é apontada para o chão e seu rosto é para o técnico. - Usando uma sonda de ponta de algodão, esfregue a língua do marmoset seco, e agarrá-lo em uma mão para manter a boca aberta.
- Pulverize a lidocaína a 10% na ponta do tubo endotraqueal.
- Insira o tubo endotraqueal de diâmetro de 2,0 mm, não algemado na traquéia até que a marca de 4,0 cm esteja na entrada da traquéia.
- Prenda o tubo ao conjunto da anestesia com o ventilador artificial ajustado a 40 respirs/minuto e confirme a expansão e a contração apropriadas da caixa.
Nota: neste momento, o isoflurano e o oxigénio devem ser entregues através do tubo endotraqueal, não a máscara. - Retire a faixa elástica da boca do marmoset para que o tubo endotraqueal possa ser gravado na mandíbula.
- Posicione o marmoset em uma posição propensa na linha do frame Stereotaxic e fixe a cabeça do animal no frame Stereotaxic.
- Primeiro, insira a ponta da barra da orelha direita no canal auditivo direito do animal.
- Em seguida, insira a ponta da barra da orelha esquerda no canal auditivo esquerdo.
- Centrar a cabeça do animal no centro do quadro estereotódico e fixar as barras de ouvido no lugar.
- Insira o bocal na boca do animal e ajuste a altura para que toque no palato do animal. Ao mesmo tempo, posicione as barras orbitais na superfície inferior do osso orbital.
- Certifique-se de que a superfície inferior do osso orbital é alinhada horizontalmente com o centro das barras da orelha.
- Ligue um oxímetro de pulso portátil à mão do marmoset. Assegure-se de que a freqüência cardíaca esteja dentro de 154 − 180 batidas/minuto (BPM) para a duração da cirurgia; muitas vezes uma frequência cardíaca acima de 200 BPM implica que o animal está acordando. Assegure-se de que a saturação de oxigênio esteja acima de 95%. Pode ocasionalmente cair a 90% sem dano.
Nota: se a frequência cardíaca cair abaixo de 154 BPM, diminua o isoflurano. - Posicione a sonda de temperatura retal conectada a uma almofada de aquecimento homeotérmica no ânus, com a temperatura desejada ajustada para 37 ° c. Tape este sensor para a cauda para mantê-lo fixado no lugar.
- Aplique o lubrificante oftálmica estéril aos olhos.
- Limpe e desinfete a cabeça do animal com clorexidina e iodo povidona antes de cobrir o animal com um campo cirúrgico.
Nota: realize todos os procedimentos cirúrgicos seguintes em condições assépticas.
3. procedimentos cirúrgicos
- Aplique o analgésico local subcutaneamente (por exemplo, lidocaína 20 mg/mL, 0,1 mL) no local da incisão pretendida. Faça uma incisão na linha média do couro cabeludo.
- Expor e preparar a superfície do crânio.
- Retire cuidadosamente o músculo temporal do crânio. Primeiro, use um bisturi para cortar a fáscia na sua inserção no crânio. Em seguida, separe suavemente o músculo temporal do crânio usando uma raspatória periosteal.
- Remova o periósteo de todo o crânio exposto usando um raspatory periosteal.
- Controle o sangramento com um cotonete de algodão estéril, se necessário.
- Limpe a superfície óssea com peróxido de hidrogênio.
- Delinear a localização da craniotomia marcando seus cantos com furos de rebarba rasa na superfície óssea. Em seguida, perfurar o perímetro da craniotomia usando uma broca dental na velocidade máxima (ou seja, 350.000 rpm). Adicione algumas gotas de soro fisiológico estéril sobre o crânio durante a perfuração para evitar o superaquecimento. Meça a posição da craniotomia e as coordenadas do implante do eletrodo em relação às coordenadas interaural.
- Implante parafusos no crânio.
- Perfure 6 − 8 furos de rosca no crânio.
- Implante os parafusos de tal forma que cada fio de aterramento parafuso fundido é adjacente e na proximidade de um parafuso inalterado (ou seja, sem um fio de terra anexado a ele).
- Enrole cada fio terra em torno do parafuso adjacente, inalterado.
- Adicione uma gota de tinta prateada entre o fio terra e cada parafuso.
- Retire o osso no centro da craniotomia usando fórceps com uma ponta curvada (por exemplo, pinça McPherson). Mantenha a dura-máter hidratada com soro fisiológico estéril.
- Retire a dura-máter. Use uma agulha hipodérmica estéril (25 ou 26 G) com o chanfro dobrado em aproximadamente 90 ° à punctura e levante a superfície do Mater do dura longe da superfície do cérebro. Em seguida, corte a dura-máter com Microtesoura. Mantenha o cérebro exposto hidratado com soro fisiológico.
Nota: se for observado um sangramento dural significativo, use esponjas de gelatina absorvente estéril embebido em trombina25. - Matrizes do microeletrodo do implante.
- Prenda o suporte de eletrodo esterilizado e o arranjo do eletrodo ao micromanipulador estereotódico.
- Posicione o micromanipulador de forma que o eletrodo esteja nas coordenadas ântero-posteriores e mediolateral desejadas.
- Abaixe a matriz do eletrodo até que a ponta do feixe mais longo toque na superfície do cérebro.
- Insira lentamente a matriz no tecido cerebral até atingir as coordenadas dorsoventrais.
- Cubra o córtex exposto com pequenos pedaços de esponjas de gelatina estéril e absorvente.
- Prenda o elétrodo ao crânio aplicando o acrílico dental ao crânio exposto, a um parafuso, e ao elétrodo.
- Separe o suporte do eléctrodo e retire-o do micromanipulador.
- Repita o procedimento de implantação da etapa 3,7 com as matrizes adicionais, se necessário.
- Enrole junto e solda os fios à terra das matrizes e dos parafusos separados. Use tinta prateada para formar uma ponte ao redor da solda para garantir que uma conexão elétrica tenha sido alcançada.
- Usando o acrílico dental, faça um cinza resistente em torno da extensão lateral das matrizes, e Encase completamente os fios à terra e todo o crânio e os parafusos expor.
- Se necessário, insira uma barra de suporte no headcap. Isto pode ser um cilindro plástico resistente como aqueles de um cotonete de algodão. Sele-o no lugar com o acrílico dental.
Nota: isto pode ser útil em fixar os conectores de cabo da electrofisiologia no lugar mas pode ser desnecessário dependendo do equipamento usado. No método atual, uma haste similar da sustentação é afixada ao estágio principal tais que uma faixa elástica pode robustamente prender os estágios da cabeça no lugar nos conectores. - Suturar a pele ao redor do headcap.
4. recuperação pós-operatória
- Aplique a solução anti-séptico (por exemplo, clorexidina) ao redor da ferida.
- Desligue o fornecimento de isoflurano, mas não o oxigénio e retire o animal do quadro estereotaxico.
- Coloque o animal na almofada de aquecimento com o oxigênio mantido através do tubo endotraqueal.
- Retire o tubo endotraqueal quando os primeiros sinais de reflexos neurogênicos, como laringoespasmo, são observados.
- Mantenha o suprimento de oxigênio com uma máscara até que o animal apresente sinais claros de recuperação anestésica, como reflexos protetores, tônus postural e tentativas de deambular.
- Coloc o animal dentro de uma gaiola limpa em uma sala de recuperação para 24 − 48 h antes de mover o animal a sua gaiola Home. Casa cada animal implantado individualmente.
Nota: porque os saguões tendem a escalar as paredes da gaiola, use uma gaiola com paredes lisas ou cubra as paredes da gaiola com uma superfície lisa para impedir que o animal caia. - Na primeira hora após a cirurgia, observe o animal para observar sinais de angústia ou contato de cabeça descoordenada contra o lado da gaiola.
- Administrar antibióticos (por exemplo, enrofloxacina 5 mg/kg, por via subcutânea, uma vez por dia durante 5 − 7 dias), analgésicos (por exemplo, tramadol oral 1 mg/kg, a cada 8 h por 3 − 5 dias) e anti-inflamatórios (por exemplo, dexametasona 0,5 − 1,5 mg/kg, por via subcutânea, uma vez por dia durante 1 − 3 dias) .
Nota: após uma cirurgia bem sucedida, os animais serão totalmente recuperados dentro de 3 − 5 dias.
5. gravações eletrofisiológicas crônicas em saguis de comportamento livre
- Inicie as sessões de gravação eletrofisiológica pelo menos 1 semana após a cirurgia.
Nota: habituar os animais ao pesquisador e aos ambientes experimentais antes de iniciar todos os procedimentos experimentais durante pelo menos 1 mês. - No início de cada sessão, anestesiam levemente o animal utilizando isoflurano (1 − 5 L/min, 1% O2).
Observação: siga as diretrizes da instituição relevantes sobre a sedação de pequenos primatas. Se as sessões de gravação forem muito frequentes, habituar os animais a serem manuseados para que os cabos possam ser conectados sem anestesia. - Conecte os arrays do eletrodo a um sistema de gravação neural comercial.
- Coloque o animal dentro da câmara experimental.
Nota: a câmara experimental utilizada aqui é uma caixa de acrílico cúbico (0,45 m x 0,45 m x 0,45 m) projetada para avaliar a quantidade e o padrão de atividade motora espontânea26,27. - Aguarde 30 minutos antes de iniciar as gravações para garantir que o animal está totalmente recuperado da anestesia.
Nota: o isoflurano tem uma ação rápida do início e do offset que permita a sedação rápida e o despertar28. Uma vez que o fornecimento de isoflurano é desligado, o animal começará a acordar. O animal está acordado quando permanece na posição vertical e pode deambular livremente na câmara experimental sem cair. Isso leva menos de 15 min. Para garantir a ausência de quaisquer efeitos sedativos, iniciar as gravações 30 min após a interrupção do isoflurano. - Confirme a posição dos implantes da disposição do microelétrodo pós-morte pela coloração de NISSL após a fixação e seccionamento do tecido29.
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Representative Results
A finalidade deste estudo era descrever um procedimento Neurosurgical Stereotaxic para a implantação de matrizes do microelétrodo para gravações eletrofisiológicos no marmoset comum. Uma cirurgia típica (da indução anestésica à recuperação da anestesia) durará aproximadamente 5 − 7 h, dependendo do número de matrizes implantadas. Aqui, duas matrizes foram implantadas simetricamente, uma em cada hemisfério cerebral. Cada matriz continha 32 microfios de aço inoxidável dispostos em sete feixes visando várias estruturas do circuito Ganglia-corticotalâmico basal (Figura 1), mas o projeto do eletrodo e as regiões cerebrais direcionadas podem variar dependendo da Experiência. Após a cirurgia bem sucedida e os procedimentos postoperative, o animal deve inteiramente ser recuperado dentro de 3 − 5 dias. Se a matriz tiver sido fundamentada e implantada corretamente, será possível gravar picos (Figura 2a) e potenciais de campo locais (Figura 2b) em animais que se comportam livremente durante várias semanas ou meses, antes que uma cicatriz gliótica madura seja estabelecida 13,30. Como exemplo, os dados eletrofisiológicos coletados no paradigma experimental aqui descritos têm sido efetivamente utilizados para estudar a atividade simultânea de diferentes regiões do circuito gânglio-corticotalâmico basal durante o período espontâneo, à base de solo locomoção em um modelo da doença de Parkinson26.
Finalmente, uma cirurgia bem-sucedida também envolve a implantação das matrizes nas estruturas direcionadas. Metodologias de imagem não invasivas, como RM ou tomografia, podem ser realizadas após a cirurgia e antes do início das gravações experimentais. O uso dessa metodologia só será possível se os implantes específicos utilizados forem fabricados para serem compatíveis com tais técnicas, e se o pesquisador tiver acesso a equipamentos adequados para animais de pequeno porte. A confirmação final também pode ser realizada após a morte. As seções manchadas de Nissl que contêm as trilhas do elétrodo podem ser usadas para determinar precisamente a posição de cada Microwire implantado (Figura 3). Observe que as faixas do eletrodo em seções coronais aparecem como lágrimas no tecido. Assim, o cuidado extremo deve ser usado quando o corte é realizado para reduzir a chance de criar artefatos que irão confundir a interpretação.
Figura 1: matriz de microeletrodos para implantação em pequenos primatas. A matriz foi composta por 32 microfios de aço inoxidável. Os fios foram de 50 μm de diâmetro e foram organizados em sete feixes destinados a atingir as seguintes áreas: córtex motor primário (M1), putamen (put), caudado (CD), Globus pallidus (GPE), ventrolateral e do lateral do núcleo talâmico (VPL), e núcleo subtalâmico (STN). O espaçamento entre eletrodos em cada feixe foi de 300 μm. O espaçamento entre pacotes depende das coordenadas de destino para cada região cerebral. Informações mais detalhadas sobre o projeto e fabricação de matriz de microeletrodos podem ser encontradas em Nicolelis31, Lehew e nicolelis32, e dizirasa et al.33. Barra de escala = 5 mm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: resultado eletrofisiológico representativo após uma cirurgia bem-sucedida. O painel esquerdo mostra a atividade de espiga de dois neurônios (formas de onda amarelas e verdes) gravados de um eletrodo. O painel direito mostra as oscilações potenciais locais do campo gravadas de 14 elétrodos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: seção de tecido manchado de Nissl demonstrando uma faixa de eletrodo. Esta seção (coordenada anteroposterior, em relação à linha interaural: + 8,0, de acordo com o Atlas por Paxinos e Watson34) retrata uma faixa de eletrodo com a ponta no putamen, como indicado pelo triângulo negro. Barra de escala = 1 mm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este trabalho fornece uma descrição detalhada dos procedimentos envolvidos na implantação de matrizes de gravação de microeletrodos no cérebro de marmoset. Este mesmo protocolo pode ser prontamente utilizado na implantação de eletrodos, sejam eles caseiros ou comercialmente disponíveis, em outros pequenos primatas. Adicionalmente, pode facilmente ser adaptado para outras extremidades experimentais que exigem a segmentação precisa de estruturas do cérebro. Portanto, este protocolo é propositadamente vago em relação às coordenadas estereotómicas e técnicas de perfuração craniana, porque esses são os aspectos que podem variar mais. Por exemplo, para implantar as matrizes usadas nesta cirurgia, as craniotomias foram executadas para abrir duas janelas apropriadamente feitas medida em cada hemisfério. No entanto, ao implantar estruturas robustas e individuais, como cânulas de guia, nem isso nem a durectomia são necessárias. Um pouco, um furo simples da rebarba ao nível do dura será suficiente. Da mesma forma, quando os implantes não elétricos estão envolvidos, não é necessário que os parafusos sejam aterrados. Assim, a etapa 3,9 no protocolo cirúrgico pode ser omitida. Em lugar de, o acrílico dental pode ser usado para cobrir simplesmente o crânio exposto, o implante, e os parafusos.
Independentemente do objetivo experimental específico da Neurocirurgia estereotótaxica, a implementação bem-sucedida do procedimento dado gira em grande parte em torno de boas práticas cirúrgicas. Isto significa que protocolos rigorosos devem ser seguidos para realizar a cirurgia condições assépticas, a fim de prevenir infecções pós-operatórias35. Alguns dos momentos mais críticos estão induzindo e removendo a anestesia. É conseqüentemente essencial que os sinais vitais do animal (freqüência cardíaca, saturação do oxigênio do sangue, e temperatura de corpo) sejam monitorados durante todo o procedimento cirúrgico inteiro36. Se ocorrer uma diminuição da frequência cardíaca com uma queda simultânea na saturação de oxigénio, confirme que o tórax está a inflar e a esvaziar normalmente, caso contrário, a ligação à máquina de respiração pode estar em falta. A primeira coisa que pode ser feito para tentar recuperar a freqüência cardíaca e saturação de oxigênio é diminuir a concentração de isoflurano. Se isso não resolver o problema, a atropina pode ser administrada por via intramuscular para aumentar a frequência cardíaca e tentar estabilizar o animal. Isso deve ser feito de forma extremamente cautelosa, pois a experiência prévia mostra que uma frequência cardíaca acima de 200 BPM sem isoflurano suficiente despertará o animal.
Ao contrário dos roedores, em primatas todas as coordenadas são geralmente medidos em relação à coordenada interaural, não a Bregma e Lambda34. Portanto, é importante medir as coordenadas interaural zero das matrizes de eletrodos e outras sondas antes de fixar a cabeça do animal no aparelho estereotaxico. Além disso, nos saguis o plano horizontal é definido como o plano que passa pela margem inferior do osso orbital e o centro do meato auditivo externo. Assim, é importante alinhar a superfície inferior do osso orbital com o centro das barras de orelha antes de fixar a cabeça no quadro estereotódico. Além disso, os músculos temporais do marmoset cobrem uma área larga do crânio. Assim, muitos alvos neurais necessitam de craniotomias para serem realizados ou em estreita proximidade com esta musculatura. Porque estes músculos são importantes para a comunicação marmoset38, o cirurgião deve lentamente e cuidadosamente separar esta musculatura do crânio para minimizar os danos.
Pesquisadores familiarizados com o trabalho comportamental envolvendo roedores ou saguis devem estar cientes de várias limitações ao realizar eletrofisiologia em nhps de comportamento livre. Em primeiro lugar, no presente arranjo e outros envolvendo matrizes de alta densidade ou matrizes múltiplas, é provável que a indução de anestesia leve será necessária para anexar os conectores de cabo, mesmo após a habituação adequada. Este procedimento, enquanto no âmbito das orientações regulamentares da NIH e de outros países, deve ser realizado com moderação para reduzir o stress mental e físico no marmoset. Além disso, é fundamental que o pesquisador assegure que o animal esteja totalmente recuperado da anestesia antes de iniciar a aquisição de dados, caso contrário a anestesia pode confundir os dados39. Outra limitação relacionada é a presença física do próprio cabo. Enquanto as soluções de gravação sem fio estão se tornando disponíveis40, as opções mais comuns com fio impor uma restrição física sobre o animal. Finalmente, a câmara experimental que está sendo usada igualmente restringirá a escala dos comportamentos disponíveis ao marmoset. Ao contrário dos roedores, os saguões exibem comportamentos únicos (por exemplo, escalada) que não serão possíveis dependendo da câmara experimental que está sendo usada.
Os avanços na ciência e na engenharia materiais estão conduzindo às relações neurais novas41. Procedimentos neurocirúrgicos efetivos, como o descrito neste manuscrito, permitirão que os pesquisadores implementem esses novos e futuros instrumentos em saguis. Combinada com os desenvolvimentos simultâneos na biologia molecular3,4,5, os saguis têm o potencial permitir investigações de perguntas básicas e clínicas importantes na neurociência.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a Bernardo Luiz pela assistência técnica com a filmagem e edição. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Santos Dumont (ISD), pelo Ministério da educação (MEC) e pela coordenação de aperfeiçoamento de pessoal de nível superior (CAPES).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| 683 Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus, Inc. | 55-0000 | |
| Anesthesia Assembly | BRASMED | COLIBRI | |
| Barber Clippers | Mundial | HC-SERIES | |
| Dental Drill | Norgen | B07-201-M1KG | |
| Homeothermic Heating Pad and Monitor | Harvard Apparatus, Inc. | 50-7212 | |
| Marmoset Stereotaxic Frame | Narishige Scientific Instrument Lab | SR-6C-HT | |
| Patient Monitor and Pulse Oximeter | Bionet Co., Ltd | BM3 | |
| Stereotaxic Micromanipulator | Narishige Scientific Instrument Lab | SM-15R | |
| Surgical Microscope | Opto | SM PLUS IBZ | |
| Instruments | |||
| Allis tissue forceps | Sklar | 36-2275 | |
| Alm Retractor, rounded point, 4x4 teeth | Rhosse | RH11078 | |
| Angled McPherson Forceps | Oftalmologiabr | 11301A | |
| Curved Surgial Scissors | Harvard Apparatus, Inc. | 72-8422 | |
| Curved Tissue Forceps | Sklar | 47-1186 | |
| Delicate Dissection forceps | WPI | WP5015 | |
| Dental Drill Bit | Microdont | ISO.806.314.001.524.010 | |
| Essring Tissue Forceps | Sklar | 19-2460 | |
| FG 1/4 Dental Drill Bit | Microdont | ISO.700.314.001.006.005 | |
| Halsey Needle Holder | WPI | 15926-G | |
| Halstead Mosquito forceps | WPI | 503724-12 | |
| Hemostatic Forceps, Straight | Sklar | 17-1260 | |
| Jewler Forceps | Sklar | 66-7436 | |
| McPherson-Vannas Optathalmic microscissor, 3 mm point | Argos Instrumental | ARGOS-4004 | |
| Pereosteal Raspatory | Golgran | 38-1 | |
| Scalpal Handle | Harvard Apparatus, Inc. | 72-8354 | |
| Screwdrivers | Eurotool | SCR-830.00 | |
| Sodering Iron | Hikari | 21K006 | |
| Surgical Scissor | Harvard Apparatus, Inc. | 72-8400 | |
| Toothed forceps | WPI | 501266-G | |
| Disposables/Single Use | |||
| 1 ml sterile syringe with 26 G needle | Descarpack | 7898283812785 | |
| 130 cm x 140 cm surgical field, presterilized | ProtDesc | 7898467276344 | |
| 24G Needle, presterilized | Descarpack | 7898283812846 | |
| 50 cm x 50 cm surgical field, presterilized | Esterili-med | 110100236 | |
| Cotton Tipped Probes, Presterilized | Jiangsu Suyun Medical Materials Co. LTD | 23007 | |
| Cotton tipped Qutips | Higie Topp | 7898095296063 | |
| Electrode Array | Home made | ||
| Endotracheal tube without cuff, internal diameter 2.0 mm, outer diameter 2.9 mm | Solidor | 7898913077201 | |
| Tinned copper wire, 0.15 mm diameter | |||
| M1.4x3 Stainless steel screws | USMICROSCREW | M14-30M-SS-P | |
| Medical Tape | Missner | 7896544910102 | |
| Nylon surgical sutures | Shalon | N540CTI25 | |
| Scalpal Blade, presterilized | AdvantiVe | 1037 | |
| solder | Kester | SN63PB37 | |
| Sterile Saline 0.9% | Isofarma | 7898361700041 | |
| Sterile Surgical Gloves | Maxitex | 7898949349051 | |
| Sterile Surgical Gown | ProtDesc | 7898467281208 | |
| Surgical Gauze, 15 cm x 26 cm presterilized | Héika | 7898488470315 | |
| Gelfoam | Pfizer | ||
| Drugs/Chemicals | |||
| 0.25mg/ml Atropine | Isofarma | ||
| 10% Lidocaine Spray | Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda. | 7896676405644 | |
| 2.5% Enrofloxacino veterinary antibiotic | Chemitec | 0137-02 | |
| Dexametasona Veterinary Anti inflammatory | MSD | R06177091A-00-15 | |
| Hydrogen Peroxide | Farmax | 7896902211537 | |
| Isoflourane | BioChimico | 7897406113068 | |
| Jet Acrylic polymerization solution | Artigos Odontológicos Clássico | ||
| Jet Auto Polymerizing Acrylic | Artigos Odontológicos Clássico | ||
| Ketamine 10% | Syntec | ||
| Lidocaine and Phenylephrine 1.8 ml local anesthetic | SS White | 7892525041049 | |
| Povidone-Iodine solutiom | Farmax | 7896902234093 | |
| Riohex 2% surgical Soap | Rioquímica | 7897780209418 | |
| Silver Paint | SPI Supplies | 05002-AB | |
| Tramadol chloride 50 mg/ml | União Química | 7896006245452 | |
| Refresh gel (polyacrylic acid) | Allergan |
References
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