Summary
Diese Arbeit präsentiert ein Protokoll, um eine stereotaxic, neurochirurgische Implantation von Mikroelektroden-Arrays im gemeinsamen Marmoset durchzuführen. Diese Methode ermöglicht speziell elektrophysiologische Aufnahmen bei frei verhaltenden Tieren, kann aber leicht an alle anderen ähnlichen neurochirurgischen Eingriffe bei dieser Art angepasst werden (z. B. Kanülen zur Arzneimittelverabreichung oder Elektroden zur Hirnstimulation).
Abstract
Marmosets (Callithrix jacchus) sind kleine nicht-menschliche Primaten, die in der biomedizinischen und präklinischen Forschung, einschließlich der Neurowissenschaften, an Popularität gewinnen. Phylogenetisch sind diese Tiere dem Menschen viel näher als Nagetiere. Sie zeigen auch komplexe Verhaltensweisen, einschließlich einer breiten Palette von Vokalisationen und sozialen Interaktionen. Hier wird ein wirksames stereotaxic neurochirurgisches Verfahren zur Implantation von Aufzeichnungselektrodenarrays im gemeinsamen Marmoset beschrieben. Dieses Protokoll beschreibt auch die prä- und postoperativen Schritte der Tierpflege, die erforderlich sind, um eine solche Operation erfolgreich durchzuführen. Schließlich zeigt dieses Protokoll ein Beispiel für lokale Feldpotential- und Spike-Aktivitätsaufzeichnungen in einem frei verhaltenden Marmoset 1 Woche nach dem chirurgischen Eingriff. Insgesamt bietet diese Methode die Möglichkeit, die Gehirnfunktion in wachen und frei verhaltenden Marmosets zu studieren. Das gleiche Protokoll kann leicht von Forschern verwendet werden, die mit anderen kleinen Primaten arbeiten. Darüber hinaus kann es leicht modifiziert werden, um andere Studien zu ermöglichen, die Implantate erfordern, wie die Stimulierung von Elektroden, Mikroinjektionen, die Implantation von Optroden oder Führungskanülen oder die Ablation diskreter Gewebebereiche.
Introduction
Häufige Marmosets (Callithrix jacchus) werden in vielen Forschungsbereichen, einschließlich der Neurowissenschaften, als wichtiger Modellorganismus anerkannt. Diese Primaten der neuen Welt stellen ein wichtiges ergänzendes Tiermodell sowohl für Nagetiere als auch für andere nichtmenschliche Primaten (NHPs) dar, wie z. B. den Rhesusmakaken. Wie Nagetiere sind diese Tiere klein, leicht zu manipulieren und relativ sparsam zu pflegen und zu züchten1,2,3,4, im Vergleich zu größeren NHPs. Darüber hinaus haben diese Tiere eine Neigung zu Städtepartnerschaften und hoher Fruchtbarkeit im Vergleich zu anderen NHPs1,2,3. Ein weiterer Vorteil, den das Marmoset gegenüber vielen anderen Primaten hat, ist, dass moderne molekularbiologische Werkzeuge3,4,5,6,7 und ein sequenziertes Genom2 ,3,4,5,8 wurden verwendet, um sie genetisch zu modifizieren. Sowohl Knock-in-Tiere mit Lentivirus5, als auch Knock-out-Tiere mit Zink-Finger-Nukleasen (ZFNs) und Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektornukleasen (TALENS)7, haben lebensfähige Gründertiere ergeben.
Ein Vorteil gegenüber Nagetieren ist, dass Marmosets, als Primaten, phylogenetisch näher am Menschen sind3,5,6,9,10,11. Wie Menschen sind Marmosets taguale Tiere, die auf ein hoch entwickeltes visuelles System angewiesen sind, um einen Großteil ihres Verhaltens zu leiten10. Darüber hinaus weisen Marmosets Verhaltenskomplexität auf, einschließlich einer breiten Palette von sozialen Verhaltensweisen wie der Verwendung verschiedener Vokalisationen3, die es Forschern ermöglichen, Fragen zu beantworten, die bei anderen Arten nicht möglich sind. Aus neurowissenschaftlicher Sicht haben Marmosets Lissenzephalie Gehirne, im Gegensatz zu den häufiger verwendeten rhesus macaque9. Darüber hinaus haben Marmosets ein zentrales Nervensystem ähnlich wie Menschen, einschließlich einer stärker entwickelten präfrontalen Kortex9. Zusammen positionieren all diese Eigenschaften Marmosets als ein wertvolles Modell, um die Gehirnfunktion bei Gesundheit und Krankheit zu untersuchen.
Eine gängige Methode zur Untersuchung der Gehirnfunktion beinhaltet die Implantation von Elektroden an anatomisch spezifischen Orten mittels stereotaxic Neurochirurgie. Dies ermöglicht die chronische Aufzeichnung der neuronalen Aktivität in verschiedenen Zielbereichen in wachen und frei verhaltenden Tieren12,13. Stereotaxic Neurochirurgie ist eine unverzichtbare Technik in vielen Forschungslinien verwendet, da es eine präzise Ausrichtung auf neuroanatomische Regionen ermöglicht. Im Vergleich zur Makaken- und Nagetierliteratur gibt es weniger veröffentlichte Studien, die die stereotaxic Neurochirurgie spezifisch für das Marmoset beschreiben, und sie neigen dazu, nur spärliche Details der Schritte zu liefern, die an der Operation beteiligt sind. Darüber hinaus konzentrieren sich diejenigen mit mehr Details vor allem auf Verfahren zur Elektrophysiologie-Aufzeichnung bei kopfhaltenden Tieren14,15,16,17.
Um eine breitere Akzeptanz von Marmosets als Modellorganismus in der neurowissenschaftlichen Forschung zu ermöglichen, definiert die vorliegende Methode spezifische Schritte, die für eine erfolgreiche stereotaxic neurosurgery bei dieser Art notwendig sind. Neben der Implantation von Aufzeichnungsarrays, wie in der vorliegenden Methode beschrieben, kann die gleiche Technik für viele andere experimentelle Enden angepasst werden, einschließlich der Implantation von stimulierenden Elektroden zur Behandlung von Krankheiten18 oder kausal fahrend Schaltungsverhalten19; Implantation von Führungskanülen zur Extraktion und Quantifizierung von Neurotransmittern20, Injektionen von Reagenzien, einschließlich der zur Induzieren von Krankheitsmodellen12 oder für Schaltkreisverfolgungsstudien15; Ablation von diskreten Geweberegionen21; Implantation von Optroden für optogenetische Studien22; Implantation von optischen Fenstern für die kortikale mikroskopische Analyse23; und Implantation von elektrokortikographischen (ECoG) Arrays24. Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht daher darin, die chirurgischen Schritte zu skizzieren, die bei der Implantation von Mikroelektroden-Arrays für chronische elektrophysiologische Aufnahmen in frei benehmenden Marmosets involviert sind.
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Protocol
Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt und von der Ethikkommission des Santos Dumont Institute (Protokoll 02/2015AAS) genehmigt.
1. Chirurgische Vorbereitung
- Befestigen Sie jedes Elektroden-Array an einem Elektrodenhalter, der mit dem zu verwendenden Stereotaxienrahmen kompatibel ist.
- Schließen Sie einen Elektrodenhalter an den stereotaxien Mikromanipulator an und stellen Sie einen Mikrodraht an die interauralen Koordinaten. Wiederholen Sie dies ggf. für die zusätzlichen Elektroden-Arrays und Halter.
HINWEIS: Die interaurale Koordinate eines beliebigen Mikrodrahtes kann verwendet werden, um die Implantationskoordinaten für das gesamte Array zu berechnen, da der relative Abstand zwischen den Mikrodrähten konstant ist. Wenn das Array Überbündelungen mit unterschiedlichen Längen hat, ist die interaurale Koordinate des längsten Drahtes am bequemsten zum Einstellen der interauralen Null zu verwenden. - Lösen Sie die Elektrodenhalter vom stereotaxic Mikromanipulator und sterilisieren Sie die Baugruppen (Elektrode am Elektrodenhalter befestigt) in einem ULTRAvioletten Lichtschrank (UV) für mindestens 2 h.
- Befestigen Sie eine 24 G Nadel an einem stereotaxic-Sondenhalter, schließen Sie sie an den Mikromanipulator an und stellen Sie die interauralen Koordinaten für die Spitze der Nadel ein.
ANMERKUNG: Vor der Operation müssen die Koordinaten aller Craniotomien als Perimeter 200 m2 vordefiniert sein, der größer ist als die Anteroposterior- (AP) und die mediolaterale (ML) Position der Zielimplantationsstelle des Arrays. Verwenden Sie die 24 G Nadelsondenhalter-Baugruppe, um die Position der Craniotomien im Schädel auf der Grundlage der Null-Interaural-Koordinaten zu bestimmen. - Lösen Sie den Sondenhalter vom Mikromanipulator und sterilisieren Sie die Baugruppe in einem UV-Schrank für mindestens 2 h.
- Sammeln Sie 6 x 8 Titan- oder Edelstahlschrauben. Löten Sie einen Erdungsdraht auf die Hälfte von ihnen.
- Organisieren und sterilisieren Sie alle verbleibenden Instrumente, Geräte und Einweggeräte, die für die Operation erforderlich sind.
2. Präoperative Verfahren
HINWEIS: In dieser Studie wurden zwei erwachsene männliche Marmosets (Callithrix jacchus) mit einem Gewicht von 320–370 g verwendet. Stellen Sie sicher, dass das Tier vor der Induktion der Anästhesie 6 Stunden lang nicht gegessen hat.
- Anästhesisieren Sie das Tier mit einer intramuskulären Injektion von Atropin (0,05 mg/kg), um Denivat- und Bronchialsekrete zu reduzieren. Überprüfen Sie, ob keine Pedalreaktionen anstehen.
- Nach 5 min Ketamin (10 x 20 mg/kg) intramuskulär auftragen.
- Rasieren Sie den Kopf des Tieres mit einem elektrischen Friseur Clipper.
- Tramadol (2 mg/kg) intramuskulär als allgemeines Schmerzmittel verabreichen.
- Intubieren Sie das Tier.
- Setzen Sie das Marmoset mit einer Maske Isofluran in 1-2% Sauerstoff mit einer Durchflussrate von 1,5 l/min aus, um eine tiefe Anästhesie zu induzieren. Wenn das Tier tief anästhesisiert ist, reduzieren und pflegen Sie Isofluran auf 1 x 3 L/min.
- Befestigen Sie ein elastisches Band mit Klebeband am OP-Tisch.
- Positionieren Sie das Murmeltier in einer Supine-Position mit dem Kopf in Richtung des Technikers und legen Sie das elastische Band in den Mund des Murmeltiers hinter seinen Canines.
HINWEIS: Es ist am besten, den Kopf so zu positionieren, dass die Rückenfläche auf den Boden zeigt und sein Gesicht auf den Techniker gerichtet ist. - Mit einer Sonde mit Baumwollspitzen trocknen Sie die Zunge des Marmosets und greifen Sie sie in einer Hand, um den Mund offen zu halten.
- Sprühen Sie 10% Lidocain auf die Spitze des Endotrachealrohrs.
- Setzen Sie das ungefedte, 2,0 mm Durchmesser Endotrachealrohr in die Luftröhre ein, bis sich die 4,0 cm-Marke am Eingang der Luftröhre befindet.
- Befestigen Sie das Rohr an der Anästhesie-Baugruppe mit dem künstlichen Beatmungsgerät auf 40 Atemzüge/min eingestellt und bestätigen Sie die richtige Ausdehnung und Kontraktion der Brust.
HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt sollten isoflurane und Sauerstoff über das Endotrachealrohr, nicht über die Maske, zugestellt werden. - Entfernen Sie das elastische Band aus dem Mund des Murmelts, damit das Endotrachealrohr an den Kiefer geklebt werden kann.
- Positionieren Sie das Marmoset in einer anfälligen Position in Übereinstimmung mit dem stereotaxic Rahmen und fixieren Sie den Kopf des Tieres in den stereotaxic Rahmen.
- Legen Sie zunächst die Spitze der rechten Ohrstange in den rechten Gehörgang des Tieres ein.
- Als nächstes setzen Sie die Spitze der linken Ohrstange in den linken Gehörgang ein.
- Zentrieren Sie den Kopf des Tieres in der Mitte des stereotaxic Rahmens und fixieren Sie die Ohrleisten an Ort und Stelle.
- Legen Sie das Mundstück in den Mund des Tieres ein und passen Sie seine Höhe so an, dass es den Gaumen des Tieres berührt. Positionieren Sie gleichzeitig die Orbitalbalken an der unteren Oberfläche des Orbitalknochens.
- Stellen Sie sicher, dass die untere Oberfläche des Orbitalknochens horizontal mit der Mitte der Ohrstangen ausgerichtet ist.
- Schließen Sie ein tragbares Pulsoximeter an die Hand des Marmosets an. Stellen Sie sicher, dass die Herzfrequenz für die Dauer der Operation innerhalb von 154 x 180 Schlägen/min (bpm) liegt; oft impliziert eine Herzfrequenz von mehr als 200 bpm, dass das Tier aufwacht. Stellen Sie sicher, dass die Sauerstoffsättigung über 95% liegt. Es kann gelegentlich auf 90% ohne Schaden fallen.
HINWEIS: Sollte die Herzfrequenz unter 154 bpm fallen, verringern Sie das Isofluran. - Positionieren Sie den rektalen Temperaturfühler, der mit einem homeothermischen Heizkissen verbunden ist, in den Anus, wobei die gewünschte Temperatur auf 37 °C eingestellt ist. Befesten Sie diesen Sensor an den Schwanz, um ihn an Ort und Stelle zu halten.
- Steriles ophthalmologisches Schmiermittel auf die Augen auftragen.
- Reinigen und desinfizieren Sie den Kopf des Tieres mit Chlorhexidin und Povidonjod, bevor Sie das Tier mit einem chirurgischen Feld bedecken.
HINWEIS: Führen Sie alle folgenden chirurgischen Eingriffe unter aseptischen Bedingungen durch.
3. Chirurgische Eingriffe
- Lokales Analgetika subkutan (z. B. Lidocain 20 mg/ml, 0,1 ml) an der Stelle des beabsichtigten Schnitts auftragen. Machen Sie einen Schnitt in der Mittellinie der Kopfhaut.
- Belichten und bereiten Sie die Oberfläche des Schädels.
- Lösen Sie den zeitlichen Muskel vorsichtig vom Schädel. Verwenden Sie zunächst ein Skalpell, um die Faszie bei ihrer Einfügung in den Schädel zu schneiden. Dann, sanft trennen Sie den zeitlichen Muskel aus dem Schädel mit einem periosteal entostorischen.
- Entfernen Sie das Periost aus allen exponierten Schädel mit einem periostealen Raspatorium.
- Kontrollieren Sie die Blutung mit einem sterilen Wattestäbchen, falls erforderlich.
- Reinigen Sie die Knochenoberfläche mit Wasserstoffperoxid.
- Markieren Sie die Lage der Kraniotomie, indem Sie ihre Ecken mit flachen Gratlöchern in die Knochenoberfläche markieren. Bohren Sie dann den Umfang der Kraniotomie mit einem Zahnbohrer mit maximaler Geschwindigkeit (d. h. 350.000 U/min). Fügen Sie beim Bohren ein paar Tropfen steriler Saline über den Schädel, um eine Überhitzung zu verhindern. Messen Sie die Position der Kraniotomie und die Koordinaten des Elektrodenimplantats in Bezug auf die interauralen Koordinaten.
- Implantatschrauben in den Schädel.
- Bohren Sie 6-8 Schraublöcher in den Schädel.
- Implantieren Sie die Schrauben so, dass jede Erdungsschraube neben und in der Nähe einer unveränderten Schraube (d. h. ohne an ihm befestigten Erdungsdraht) liegt.
- Winden Sie jeden Erdungsdraht um die angrenzende, unveränderte Schraube.
- Fügen Sie einen Tropfen Silberfarbe zwischen dem Erddraht und jeder Schraube hinzu.
- Entfernen Sie den Knochen in der Mitte der Kraniotomie mit Zangen mit einer gekrümmten Spitze (z. B. McPherson Zange). Halten Sie die Dura mater mit steriler Saline hydratisiert.
- Entfernen Sie die Dura mater. Verwenden Sie eine sterile hypodermische Nadel (25 oder 26 G) mit der Abschrägung bei etwa 90° gebogen, um die Oberfläche des Dura mater sionisch von der Gehirnoberfläche zu punktieren und zu heben. Dann schneiden Sie die Dura mater mit Mikroschere. Halten Sie das exponierte Gehirn mit Saline hydratisiert.
HINWEIS: Wenn signifikante durale Blutungen beobachtet werden, verwenden Sie kautery oder sterile absorbierende Gelatineschwämme in Thrombingetränkt 25. - Implant Microelektroden-Arrays.
- Befestigen Sie den sterilisierten Elektrodenhalter und das Elektrodenarray am stereotaxic Mikromanipulator.
- Positionieren Sie den Mikromanipulator so, dass sich die Elektrode an den gewünschten anteroposterioren und mediolateralen Koordinaten befindet.
- Senken Sie das Elektrodenarray, bis die Spitze des längsten Bündels die Oberfläche des Gehirns berührt.
- Fügen Sie das Array langsam in das Hirngewebe ein, bis es die dorsoventralen Koordinaten erreicht.
- Bedecken Sie den freiliegenden Kortex mit kleinen Stücken steriler, saugfähiger Gelatineschwämme.
- Sichern Sie die Elektrode am Schädel, indem Sie Zahnacryl auf den freiliegenden Schädel, eine Schraube und die Elektrode auftragen.
- Lösen Sie den Elektrodenhalter und entfernen Sie ihn vom Mikromanipulator.
- Wiederholen Sie ggf. den Implantationsvorgang aus Schritt 3.7 mit den zusätzlichen Arrays.
- Winden Sie zusammen und schweißen Sie die Erddrähte der separaten Arrays und Schrauben. Verwenden Sie Silberfarbe, um eine Brücke um die Schweißnaht zu bilden, um sicherzustellen, dass eine elektrische Verbindung hergestellt wurde.
- Mit Zahn-Acryl, machen Sie eine stabile Kopfkappe um die seitliche Ausdehnung der Arrays, und vollständig umhüllen die Erddrähte und alle freiliegenden Schädel und Schrauben.
- Fügen Sie bei Bedarf eine Stützstange in die Kopfkappe ein. Dies kann ein robuster Kunststoffzylinder sein, wie er aus einem Wattestäbchen stammt. Versiegeln Sie es mit dem Zahnacryl.
HINWEIS: Dies kann bei der Befestigung der elektrophysiologischen Kabelanschlüsse an Ort und Stelle hilfreich sein, kann jedoch je nach verwendeter Ausrüstung unnötig sein. Bei der vorliegenden Methode wird eine ähnliche Stützstange an der Kopfstufe so befestigt, dass ein elastisches Band die Kopfstufen an den Anschlüssen robust halten kann. - Nahn die Haut um die Kopfkappe.
4. Postoperative Erholung
- Antiseptische Lösung (z. B. Chlorhexidin) um die Wunde auftragen.
- Schalten Sie die Isofluranversorgung, aber nicht den Sauerstoff aus und entfernen Sie das Tier aus dem stereotaxic Rahmen.
- Legen Sie das Tier auf das Heizkissen mit dem Sauerstoff, der durch das Endotrachealrohr gehalten wird.
- Entfernen Sie die Endotrachealröhre, wenn die ersten Anzeichen von neurogenen Reflexen, wie Laryngospasmen, beobachtet werden.
- Den Sauerstoff weiterhin mit einer Maske zu versorgen, bis das Tier deutliche Anzeichen einer Anästhesieerholung wie Schutzreflexe, Haltungston und Ambulateversuche zeigt.
- Legen Sie das Tier in einen sauberen Käfig in einem Erholungsraum für 24-48 h, bevor Sie das Tier in seinen Hauskäfig bringen. Haus jedes implantierte Tier einzeln.
HINWEIS: Da Marmosets dazu neigen, die Käfigwände zu erklimmen, verwenden Sie einen Käfig mit glatten Wänden oder bedecken Sie die Käfigwände mit einer glatten Oberfläche, um zu verhindern, dass das Tier fällt. - Beobachten Sie in der ersten Stunde nach der Operation, dass das Tier auf Anzeichen von Seenot oder unkoordiniertem Kopfkontakt an der Seite des Käfigs achtet.
- Antibiotika (z. B. Enrofloxacin 5 mg/kg, subkutan, einmal täglich für 5 bis 7 Tage), Analgetika (z. B. orales Tramadol 1 mg/kg, alle 8 h für 3 5 Tage) und entzündungshemmende Medikamente (z. B. Dexamethason 0,5,5 mg/kg, subkutan, einmal täglich für 1 bis 3 Tage) .
HINWEIS: Nach einer erfolgreichen Operation werden die Tiere innerhalb von 3 bis 5 Tagen vollständig geborgen.
5. Chronische elektrophysiologische Aufnahmen in frei verhaltenden Marmosets
- Beginnen Sie die elektrophysiologischen Aufnahmesitzungen mindestens 1 Woche nach der Operation.
HINWEIS: Habituate die Tiere an die Forscher- und Versuchsumgebungen, bevor alle experimentellen Verfahren für mindestens 1 Monat beginnen. - Zu Beginn jeder Sitzung das Tier mit Isofluran (1x5 l/min, 1% O2) leicht befeuchten.
HINWEIS: Befolgen Sie die Richtlinien der zuständigen Institution in Bezug auf die Sedierung kleiner Primaten. Wenn Aufnahmesitzungen sehr häufig sind, gewöhnen Sie die Tiere zu behandeln, so dass Kabel ohne Anästhesie angeschlossen werden können. - Verbinden Sie die Elektroden-Arrays mit einem kommerziellen neuronalen Aufzeichnungssystem.
- Legen Sie das Tier in die Versuchskammer.
HINWEIS: Die hier verwendete Versuchskammer ist eine kubische Acrylbox (0,45 m x 0,45 m x 0,45 m), die entwickelt wurde, um die Menge und das Muster der spontanen motorischen Aktivität26,27zu bewerten. - Warten Sie 30 min, bevor Sie mit den Aufnahmen beginnen, um sicherzustellen, dass das Tier vollständig aus der Anästhesie geborgen wird.
HINWEIS: Isoflurane hat eine schnelle Beginn- und Offset-Aktion, die eine schnelle Sedierung und das Erwachenvon 28ermöglicht. Sobald die Isofluranversorgung ausgeschaltet ist, beginnt das Tier aufzuwachen. Das Tier ist wach, wenn es in aufrechter Position bleibt und kann frei in der Versuchskammer ambulaten, ohne zu fallen. Dies dauert weniger als 15 min. Um das Fehlen von Beruhigungseffekten zu gewährleisten, beginnen Sie die Aufnahmen 30 min nach dem Absetzen des Isoflurans. - Bestätigen Sie die Position der Mikroelektroden-Array-Implantate postmortem durch NISSL Färbung nach der Fixierung und Schnitt desGewebes 29.
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Representative Results
Der Zweck dieser Studie war es, ein stereotaxic neurochirurgisches Verfahren zur Implantation von Mikroelektroden-Arrays für elektrophysiologische Aufnahmen im gemeinsamen Marmoset zu beschreiben. Eine typische Operation (von der Anästhesieinduktion bis zur Anästhesieerholung) dauert ca. 5-7 h, abhängig von der Anzahl der implantierten Arrays. Hier wurden zwei Arrays symmetrisch implantiert, eines in jeder Gehirnhälfte. Jedes Array enthielt 32 Edelstahl-Mikrodrähte, die in sieben Bündeln angeordnet waren, die auf mehrere Strukturen des basalen Ganglien-Kortitathalam-Kreises abzielen (Abbildung 1), aber das Elektrodendesign und die zielgerichteten Hirnregionen können je nach versuch. Nach erfolgreicher Operation und postoperativen Eingriffen sollte das Tier innerhalb von 3 bis 5 Tagen vollständig geborgen werden. Wenn das Array richtig geerdet und implantiert wurde, wird es möglich sein, Spitzen (Abbildung 2A) und lokale Feldpotentiale (Abbildung 2B) bei frei benehmenden Tieren über mehrere Wochen oder Monate aufzuzeichnen, bevor eine reife gliotische Narbe festgestellt wird. 13,30. Beispielsweise wurden die elektrophysiologischen Daten, die in dem hier beschriebenen experimentellen Paradigma gesammelt wurden, effektiv genutzt, um die gleichzeitige Aktivität verschiedener Regionen des basalen Ganglien-Kortitathalam-Kreislaufs während spontaner, bodengestützter Fortbewegung in einem Modell der Parkinson-Krankheit26.
Schließlich beinhaltet eine erfolgreiche Operation auch die Implantation der Arrays in die Zielstrukturen. Nicht-invasive bildgebende Methoden wie MRT oder Tomographie können nach der Operation und vor Beginn experimenteller Aufnahmen durchgeführt werden. Die Anwendung einer solchen Methode wird nur möglich sein, wenn die verwendeten spezifischen Implantate hergestellt werden, um mit diesen Techniken kompatibel zu sein, und wenn der Forscher Zugang zu geeigneten Kleintiergeräten hat. Die ultimative Bestätigung kann auch postmortem durchgeführt werden. Nissl gebeizte Abschnitte, die Elektrodenspuren enthalten, können verwendet werden, um die Position jedes implantierten Mikrodrahtes genau zu bestimmen (Abbildung 3). Beachten Sie, dass Elektrodenspuren in koronalen Abschnitten als Risse im Gewebe erscheinen. Daher muss bei der Schnitterstellung äußerste Sorgfalt angewendet werden, um die Wahrscheinlichkeit zu verringern, Artefakte zu erstellen, die die Interpretation verwirren.
Abbildung 1: Mikroelektroden-Array zur Implantation bei kleinen Primaten. Das Array bestand aus 32 Edelstahl-Mikrodrähten. Die Drähte hatten einen Durchmesser von 50 m und waren in sieben Bündeln organisiert, die folgende Bereiche erreichen sollten: Primärmotorkortex (M1), Putamen (Put), Caudate (Cd), Globus pallidus (GPe), ventrolateraler und ventroposterior lateraler Thalamischer Kern (VPL) und subthalamischen Kern (STN). Der Interelektrodenabstand in jedem Bündel betrug 300 m. Der Zwischenabstände hängt von den Zielkoordinaten für jede Hirnregion ab. Ausführlichere Informationen über Mikroelektroden-Array-Design und -Fertigung finden Sie in Nicolelis31, Lehew und Nicolelis32und Dizirasa et al.33. Maßstabsleiste = 5 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentatives elektrophysiologisches Ergebnis nach einer erfolgreichen Operation. Das linke Panel zeigt die Spitzenaktivität von zwei Neuronen (gelbe und grüne Wellenformen), die von einer Elektrode aufgezeichnet wurden. Das rechte Panel zeigt lokale Feldpotentialschwingungen, die von 14 Elektroden aufgezeichnet wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Nissl-Schnitt für Gebegegewebe, der eine Elektrodenspur demonstriert. Dieser Abschnitt (Anteroposterior-Koordinate, relativ zur interauralen Linie: +8,0, nach dem Atlas von Paxinos und Watson34) zeigt eine Elektrodenspur mit der Spitze am Putamen, wie durch das schwarze Dreieck angegeben. Maßstabsleiste = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Diese Arbeit bietet eine detaillierte Beschreibung der Verfahren bei der Implantation von Mikroelektroden-Aufnahme-Arrays im Marmoset-Gehirn. Das gleiche Protokoll kann leicht verwendet werden, wenn Elektroden, ob hausgemacht oder kommerziell erhältlich, bei anderen kleinen Primaten implantiert werden. Darüber hinaus kann es leicht für andere experimentelle Zwecke angepasst werden, die eine präzise Ausrichtung der Gehirnstrukturen erfordern. Daher ist dieses Protokoll absichtlich vage in Bezug auf stereotaxic Koordinaten und Schädelbohrtechniken, weil dies die Aspekte sind, die am meisten variieren können. Zum Beispiel, um die Arrays in dieser Operation verwendet zu implantieren, Craniotomien wurden durchgeführt, um zwei entsprechend große Fenster in jeder Hemisphäre zu öffnen. Bei der Implantation robuster, individueller Strukturen, wie z.B. Führungskanülen, ist jedoch weder diese noch die Dutrektomie notwendig. Vielmehr genügt ein einfaches Gratloch auf höhe der Dura. Ebenso ist es bei nichtelektrischen Implantaten nicht erforderlich, die Schrauben zu geerdet zu haben. So kann Schritt 3.9 im operationsischen Protokoll weggelassen werden. Stattdessen kann Zahnacryl verwendet werden, um einfach den freiliegenden Schädel, Implantat und Schrauben zu bedecken.
Ungeachtet des spezifischen experimentellen Ziels der stereotaxic Neurochirurgie dreht sich die erfolgreiche Umsetzung des gegebenen Verfahrens weitgehend um gute chirurgische Praktiken. Dies bedeutet, dass strenge Protokolle befolgt werden müssen, um die Operation unter aseptischen Bedingungen durchzuführen, um postoperative Infektionen zu verhindern35. Einige der kritischsten Momente sind induzieren und entfernen Anästhesie. Es ist daher wichtig, dass die Vitalzeichen des Tieres (Herzfrequenz, Blutsauerstoffsättigung und Körpertemperatur) während des gesamten chirurgischen Eingriffs überwacht werden36. Wenn eine Abnahme der Herzfrequenz mit einem gleichzeitigen Rückgang der Sauerstoffsättigung auftritt, bestätigen Sie, dass die Brust normal aufbläht und deflationiert, sonst kann die Verbindung zur Atemmaschine schuld sein. Das erste, was getan werden kann, um zu versuchen, die Herzfrequenz und Sauerstoffsättigung wiederherzustellen, ist die Isoflurankonzentration zu verringern. Wenn dies das Problem nicht löst, kann Atropin intramuskulär verabreicht werden, um die Herzfrequenz zu erhöhen und zu versuchen, das Tier zu stabilisieren. Dies muss äußerst vorsichtig erfolgen, denn die bisherigen Erfahrungen zeigen, dass eine Herzfrequenz über 200 bpm ohne ausreichendes Isofluran das Tier wecken wird.
Im Gegensatz zu Nagetieren werden bei Primaten in der Regel alle Koordinaten relativ zur interauralen Koordinate gemessen, nicht bregma und lambda34. Daher ist es wichtig, die interauralen Nullkoordinaten der Elektrodenarrays und anderer Sonden zu messen, bevor der Kopf des Tieres im stereotaxic-Gerät fixiert wird. Darüber hinaus ist bei Marmosets die horizontale Ebene definiert als die Ebene, die durch den unteren Rand des Orbitalknochens und die Mitte des äußeren auditiven Fleisches geht. Daher ist es wichtig, die untere Oberfläche des Orbitalknochens mit der Mitte der Ohrbügel auszurichten, bevor der Kopf im stereotaxic-Rahmen fixiert wird. Darüber hinaus decken die zeitlichen Muskeln des Marmosets einen weiten Bereich des Schädels ab. Daher erfordern viele neuronale Ziele, dass Craniotomien unter oder in unmittelbarer Nähe zu dieser Muskulatur durchgeführt werden. Da diese Muskeln für die Marmoset-Kommunikation38wichtig sind, muss der Chirurg diese Muskulatur langsam und vorsichtig vom Schädel lösen, um Schäden zu minimieren.
Forscher, die mit Verhaltensarbeiten vertraut sind, an denen Entweder Nagetiere oder Marmosets beteiligt sind, sollten sich mehrerer Einschränkungen bei der Durchführung der Elektrophysiologie bei frei verhaltenden NHPs bewusst sein. Erstens ist es in der gegenwärtigen Anordnung und anderen, die Arrays mit hoher Dichte oder mehrere Arrays betreffen, wahrscheinlich, dass die induzierende Lichtanästhesie erforderlich sein wird, um die Kabelanschlüsse zu befestigen, auch nach entsprechender Gewöhnung. Dieses Verfahren sollte zwar im Rahmen der Regulierungsrichtlinien von NIH und anderen Ländern durchgeführt werden, sollte jedoch sparsam durchgeführt werden, um die psychische und körperliche Belastung des Marmosets zu verringern. Darüber hinaus ist es wichtig, dass der Forscher dafür sorgt, dass das Tier vollständig aus der Anästhesie geborgen wird, bevor mit der Datenerfassung begonnen wird, da sonst die Anästhesie die Daten verwirren kann39. Eine weitere einschränkung ist die physische Anwesenheit des Kabels selbst. Während drahtlose Aufnahmelösungen verfügbar werden40, die häufigeren kabelgebundenen Optionen erzwingen eine physische Einschränkung für das Tier. Schließlich wird die verwendete Versuchskammer auch den Bereich der Verhaltensweisen einschränken, die dem Marmoset zur Verfügung stehen. Im Gegensatz zu Nagetieren zeigen Marmosets einzigartige Verhaltensweisen (z.B. Klettern), die je nach verwendeter Versuchskammer nicht möglich sind.
Fortschritte in der Materialwissenschaft und -technik führen zu den neuartigen neuronalen Schnittstellen41. Effektive neurochirurgische Verfahren, wie sie in diesem Manuskript beschrieben werden, werden es Forschern ermöglichen, diese neuen und kommenden Werkzeuge in Marmosets umzusetzen. In Kombination mit den gleichzeitigen Entwicklungen in der Molekularbiologie3,4,5, haben Marmosets das Potenzial, Untersuchungen wichtiger grundlegender und klinischer Fragen in der Neurowissenschaft zu ermöglichen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren danken Bernardo Luiz für die technische Unterstützung beim Filmen und Bearbeiten. Diese Arbeit wurde vom Santos Dumont Institute (ISD), dem brasilianischen Bildungsministerium (MEC) und coordenaéo de Aperfeiéoamento de Pessoal de Nével Superior (CAPES) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| 683 Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus, Inc. | 55-0000 | |
| Anesthesia Assembly | BRASMED | COLIBRI | |
| Barber Clippers | Mundial | HC-SERIES | |
| Dental Drill | Norgen | B07-201-M1KG | |
| Homeothermic Heating Pad and Monitor | Harvard Apparatus, Inc. | 50-7212 | |
| Marmoset Stereotaxic Frame | Narishige Scientific Instrument Lab | SR-6C-HT | |
| Patient Monitor and Pulse Oximeter | Bionet Co., Ltd | BM3 | |
| Stereotaxic Micromanipulator | Narishige Scientific Instrument Lab | SM-15R | |
| Surgical Microscope | Opto | SM PLUS IBZ | |
| Instruments | |||
| Allis tissue forceps | Sklar | 36-2275 | |
| Alm Retractor, rounded point, 4x4 teeth | Rhosse | RH11078 | |
| Angled McPherson Forceps | Oftalmologiabr | 11301A | |
| Curved Surgial Scissors | Harvard Apparatus, Inc. | 72-8422 | |
| Curved Tissue Forceps | Sklar | 47-1186 | |
| Delicate Dissection forceps | WPI | WP5015 | |
| Dental Drill Bit | Microdont | ISO.806.314.001.524.010 | |
| Essring Tissue Forceps | Sklar | 19-2460 | |
| FG 1/4 Dental Drill Bit | Microdont | ISO.700.314.001.006.005 | |
| Halsey Needle Holder | WPI | 15926-G | |
| Halstead Mosquito forceps | WPI | 503724-12 | |
| Hemostatic Forceps, Straight | Sklar | 17-1260 | |
| Jewler Forceps | Sklar | 66-7436 | |
| McPherson-Vannas Optathalmic microscissor, 3 mm point | Argos Instrumental | ARGOS-4004 | |
| Pereosteal Raspatory | Golgran | 38-1 | |
| Scalpal Handle | Harvard Apparatus, Inc. | 72-8354 | |
| Screwdrivers | Eurotool | SCR-830.00 | |
| Sodering Iron | Hikari | 21K006 | |
| Surgical Scissor | Harvard Apparatus, Inc. | 72-8400 | |
| Toothed forceps | WPI | 501266-G | |
| Disposables/Single Use | |||
| 1 ml sterile syringe with 26 G needle | Descarpack | 7898283812785 | |
| 130 cm x 140 cm surgical field, presterilized | ProtDesc | 7898467276344 | |
| 24G Needle, presterilized | Descarpack | 7898283812846 | |
| 50 cm x 50 cm surgical field, presterilized | Esterili-med | 110100236 | |
| Cotton Tipped Probes, Presterilized | Jiangsu Suyun Medical Materials Co. LTD | 23007 | |
| Cotton tipped Qutips | Higie Topp | 7898095296063 | |
| Electrode Array | Home made | ||
| Endotracheal tube without cuff, internal diameter 2.0 mm, outer diameter 2.9 mm | Solidor | 7898913077201 | |
| Tinned copper wire, 0.15 mm diameter | |||
| M1.4x3 Stainless steel screws | USMICROSCREW | M14-30M-SS-P | |
| Medical Tape | Missner | 7896544910102 | |
| Nylon surgical sutures | Shalon | N540CTI25 | |
| Scalpal Blade, presterilized | AdvantiVe | 1037 | |
| solder | Kester | SN63PB37 | |
| Sterile Saline 0.9% | Isofarma | 7898361700041 | |
| Sterile Surgical Gloves | Maxitex | 7898949349051 | |
| Sterile Surgical Gown | ProtDesc | 7898467281208 | |
| Surgical Gauze, 15 cm x 26 cm presterilized | Héika | 7898488470315 | |
| Gelfoam | Pfizer | ||
| Drugs/Chemicals | |||
| 0.25mg/ml Atropine | Isofarma | ||
| 10% Lidocaine Spray | Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda. | 7896676405644 | |
| 2.5% Enrofloxacino veterinary antibiotic | Chemitec | 0137-02 | |
| Dexametasona Veterinary Anti inflammatory | MSD | R06177091A-00-15 | |
| Hydrogen Peroxide | Farmax | 7896902211537 | |
| Isoflourane | BioChimico | 7897406113068 | |
| Jet Acrylic polymerization solution | Artigos Odontológicos Clássico | ||
| Jet Auto Polymerizing Acrylic | Artigos Odontológicos Clássico | ||
| Ketamine 10% | Syntec | ||
| Lidocaine and Phenylephrine 1.8 ml local anesthetic | SS White | 7892525041049 | |
| Povidone-Iodine solutiom | Farmax | 7896902234093 | |
| Riohex 2% surgical Soap | Rioquímica | 7897780209418 | |
| Silver Paint | SPI Supplies | 05002-AB | |
| Tramadol chloride 50 mg/ml | União Química | 7896006245452 | |
| Refresh gel (polyacrylic acid) | Allergan |
References
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