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Biology

माउस लिवर में सेल प्रकार-विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ेशन

Published: September 17, 2019 doi: 10.3791/60242

Summary

अनुवाद राइबोसोम आत्मीयता शुद्धिकरण (TRAP) सेल प्रकार के विशेष अनुवाद MRNA के तेजी से और कुशल अलगाव सक्षम बनाता है. यहाँ, हम एक विधि है कि जिगर repopulation और TRAP के एक माउस मॉडल में hydrodynamic पूंछ नस इंजेक्शन को जोड़ती है repopulating hepatocytes की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल की जांच प्रदर्शित करता है.

Abstract

चोट के बाद जिगर repopulation स्तनधारियों की एक महत्वपूर्ण विशेषता है जो पर्यावरण विषाक्त पदार्थों के जोखिम के बाद तत्काल अंग विफलता और मौत से बचाता है. जीन अभिव्यक्ति है कि repopulation के दौरान होने में परिवर्तन की गहरी समझ में मदद कर सकता है चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए चोटों की स्थापना में जिगर समारोह की बहाली को बढ़ावा देने के. फिर भी, विशेष रूप से repopulating hepatocytes को अलग करने के तरीके सेल मार्करों की कमी से बाधित कर रहे हैं, सीमित सेल संख्या, और इन कोशिकाओं की कमजोरी. जिगर की चोट की स्थापना में repopulation recapitulate करने के लिए माउस मॉडल के साथ संयोजन के रूप में राइबोसोम आत्मीयता शुद्धि (TRAP) प्रौद्योगिकी का अनुवाद करने के विकास की अनुमति देता है जीन अभिव्यक्ति repopulating की रूपरेखा हेप्टोसाइट्स. TRAP के साथ, सेल प्रकार-विशिष्ट अनुवाद MRNA तेजी से और कुशलता से अलग है. हम एक विधि है कि hepatocytes से MRNA अनुवाद के आत्मीयता के आधार पर अलगाव के साथ TRAP का उपयोग करता है कि चुनिंदा हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP)-टैग ribosomal प्रोटीन (आरपी), GFP: RPL10A व्यक्त विकसित की है. TRAP फ्लोरोसेंट-सक्रिय सेल छँटाई के लिए आवश्यक लंबे समय की अवधि को दरकिनार करता है जो जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल को बदल सकता है। इसके अलावा, के बाद से केवल repopulating hepatocytes GFP व्यक्त: RPL10A संलयन प्रोटीन, अलग MRNA आसपास के घायल hepatocytes और जिगर में अन्य सेल प्रकार से संदूषण से रहित है. आत्मीयता-शुद्ध MRNA उच्च गुणवत्ता का है और जीन अभिव्यक्ति के डाउनस्ट्रीम पीसीआर- या उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण-आधारित विश्लेषण की अनुमति देता है।

Introduction

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कशेरुकी में मुख्य चयापचय अंग के रूप में, जिगर ग्लूकोज homeostasis, सीरम प्रोटीन संश्लेषण, पित्त एसिड स्राव, और विदेशी जीवचयापचय और detoxification के लिए जिम्मेदार है. जिगर के पास तत्काल जिगर की विफलता को रोकने के लिए विषाक्त पदार्थों के संपर्क में घायल पैरेन्काइमा को पुनर्जीवित करने की असाधारण क्षमता होतीहै. हालांकि, पुनर्जनन की विफलता acetaminophen या शराब overconsumption की स्थापना में हो सकता है, जो तीव्र जिगर की विफलता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं2. इसके अलावा, वायरल हेपेटाइटिस संक्रमण, फैटी यकृत रोग, और स्टेटोहेपेटाइटिस के कारण पुरानी जिगर की चोट यकृत फाइब्रोसिस, सिरोसिस, और हेपेटोकोशिकीय कार्सिनोमा3का कारण बन सकती है। अंत चरण जिगर की बीमारी के लिए केवल उपलब्ध उपचारात्मक उपचार प्रत्यारोपण है, लेकिन अंग की कमी से सीमित है, सभी रोगियों के लिए कुशल उपचार को रोकने4. विषाक्त जिगर की चोट के बाद वसूली की प्रक्रिया का एक बेहतर समझ इसलिए उपचार के विकास के लिए महत्वपूर्ण है पुनर्जनन रोगग्रस्त अंग में समारोह बचाव के लिए पर्याप्त प्रोत्साहित करने के लिए.

यकृत पुनर्जनन के अध्ययन के लिए सबसे व्यापक रूप से अनुप्रयुक्त मॉडल प्रणाली कृन्तकों में आंशिक हेपेटेक्टॉमी है, जिसमें यकृत का एक बड़ा हिस्सा तेजी से हेप्टोसाइट विस्तार को प्रोत्साहित करने के लिए पुनर्कृत ीकृत किया जाता है5. हालांकि, आंशिक hepatectomy प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ की कमी के कारण विषाक्त जिगर की चोट के बाद hepatocyte विस्तार recapitulate नहीं करता है और hepatocye सेल नेक्रोसिस अक्सर मनुष्यों में तीव्र जिगर की चोट की स्थापना में मनाया6. अंग नवीकरण के इस रूप को मॉडल करने के लिए एक अधिक उपयुक्त प्रणाली फह-/- माउस है, जिसमें उचित टायरोसिन चयापचय के लिए आवश्यक कार्यात्मक fumarylacetoaceate hydrolase (FAH) का अभाव है और गंभीर जिगर की क्षति विकसित करता है जिससे7मौत हो जाती है। इन चूहों पीने के पानी में दवा nitisinone के साथ उपचार के द्वारा अनिश्चित काल के लिए एक स्वस्थ राज्य में बनाए रखा जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, FAH अभिव्यक्ति hepatocytes के एक सबसेट है, जो nitisinone हटाने8पर जिगर repopulate करने के लिए विस्तार होगा transgene वितरण द्वारा बहाल किया जा सकता है.

हेप्टोसाइट्स repopulating के जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन प्रोफ़ाइल करने के लिए, विशेष रूप से पड़ोसी घायल hepatocytes और अन्य सेल प्रकार से संदूषण के बिना फूमें hepatocytes नकल को अलग करने के लिए एक उपकरण की आवश्यकता है. दुर्भाग्य से, हैपेटोसाइट्स के फ्लोरोसेंट-सहायता प्राप्त सेल छँटाई (FACS) मुश्किल है क्योंकि (1) यकृत भ्रम के बाद खराब वसूली की ओर जाता है, (2) हेपेटोसाइट्स की प्रतिकृति आकार में अत्यधिक चर रहे हैं, अलगाव बनाने एफएसीएस द्वारा एक शुद्ध जनसंख्या का मुश्किल, और (3) जिगर perfusion से आरएनए अलगाव के लिए प्रक्रिया समय 2 ज से अधिक है, इसलिए जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल पर्याप्त कृत्रिम परिवर्तन से गुजरना हो सकता है इससे पहले कि नमूने प्राप्त कर रहे हैं9.

वैकल्पिक रूप से, विशेष रूप से hepatocytes repopulating hepatocytes में विशेष रूप से epitope-tagged ribosomes की अभिव्यक्ति सक्रिय रूप से अंग फसल के बाद तुरंत आत्मीयता शुद्धि का उपयोग कर ribosomes द्वारा बाध्य MRNA अनुवाद के तेजी से अलगाव के लिए अनुमति देता है, थोक जिगर के साथ ऊतक lysates. यहाँ, हम अनुवाद करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन-रिबोसम आत्मीयता शुद्धि (TRAP)10 उच्च throughput आरएनए अनुक्रमण (TRAP-सेक) के बाद, विशेष रूप से अलग करने के लिए और प्रोफ़ाइल MRNA Fahमें hepatocytes repopulating में-/ मूषक9| एएचए के साथ ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन-टैगकिए रिबोसोमल प्रोटीन (जीएफपी: RPL10A) का सह-अभिव्यक्ति GFP:RPL10A युक्त पॉलीसोम ्स्स्ड एमआरएनए का अनुवाद करने की आत्मीयता शुद्धि की अनुमति देता है। इस विधि कमजोर repopulating hepatocytes को अलग करने के लिए जिगर perfusion के रूप में किसी भी सेल वियोजन चरणों से बचा जाता है. इसके बजाय, यह तेजी से लक्ष्य कोशिकाओं से विशेष रूप से आरएनए निकालने के लिए पूरे अंग ऊतक और एंटीबॉडी के lysis का इस्तेमाल करता है। अंत में, TRAP-सेक के माध्यम से प्रचुर मात्रा में, उच्च गुणवत्ता वाले एमआरएनए का अलगाव पुनर्जनसंख्या प्रक्रिया के दौरान जीन अभिव्यक्ति के गतिशील परिवर्तन को प्रोफ़ाइल करने के लिए अनुक्रमण विश्लेषण जैसे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों को सक्षम बनाता है।

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Protocol

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सभी तरीकों है कि चूहों के उपयोग को शामिल पेंसिल्वेनिया विश्वविद्यालय में पशु कल्याण के पेन कार्यालय के IACUC द्वारा प्रदान की दिशा निर्देशों के अनुरूप हैं.

1. अभिकर्मक तैयारी

  1. साइक्लोहेक्सीमिड
    1. 0.1 ग्राम/एमएल साइक्लोहेक्सीमाइड का 500 डिग्री सेल्सियस बनाने के लिए, 500 डिग्री सेल्सियस मेथनॉल में साइक्लोहेक्सीमाइड की 50 मिलीग्राम निलंबित करें।
      चेतावनी: Cycloheximide पर्यावरण के लिए बेहद विषाक्त है और जन्मजात विकृति पैदा कर सकता है. साइक्लोहेक्सीमाइड युक्त सभी अपशिष्टों और बफरों को उचित निपटान के लिए एकत्र किया जाना चाहिए।
      नोट: Cycloheximide अप करने के लिए 1 दिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। Cycloheximide अनुवाद रोकता है.
  2. डिथियोथ्रेटोल (डीटी)
    1. 1 एमएल 1 एम डीटीटी बनाने के लिए, आरएनसे-मुक्त पानी में 0.15 ग्राम डीटीटी पाउडर निलंबित करें।
      चेतावनी: डीटीटी त्वचा, आंख, और श्वसन पथ के लिए जलन पैदा कर सकता है।
      नोट: डीटीटी एक डिटर्जेंट है। डीटीटी को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। यह 50 डिग्री सेल्सियस के एकल उपयोग aliquots में 1 एम DTT स्टोर करने के लिए सिफारिश की है।
  3. डिऑक्सीकोलेट (डॉक्टर)
    1. 10% डॉक्टर बनाने के लिए, एक 50 एमएल शंकु ट्यूब में 1 ग्राम डीओसी को निलंबित करें और 10 एमएल तक आरNase-मुक्त पानी जोड़ें। पाउडर भंग होने तक जोर से हिलाएं।
      नोट: 10% डॉक्टर समाधान थोड़ा पीला है और 1 साल तक के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर संग्रहीत किया जा सकता है। डीओसी का प्रयोग नाभिकीय lysis के लिए किया जाता है।
  4. जीएफपी एंटीबॉडी
    1. Alicot GFP एंटीबॉडी जब पहली बार के लिए उपयोग कर रहे हैं. स्नैप -80 डिग्री सेल्सियस पर एलिकोट्स और स्टोर फ्रीज।
      नोट: यह एक उपयोग alicots में GFP एंटीबॉडी के 50 डिग्री ग्राम स्टोर करने के लिए सिफारिश की है.
  5. बी बायोटिनीलेटायड प्रोटीन एल
    1. अंतिम सांद्रता 1 $g/$L बनाने के लिए 1x फॉस्फेट-बफर ेड लवण (पीबीएस) में बायोटिनीलेट प्रोटीन एल को पुन: स्पेंड करें।
      नोट: पुनर्निलंबित समाधान को 6 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

2. बफर तैयारी

  1. बोवाइन सीरम एल्बुमिन (बीएसए) बफर
    1. 3% बीएसए बफर के 50 एमएल बनाने के लिए, 1.5 ग्राम आईजीजी- और प्रोटीज़-मुक्त बीएसए पाउडर को 40 एमएल पीबीएस में जोड़ें जिसके बाद भंवर। बीएसए भंग होने के बाद, पीबीएस को 50 एमएल के अंतिम खंड में जोड़ें।
      नोट: बीएसए बफर को छह महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है।
  2. विच्छेदन बफ़र
    1. विच्छेदन बफर स्टॉक के 50 एमएल बनाने के लिए, 10x हांक के संतुलित नमक समाधान (HBSS) के 5 एमएल गठबंधन, 1 M 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES), 1 एम ग्लूकोज के 1,750 $L, और 1 MHCO3के 200 $L . 50 एमएल के अंतिम वॉल्यूम में RNase-मुक्त पानी जोड़ें।
      नोट: विच्छेदन बफर स्टॉक को छह महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    2. उपयोग करने से तुरंत पहले, 0ण्1 ग्राम/एमएल साइक्लोहेक्सीमाइड के 100 ग्राम/एमएल जोड़ें और बर्फ पर रखें।
  3. उच्च नमक बफर
    1. उच्च नमक बफर स्टॉक के 50 एमएल बनाने के लिए, 1 एम एचईपीएस का 1 एमएल, 2 एम केसीएल का 8.75 एमएल, 1 एम एमजीसीएल2का 500 एमएल, और 100% नोनिलफेनिल पॉलीथीन ग्लैथीन ग्लिथीन(सामग्री की तालिका)को आरनेसे-मुक्त जल में जोड़ें।
      नोट: उच्च नमक बफर स्टॉक को छह महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    2. उपयोग करने से तुरंत पहले, 1 एम डीटीटी का 0.5 डिग्री एल/एमएल और 0.1 ग्राम/एमएल साइक्लोहेक्सीमाइड का 1 डिग्री एल/एमएल जोड़ें। बर्फ पर ताजा उच्च नमक बफर रखें.
  4. कम नमक बफर
    1. कम नमक बफर स्टॉक के 50 एमएल बनाने के लिए, 1 एम एचईपीएस के 1 एमएल, 2 एम केसीएल के 3.75 एमएल, 1 एम एमजीसीएल2के 500 डिग्री सेल्सियस और 100% nonylphenyl पॉलीएथिलीन ग्लाइकोल को 44.25 मिलीलीटर आरनेसे-मुक्त पानी के लिए जोड़ें।
      नोट: कम नमक बफर स्टॉक को छह महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    2. उपयोग करने से पहले 1 एम डीटीटी का 0.5 डिग्री एल/एमएल और 0ण्1 ग्राम/एमएल साइक्लोहेक्सीमाइड का 1 डिग्री एल/एमएल जोड़ें। बर्फ पर ताजा कम नमक बफर रखें.
  5. ऊतक lysis बफर
    1. 50 एमएल ऊतक lysis बफर स्टॉक बनाने के लिए, 1 M HEPES के 1 एमएल, 2 M KCl के 3.75 एमएल, और 1 M MgCl2के 500 डिग्री सेल्सियस गठबंधन. 50 एमएल के फाइनल में RNase-मुक्त पानी जोड़ें।
      नोट: विच्छेदन बफर स्टॉक को छह महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    2. EDTA मुक्त प्रोटीज़ अवरोधक के 1 गोली/10 एमएल जोड़ें, 0.1 g/mL cycloheximide के 1 $L/एमएल, 10 $L/एमएल आरएनसे अवरोधकों के प्रत्येक तुरंत उपयोग करने से पहले। ताजा ऊतक lysis बर्फ पर बफर रखें.

3. चुंबकीय मोती के लिए एंटीबॉडी का संयोजन

  1. एंटीबॉडी
    1. सभी नमूनों के लिए आवश्यक GFP एंटीबॉडी की राशि की गणना और एक अतिरिक्त नमूना के लिए तैयार करते हैं।
      नोट: प्रत्येक नमूने के लिए, प्रत्येक GFP एंटीबॉडी के 50 डिग्री ग्राम की आवश्यकता है.
    2. बर्फ और स्पिन पर GFP एंटीबॉडी अधिकतम गति पर (gt; 13,000 x g) 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए और एक नया microcentrifuge ट्यूब के लिए supernatants हस्तांतरण.
      नोट: एंटीबॉडी तैयारी कदम मनका तैयारी से पहले किया जा सकता है और thawed एंटीबॉडी बर्फ पर रखा जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, इस भाग चुंबकीय मनका और biotinylated प्रोटीन एल के ऊष्मायन के दौरान किया जा सकता है.
  2. चुंबकीय मोतियों को पुन: निलंबित करें
    1. कोमल पाइपिंग द्वारा चुंबकीय मोतियों (सामग्री की तालिका)को पुन: निलंबित करें।
    2. प्रत्येक नमूने के लिए, चुंबकीय मनका के 150 डिग्री एल का उपयोग करें। सभी नमूनों के लिए आवश्यक चुंबकीय मनका की मात्रा की गणना और एक अतिरिक्त तैयार करते हैं। पुन: निलंबित चुंबकीय मोती को 1.5 एमएल या 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। यदि किसी प्रयोग के लिए 1 लाख से अधिक की आवश्यकता हो, तो कुल राशि को बराबर वॉल्यूम ्सक्लमें विभाजित करें.
    3. के लिए एक चुंबकीय स्टैंड पर मोती ले लीजिए gt; 1 मिनट और supernatant हटा दें. चुंबकीय स्टैंड से माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब निकालें और मोती धोने के लिए ऊपर और नीचे पाइपिंग के बाद पीबीएस के 1 एमएल जोड़ें। के लिए एक चुंबकीय स्टैंड पर मोती ले लीजिए gt;1 मिनट और PBS हटा दें.
  3. प्रोटीन एल लेपित मोती की तैयारी
    1. प्रत्येक नमूने के लिए, biotinylated प्रोटीन एल के 60 डिग्री एल का उपयोग करें. यदि प्रोटीन L को पहले पुनः निलंबित किया जाता है और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है, तो बर्फ पर प्रोटीन एल था। यदि प्रोटीन एल का उपयोग करने से पहले resuspended है, सभी नमूनों के लिए आवश्यक राशि ले लो और एक अतिरिक्त तैयार.
    2. पुनर्निलंबित और धोया चुंबकीय मोती करने के लिए biotinylated प्रोटीन एल की गणना मात्रा जोड़ें. अंतिम मात्रा 1 एमएल बनाने के लिए 1x पीबीएस जोड़ें यदि एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब का उपयोग कर, या 1.5 एमएल अगर एक 2 एमएल microcentrifuge ट्यूब का उपयोग कर. एक ट्यूब रोटेटर पर आरटी में 35 मिनट के लिए biotinylated प्रोटीन एल के साथ इनक्यूबेट चुंबकीय मोती।
      नोट: Antibodies इस कदम पर तैयार किया जा सकता है, जबकि मोती biotinylated प्रोटीन एल के साथ incubating रहे हैं.
    3. के लिए एक चुंबकीय स्टैंड पर प्रोटीन एल लेपित मोती ले लीजिए और supernatant हटा दें. चुंबकीय स्टैंड से microcentrifuge ट्यूब निकालें और 3% बीएसए बफर के 1 एमएल जोड़ने के लिए कम से कम 5 बार प्रोटीन एल लेपित मोती धोने के लिए कोमल pipeting द्वारा पीछा किया.
    4. के लिए एक चुंबकीय स्टैंड पर लेपित मोती ले लीजिए और supernatant हटा दें. एक और 4 बार (5 बार की कुल) के लिए 3% बीएसए के साथ धोने के कदम दोहराएँ.
  4. एंटीबॉडी बाइंडिंग
    1. प्रोटीन एल लेपित मोती में GFP एंटीबॉडी की गणना राशि जोड़ें और एक ट्यूब रोटेटर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए इनक्यूबेट।
      नोट: एंटीबॉडी ऊष्मायन के बाद, आत्मीयता मैट्रिक्स भंवर नहीं करने के लिए विशेष ध्यान रखना.
    2. ऊष्मायन के दौरान, सभी नमूनों के लिए अपेक्षित कुल मात्रा की गणना करके कम नमक बफर तैयार करें और उपयोग करने से पहले कम नमक बफर स्टॉक में 1 एम डीटीटी का 0.5 डिग्री एल/एमएल और 0.1 ग्राम/एमएल/एमएल 0.1 डिग्री सेल्सियस/एमएल जोड़ें।
      नोट: GFP-संयुग्मी मोती के प्रत्येक ट्यूब को धोने के लिए कम नमक बफर के 3 एमएल और GFP-संयुग्मित मोती के पुन: निलंबन के लिए 200 डिग्री सेल्सियस/ ताजा कम नमक बफर घंटे के एक जोड़े के लिए बर्फ पर रखा जा सकता है.
    3. के लिए एक चुंबकीय स्टैंड पर आत्मीयता मैट्रिक्स ले लीजिए और supernatant हटा दें. कम नमक बफर के 1 एमएल जोड़ें और धीरे pipette ऊपर और नीचे आत्मीयता मैट्रिक्स धोने के लिए. के लिए एक चुंबकीय स्टैंड पर आत्मीयता मैट्रिक्स ले लीजिए gt; 1 मिनट और कम नमक बफर हटा दें. एक और 2 बार (कुल 3 बार) के लिए कम नमक बफर के साथ धोने के कदम दोहराएँ.
    4. कम नमक बफर में मोती को पुन: निलंबित करें ताकि प्रत्येक नमूने में आत्मीयता मैट्रिक्स के 200 डिग्री एल है।
      नोट: आत्मीयता मैट्रिक्स में संग्रहीत किया जा सकता है 0.02% NaN3 पर 4 डिग्री सेल्सियस के लिए अप करने के लिए 2 सप्ताह. आत्मीयता मैट्रिक्स जल्दी से कम नमक बफर में धोया जाना चाहिए 3 बार और कम से कम 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक ट्यूब रोटेटर पर धीरे से resuspended अगर आत्मीयता मैट्रिक्स 1 सप्ताह या रात भर के भीतर तैयार किया जाता है अगर आत्मीयता मैट्रिक्स से अधिक के लिए संग्रहीत किया जाता है 1 सप्ताह. इस चरण के बाद प्रोटोकॉल रोका जा सकता है।
      चेतावनी: सोडियम अज़ीड पर्यावरण के लिए बेहद विषाक्त है। एसिड के साथ संपर्क विषाक्त गैस का उत्पादन. सभी अपशिष्टों को उचित निपटान के लिए एकत्र किया जाना चाहिए।

4. लिवर ऊतक Lysis

  1. बफर तैयारी और उपकरण सेटअप
    1. आवश्यक microcentrifuge ट्यूबों की संख्या की गणना, लेबल और बर्फ पर ठंडा.
      नोट: आमतौर पर, सात 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब प्रत्येक नमूने के लिए आवश्यक हैं: 1 शेष विच्छेदन जिगर के लिए, 4 homogenized जिगर lysate के 4 एमएल के लिए, और 2 supernatants स्थानांतरित करने के लिए.
    2. सभी नमूनों के लिए अपेक्षित कुल आयतन की गणना करके नए विच्छेदन बफर तैयार कीजिये और 0ण्1 हधले साइक्लोहेक्सीमाइड की 1 डिग्री सेल्सियस/एमएल डालें। प्रयोग के दौरान ठंडा रखने के लिए बर्फ पर ताजा विच्छेदन बफर रखें।
      नोट: प्रत्येक नमूने के लिए, 10 एमएल विच्छेदन बफ़र की आवश्यकता है।
    3. सभी नमूनों के लिए आवश्यक कुल मात्रा की गणना करके ताजा lysis बफर तैयार करें और EDTA-मुक्त प्रोटीज़ अवरोधक के 1 गोली/10 एमएल, 0.1 ग्राम/एमएल साइक्लोहेक्मिड की 1 $L/एमएल प्रत्येक जोड़ें। प्रयोग के दौरान बर्फ पर lysis बफर रखें.
      नोट: प्रत्येक नमूने के लिए, lysis बफर के 4 एमएल की आवश्यकता है।
    4. ऊतक चक्की(सामग्री की तालिका) सेट करें ताकि polytetrafluoroethylene (PTFE) ग्लास ट्यूब जिगर के टुकड़े के एकरूपता के दौरान बर्फ पर रखा जा सकता है. पीटीएफई-ग्लास ट्यूबों में 4 एमएल ठंडा lysis बफर रखो।
  2. जिगर एकरूपता को फिर से पॉपोपुलेशन
    1. यूथेनाइज एक 8-12-सप्ताह पुराने फह-/- माउस को ट्रैप वेक्टर के साथ इंजेक्ट किया गया और अनुमोदित पशु प्रयोगात्मक दिशानिर्देशों के अनुसार संज्ञाहरण और गर्भाशय ग्रीवा की अव्यवस्था के साथ 1-4 सप्ताह के लिए फिर से आबादी।
    2. एक विच्छेदन बोर्ड पर माउस प्लेस और 70% इथेनॉल के साथ पेट स्प्रे. संदंश का उपयोग करके पेट में त्वचा और पेरिटोनम को कम करें और एक अनुप्रस्थ चीरा बनाने के लिए कैंची का उपयोग करें। कैंची के साथ कटौती करने के लिए एक व्यापक यू के आकार का peritoneal फ्लैप बनाने के लिए जारी रखें, देखभाल के साथ विसरा में कटौती नहीं करने के लिए. जिगर का पर्दाफाश करने के लिए स्टर्नम पर peritoneal फ्लैप फ्लिप.
    3. ध्यान से ठीक कैंची और संदंश का उपयोग कर जिगर को हटा दें और जल्दी से कुल्ला करने के लिए ठंड विच्छेदन बफर में ऊतक जगह है। जमे हुए ऊतकों homogenize करने के लिए, जल्दी से ऊतक thwing बिना ठंड lysis बफर के साथ PTFE ग्लास ट्यूबों में जिगर के ऊतकों की वांछित राशि ले जाएँ.
      नोट: विच्छेदन ऊतक फ्लैश-फ्रोज़न किया जा सकता है और विच्छेदन बफर के साथ धोया जाता है के बाद -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है। इस चरण के बाद प्रोटोकॉल रोका जा सकता है।
    4. एक पेट्री डिश पर जिगर वजन और अलग 200 -500 जिगर के टुकड़े की मिलीग्राम और PTFE ग्लास ट्यूबों में ले जाएँ. शेष जिगर के ऊतकों को एक पूर्व ठंडा microcentrifuge ट्यूब और फ्लैश फ्रीज में रखें।
    5. कम से कम 5 स्ट्रोक के लिए जिगर संरचना से hepatocytes अलग करने के लिए 300 आरपीएम से शुरू एक मोटर चालित homogenizer में नमूनों Homogenize. कांच की ट्यूब को हर बार कम करें, लेकिन ध्यान रखें कि कीट को घोल से ऊपर न उठने दें ताकि वातन को रोका जा सके जिससे प्रोटीन विकृतीकरण हो सकता है।
    6. कम से कम 12 पूर्ण स्ट्रोक के लिए पूरी तरह से जिगर के ऊतकों homogenize करने के लिए 900 आरपीएम के लिए गति उठाएँ।
    7. लेबल और पूर्व ठंडा ट्यूबों में lysate स्थानांतरण, 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूबों प्रति lysate के 1 लाख से अधिक के साथ. यदि 4 एमएल lysis बफर का उपयोग किया जाता है, 1 ट्यूब रखने के लिए और फ्लैश शेष 3 ट्यूबफ्रीज.
      नोट: lysates अप करने के लिए बर्फ पर रखा जा सकता है 1 एच जबकि अगले जानवर विच्छेदन और ताजा lysates की तैयारी. homogenized जिगर lysis कदम के बाद जमे हुए फ्लैश किया जा सकता है और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत. जमे हुए lysates उपयोग किया जाता है, तो अलग आरएनए में 50% कमी हो सकती है। इस चरण के बाद प्रोटोकॉल रोका जा सकता है।
  3. न्यूक्लियर lysis
    1. 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 2,000 x g पर जिगर lysate सेंट्रीफ्यूज और बर्फ पर एक नया, prechilled microcentrifuge ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण।
    2. अंतिम एकाग्रता 1% nonylphenyl polyethylene ग्लाइकोल बनाने के लिए 10% nonylphenyl polyethylene ग्लाइकोल के supernatant मात्रा में से 1/9 जोड़ें और धीरे microcentrifuge ट्यूबों उलट द्वारा मिश्रण.
    3. जल्दी से microcentrifuge ट्यूबों नीचे स्पिन और 10% डॉक्टर के नमूने की मात्रा के 1/9 जोड़ने के लिए अंतिम एकाग्रता 1% डॉक्टर बनाने के लिए और धीरे microcentrifuge ट्यूबों inverting द्वारा मिश्रण. जल्दी से माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को स्पिन करें और 5 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
    4. परमाणु lysate पर 20,000 x g पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर centrifuge और बर्फ पर एक नया, prechilled microcentrifuge ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण.
      नोट: माइटोकोंड्रिया-depleted supernatant कुछ घंटों के लिए बर्फ पर रखा जा सकता है, जबकि शेष नमूने एकत्र किया जा रहा है.

5. इम्यूनोसेवेज

  1. प्रत्येक ट्यूब के लिए, आत्मीयता मैट्रिक्स के साथ ऊष्मायन के बाद लक्ष्य संवर्धन की तुलना करने के लिए एक पूर्व प्रतिरक्षा अभिवर्क्षण नियंत्रण के रूप में supernatant की कुल मात्रा का 1% बाहर ले. रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर एक ट्यूब रोटेटर पर पूर्व-प्रतिरक्षा-वर्षा नियंत्रण रखें, उसी तरह जैसे इम्यूनोप्रिसिपेट किए गए नमूनों को संसाधित किया जाता है।
  2. प्रत्येक नमूने के लिए आत्मीयता मैट्रिक्स के 200 डिग्री सेल्सियस जोड़ें. प्रत्येक नमूने के लिए आत्मीयता मैट्रिक्स जोड़ने से पहले कोमल pipeting द्वारा मोती को फिर से निलंबित करने के लिए अतिरिक्त ध्यान रखना. एक ट्यूब रोटेटर पर कोमल मिश्रण के साथ रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर आत्मीयता मैट्रिक्स के साथ lysates इनक्यूबेट करें।
    नोट: इस चरण के बाद प्रोटोकॉल को एक दिन तक रोका जा सकता है.

6. आरएनए अलगाव

  1. बफर तैयारी और उपकरण सेटअप
    1. कम से कम 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर चुंबकीय रैक रखें पूर्व ठंडा करने के लिए और प्रयोग के दौरान बर्फ पर रैक रखने के लिए.
    2. आवश्यक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों की संख्या की गणना करें और बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व-चमक।
      नोट: आमतौर पर, प्रत्येक नमूने अंतिम शुद्ध आरएनए के लिए 1 microcentrifuge ट्यूब की आवश्यकता है.
    3. जल्दी से कदम 5.2 से ट्यूबों नीचे स्पिन और कम से कम 1 मिनट के लिए चुंबकीय रैक पर रखकर मोती इकट्ठा. अतिरिक्त microcentrifuge ट्यूबों में supernatant इकट्ठा या त्यागें.
      नोट: एकत्र supernatant कि असीमित अंश शामिल फ़्लैश-फ्रोज़न किया जा सकता है और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत शुद्धि के बाद प्रतिलिपि संवर्धन के लिए बाध्य अंश के साथ तुलना करने के लिए. इस चरण के बाद प्रोटोकॉल रोका जा सकता है।
    4. उच्च लवण बफर स्टॉक में 1 एम डीटीटी के 0.5 डिग्री एल/एमएल और 0.1 ग्राम/एमएल साइक्लोहेक्सीमाइड के 1 डिग्री एल/एमएल को जोड़कर उच्च लवण बफर तैयार करें।
      नोट: प्रत्येक नमूने के लिए, उच्च नमक बफर के 5 एमएल की आवश्यकता है।
  2. आरएनए विलगन
    1. बुलबुले शुरू करने के बिना कम से कम 5 बार के लिए कोमल pipeting के बाद प्रत्येक ट्यूब के लिए ताजा उच्च नमक बफर के 1 एमएल जोड़ें।
      नोट: अपर्याप्त धोने असीम प्रतिलिपि की पृष्ठभूमि परिचय सकता है, जबकि बुलबुले की शुरूआत आरएनए गिरावट में तेजी लाने सकता है.
    2. के लिए एक चुंबकीय स्टैंड पर मोती ले लीजिए gt; 1 मिनट और supernatant हटा दें. एक और 4 बार (5 बार की कुल) के लिए उच्च नमक बफर के साथ धोने के कदम दोहराएँ.
    3. शेष उच्च नमक बफर निकालें और गर्म करने के लिए 5 मिनट के लिए आरटी पर चुंबकीय स्टैंड और जगह से microcentrifuge ट्यूबों को हटा दें।
    4. 100 डिग्री सेल्सियस में मोती को पुन: निलंबित करें (RNA आइसोलेशन किट में प्रदान की गई) के साथ $-mercaptoethanol.
      नोट: किसी भी आरएनए अलगाव और शुद्धि किट है कि denaturant guanidine thiocyanate शामिल एक lysis बफर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है आत्मीयता मैट्रिक्स से बाध्य आरएनए जारी करने के लिए. आरएनए निष्कर्षण आरटी पर संसाधित किया जाना चाहिए क्योंकि ग्वानिडीन थायोसाइनेट कम तापमान पर क्रिस्टलीकृत हो सकता है।
    5. उच्चतम गति पर कम से कम 5 एस के लिए मोती और बफर भंवर, जल्दी से microcentrifuge ट्यूब के पक्ष में बफर इकट्ठा करने के लिए नीचे स्पिन और 10 मिनट के लिए आरटी पर बफर के साथ मोती इनक्यूबेट करने के लिए मनका बाध्य आरएनए lysis बफर में जारी करने के लिए.
    6. के लिए एक चुंबकीय स्टैंड पर मोती लीजिए और सुपरनेटेंट इकट्ठा करने के लिए तुरंत आरएनए सफाई के लिए आगे बढ़ना के रूप में किट में निर्दिष्ट आरएनए शुद्धि प्रोटोकॉल के अनुसार (सामग्री की तालिका) .
      नोट: lysis बफर में eluted आरएनए युक्त supernatant भी अप करने के लिए 1 महीने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है सफाई से पहले RT करने के लिए thawing पर वार्मिंग से.
    7. पृथक आरएनए की अधिकतम गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए, DNase पाचन और सभी आरएनए elution चरणों सहित सभी वैकल्पिक कदम प्रदर्शन करते हैं। अधिकतम आरएनए वसूली के लिए आरएनए आइसोलेशन किट या आरएनसे-मुक्त पानी द्वारा प्रदान किए गए एल्यूशन बफर को 60 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
      नोट: पृथक आरएनए को 1 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस या कई वर्षों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। इस चरण के बाद प्रोटोकॉल रोका जा सकता है।

7. वैकल्पिक आरएनए गुणवत्ता विश्लेषण (अनुशंसित)

  1. एक bioanalyzer का उपयोग कर आरएनए गुणवत्ता का आकलन11 और एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ मात्रा12 निर्धारित करने के लिए अगर इम्यूनोवेरिसेप्शन प्रक्रिया दोहरा पर्याप्त और उच्च गुणवत्ता आरएनए प्राप्त करने के लिए आवश्यक है।
    नोट: उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण के लिए इष्टतम आरएनए गुणवत्ता पुस्तकालय तैयारी किट और अनुक्रमण प्लेटफार्मों द्वारा निर्दिष्ट प्रोटोकॉल का पालन करना चाहिए।

8. डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोग

नोट: TRAP प्रोटोकॉल द्वारा अलग कुल आरएनए मानक बहाव अनुप्रयोगों की एक संख्या में इस्तेमाल किया जा सकता है, आरएनए-सेक सहित (TRAP-सेक). मानक रिवर्स प्रतिलेखन और मात्रात्मक पीसीआर प्रोटोकॉल भी TRAP निम्नलिखित इस्तेमाल किया जा सकता है.

  1. TRAP-सेक के लिए, मानक विधियों13के अनुसार आरएनए-सेक पुस्तकालय की तैयारी करें।
  2. आरएनए-सेक के लिए, ओलिगो डी (टी) के साथ वाणिज्यिक आरएनए-सेक किट का उपयोग करके सीडीएनए अनुक्रमण पुस्तकालयों को तैयार करें- पॉलीडेनीलेट्स्ड पॉली (ए) ट्रांसक्रिप्ट्स के आधार पर संवर्धन। वैकल्पिक रूप से, यदि कुल आरएनए गुणवत्ता पाली (ए) संवर्धन के लिए सिफारिश की तुलना में कम है, RNA कमी मॉड्यूल का उपयोग करें. हालांकि, अनुक्रमण के बाद अधिक rRNA संरेखण देखने की उम्मीद है.

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Representative Results

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फह-/- माउस, Gfp:Rpl10a संलयन और Fah transgenes के repopulating hepatocytes में जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल करने के लिए सह एक ट्रांसपोसन युक्त प्लाज्मिड8 (ट्रैप वेक्टर) के भीतर जिगर के लिए वितरित कर रहे हैं द्रवगतिक अंत:क्षेपण (चित्र 1)। नितिसिटोन को हटाने से एक विषाक्त यकृत की चोट पैदा होती है जो हेपाटोसाइट्स के लिए चयन दबाव पैदा करती है जो घायल पैरेन्काइमा9को फिर से लोकप्रिय बनाने के लिए एफएएच को व्यक्त करती है . इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला एफएएच और GFP के सह-अभिव्यक्ति की पुष्टि करता है: RPL10A संलयन प्रोटीन जिगर repopulation के दो सप्ताह के बाद hepatocytes repopulating में (चित्र 1बी)।

निम्नलिखित प्रतिनिधि प्रयोग में, TRAP-सेक शांत और repopulating माउस hepatocytes का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था. सबसे पहले, शांत hepatocytes से GFP टैग ribosomes प्राप्त करने के लिए, ट्रांसजेनिक रोजाLSL-GFP-L10A चूहों AAV8-TBG-Cre के साथ इंजेक्शन थे 7 दिन पहले GF induceP:RPL10A अभिव्यक्ति सभी hepatocytesमें 14. हम भी एक जिगर एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक जंगली प्रकार माउस से एकत्र नमूना संसाधित MRNA अनुवाद के अलगाव सुनिश्चित करने के लिए विशिष्ट था, जिसका अर्थ आरएनए केवल GFP व्यक्त चूहों से निकाला जा सकता है: RPL10A. पृथक आरएनए की एकाग्रता संलयन प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं की संख्या के साथ सहसंबद्ध, शांत नमूना के साथ उच्चतम उपज का उत्पादन के बाद से सभी hepatocytes GFP व्यक्त: RPL10A AAV8-TBG-Cre इंजेक्शन के बाद (चित्र 2). इसके विपरीत, मुश्किल से किसी भी आरएनए जंगली प्रकार नियंत्रण है कि GFP नहीं था में पता लगाने योग्य था: RPL10A transgene, TRAP प्रक्रिया का संकेत अत्यधिक विशिष्ट है और एक कम पृष्ठभूमि है. जब TRAP GFP के साथ repopulation के दौर से गुजर जिगर के ऊतकों पर इस्तेमाल किया गया था: RPL10A-transduced hepatocytes, प्रचुर मात्रा में, उच्च गुणवत्ता आरएनए प्राप्त किया गया था (चित्र 2बी). इसके विपरीत, कोई आरएनए ट्रेस नकारात्मक नियंत्रण नमूने के लिए bioanalyzer के माध्यम से पाया गया था.

डाउनस्ट्रीम जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण रिवर्स प्रतिलेखन और मात्रात्मक पीसीआर या आरएनए-सेक के माध्यम से TRAP-अलग आरएनए पर किया जा सकता है। Gsta1 glutathione S-transferase को एन्कोड करता है जो ग्लूटाथिओन के चयापचय के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, ऑक्सीडेटिव तनाव क्षति15के खिलाफ जिगर की रक्षा करने के लिए मुख्य detoxifying पेप्टाइड । Gsta1 अभिव्यक्ति शांत hepatocytes की तुलना में hepatocytes repopulating में 10 गुना से अधिक द्वारा प्रेरित है, जबकि कोई सीमा चक्र (Ct) मान इनपुट आरएनए की कमी के कारण जंगली प्रकार माउस से TRAP-अलग आरएनए के साथ पाया गया था (चित्र 3 ध्यानदें कि आरएनए की गुणवत्ता जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण को बहुत प्रभावित कर सकती है। आरएनए-सेक प्रयोगों के मामले में, आर.ए.एन.ए. गुणवत्ता का मूल्यांकन पुस्तकालय तैयारी किट और अनुक्रमण मंच की सिफारिशों के अनुसार किया जाना चाहिए (चित्र 3)। एक bioanalyzer अक्सर आरएनए अखंडता संख्या (RIN) निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है, एक उच्च RIN जीनोम करने के लिए mrNA संरेखण की एक उच्च दर के साथ संबंधित के साथ (चित्र 3बी, बाएँ), जबकि एक कम RIN ribosomal की एक उच्च दर के लिए अग्रणी पढ़ता है, यह दर्शाता है MRNA अवक्रमण (चित्र 3, दायाँ)। चित्र 3 C,D दर्शाता है कि TRAP-सेक शांत में अंतर जीन अभिव्यक्ति की पहचान कर सकते हैं और hepatocytes repopulating. उदाहरण के लिए, Alb अभिव्यक्ति बाधित है और Afp अभिव्यक्ति जिगर repopulation के दौरान upregulated है, दर्शाती है कि प्रतिकृति hepatocytes एक कम विभेदित राज्य ग्रहण करने के दौरान जिगर चयापचय कार्यों को बाधित पुन: जनसंख्या9,16.

Figure 1
चित्र 1: Fahके साथ TRAP का कार्यान्वयन- / - repopulating hepatocytes के जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन प्रोफ़ाइल करने के लिए. (A) GFP व्यक्त करने की योजना:RPL10A संलयन प्रोटीन के साथ FAH स्लीपिंग ब्यूटी ट्रांसपोसन प्रणाली में Fah के बाद फहमें इंजेक्शन -/ ग्रीन हेक्सागोन्स एफएएच और GFP:RPL10A की स्थिर अभिव्यक्ति के साथ हेपेटोसाइट्स को फिर से पॉपोपॉपेशन करने का संकेत देते हैं, जबकि काले हेक्सागोन घायल, मर hepatocytes का प्रतिनिधित्व करते हैं। (बी) प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला GFP-टैग्ड राइबोसोमल प्रोटीन L10A (हरा) और FAH (लाल) repopulating hepatocytes में की सहअभिव्यक्ति को दर्शाता है. स्केल बार ] 50 डिग्री मी. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: TRAP उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए के सेल प्रकार-विशिष्ट अलगाव की अनुमति देता है। (क)आरएनए की उपज जीएफपी:RPL10A व्यक्त करने वाले हेपटोसाइट्स की संख्या के साथ सकारात्मक सहसंबद्ध है। एक जंगली प्रकार माउस से आरएनए की कम उपज GFP की अभिव्यक्ति के बिना स्रोतों से TRAP की विशिष्टता को दर्शाता है: RPL10A. (बी) जीएफपी:RPL10A और जंगली प्रकार के यकृतों से व्यक्त करने वाले यकृतों को पुन: पॉपूलेट करने से पृथक कुल आरएनए के बायोएनालेज़र निशान, जाल की विशिष्टता को प्रदर्शित करते हैं। कुल आरएनए GFP से रहित जंगली प्रकार जिगर ऊतक से अलग: RPL10A transgene से पता चलता है कि कम से कम आरएनए एकत्र किया गया है, जबकि transgene-expressing ऊतक पर्याप्त उच्च गुणवत्ता आरएनए प्रदान करता है. ध्यान दें कि राइबोसोमल आरएनए शिखर सफल TRAP10के बाद मौजूद हैं । FU, फ्लोरोसेंट इकाई. RIN, आरएनए अखंडता संख्या. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: जाल-पृथक आरएनए का उपयोग डाउनस्ट्रीम जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। (ए)प्रतिनिधि रिवर्स प्रतिलेखन और शांत और repopulating hepatocytes में Gsta1 के मात्रात्मक पीसीआर परिणाम। आरएनए जंगली प्रकार के जानवरों से अलग के साथ कोई Ct मान का पता चला था। (ख)उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण के बाद पृथक आरएनए का संरेखण विश्लेषण, अलगाव के बाद आरएनए अखंडता निर्धारित करने के महत्व का प्रदर्शन करता है। MRNA के एक उच्च प्रतिशत में उच्च गुणवत्ता आरएनए परिणाम पढ़ता है (हरा), जबकि कम गुणवत्ता आरएनए राइबोसोम पढ़ता है (लाल) का एक बहुत अधिक प्रतिशत की ओर जाता है, के रूप में सबसे mRNA अपमानित है. RIN, आरएनए अखंडता संख्या. (सी,डी) एकीकृत जीनोमिक्स व्यूअर (आईजीवी) आरएनए-सेक की पटरियों को एमआरएए एफ़िनिटी-शांत से शुद्ध किया जाता है और(सी) एएलबी और (डी) एएफपी लोसी पर हेपाटोसाइट्स को पुन: पॉप्यूलेट करना। ध्यान दें कि 3' पढ़ें पूर्वाग्रह एक पाली (ए) चयन पाइप लाइन के विशिष्ट है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

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TRAP-सेक एपिटो-टैग्ड राइबोसोम के माध्यम से MRNA अनुवाद के सेल प्रकार-विशिष्ट अलगाव के लिए एक तकनीक है और FACS दृष्टिकोण के लिए एक विकल्प प्रस्तुत करता है, क्योंकि यह FACS9के समय आवश्यकताओं के रूप में सीमाओं को दरकिनार करता है। इसके बजाय, TRAP सीधे थोक ऊतकों से आरएनए के तेजी से और कुशल अलगाव की अनुमति देता है, जीन अभिव्यक्ति में किसी भी परिवर्तन से बचने में मदद. TRAP-सेक विशेष रूप से repopulating Fah में उपयोग के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है - / माउस जिगर, के रूप में nitisinone को हटाने के बाद hepatocyte विस्तार सेल स्वायत्त है और एकीकृत के साथ hepatocytes के सबसेट की जीन अभिव्यक्ति रूपरेखा सक्षम बनाता है ट्रांसजीन। TRAP वेक्टर भी जीन-सक्रिय या -silencing अणुओं के साथ coexpressed किया जा सकता है17, cDNA सहित, लघु hairpin आरएनए, और गाइड आरएनए, सक्रियण या एक विशिष्ट जीन के निषेध के वैश्विक जीन अभिव्यक्ति पर प्रभाव का अध्ययन करने के लिए. वैकल्पिक रूप से, रोजाLSL-GFP-L10A ट्रांसजेनिक माउस Cre recombinase गतिविधि के साथ किसी भी सेल में जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल करने की क्षमता प्रदान करता है. GFP के बाद से: RPL10A विशेष रूप से किसी भी कोशिकाओं है कि क्रे व्यक्त में व्यक्त किया जा सकता है, जिगर की चोट और repopulation के दौरान जिगर में अन्य सेल प्रकार की भूमिका का अध्ययन किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, TRAP ट्रांसजेनिक माउस के साथ CK19-Cre माउस को पार करने के लिए GFP व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता: RPL10A cholangiocytes में TRAP-सेक के बाद पुनर्जनसंख्या प्रक्रिया के दौरान पित्त उपकला में जीन अभिव्यक्ति के परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए.

जीन अभिव्यक्ति की सटीक रूपरेखा सुनिश्चित करने के लिए, ऊतक विच्छेदन से पहले सभी बफ़र्स और आत्मीयता मैट्रिक्स तैयार करना महत्वपूर्ण है। सभी चरणों ठंड बफ़र्स के साथ बर्फ पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए जब तक अन्यथा polysome स्थिरीकरण सुनिश्चित करने के लिए निर्दिष्ट10 और आरएनए गिरावट को रोकने के. सभी बफ़र्स RNase मुक्त अभिकर्मकों के साथ तैयार किया जाना चाहिए और TRAP-सेक प्रोटोकॉल एक RNase मुक्त वातावरण में किया जाना चाहिए आरएनए गिरावट और इम्यूनोप्रिसिपेटेड आरएनए की कम उपज को रोकने के लिए। आत्मीयता मैट्रिक्स अप करने के लिए तैयार किया जा सकता है 2 सप्ताह एक ट्यूब रोटेटर रात भर पर कोमल resuspension के साथ उपयोग करने से पहले. एंटीबॉडी-कंजुएट, प्रोटीन एल लेपित चुंबकीय मोती के विघटन को रोकने के लिए मैट्रिक्स को तेजी से हिला ने नहीं करने के लिए विशेष ध्यान रखा जाना चाहिए। आत्मीयता मैट्रिक्स तैयार करने के लिए तरीकों में एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन के बाद बायोटिनिनलेट्स प्रोटीन एल के लिए चुंबकीय मोती का संयोजन शामिल है। तथापि, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोटीन ए/जी चुंबकीय मोतियों को प्रतिस्थापित किया जा सकता है; यदि उपयोग किया जाता है, तो प्रारंभिक संयोजन चरण को छोड़ दें और सीधे एंटीबॉडी बाइंडिंग पर जाएँ. इसके अलावा, वैकल्पिक epitope टैग उचित संशोधन के साथ उपरोक्त प्रोटोकॉल के साथ संभवतः संभव हैं.

ऐसे विभिन्न बिंदु हैं जिनमें आरएनए अलगाव और शोधन चरण को रोका जा सकता है (ऊपर प्रोटोकॉल देखें)। हालांकि, एक बार जिगर के नमूने काटा गया है, इम्यूनोप्रिसिएंस के लिए जारी रखने की सिफारिश की है, के रूप में अलग आरएनए की उपज इस कदम10पर ठंड के साथ $ 50% से गिर सकता है. ऊतकजल्दी विच्छेदन बफर कि cycloheximide शामिल करने के लिए MRNA अनुवाद को बाधित करने के साथ कुल्ला किया जाना चाहिए. अपर्याप्त ऊतक lysis भी कम आरएनए उपज के लिए योगदान कर सकते हैं. यह बर्फ पर ऊतकों homogenize करने के लिए महत्वपूर्ण है जब तक कोई ऊतक हिस्सा मोटर homogenizer के साथ दिखाई दे रहे हैं, जबकि कम से कम वातन10सुनिश्चित करने के लिए . इसके अतिरिक्त, उच्च नमक बफर के साथ पर्याप्त धोने आत्मीयता मैट्रिक्स के लिए राइबोसोमल प्रोटीन के nonspecific बंधन को हटाने सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है. एक जंगली प्रकार नकारात्मक नियंत्रण सहित इम्यूनोप्रीसेप्शन की विशिष्टता और धोने के चरणों की दक्षता का आकलन करने में मदद करता है। इसके अतिरिक्त, एक वाणिज्यिक आरएनए शुद्धि किट है कि RNase मुक्त DNase उपचार भी शामिल है का उपयोग कर आरएनए शुद्धता में वृद्धि होगी.

इसके अलावा, GFP की अभिव्यक्ति और बहुतायत को सत्यापित करने और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए पर्याप्त आरएनए प्राप्त करने के लिए आवश्यक ऊतक की मात्रा का आकलन करने के लिए सिफारिश की जाती है। ऊतक वर्गों या lysates इम्यूनो-आधारित पता लगाने के तरीकों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता GFP की अभिव्यक्ति को मान्य करने के लिए: RPL10A. आरएनए अलग की मात्रा के द्वारा भिन्न हो सकते हैं: (1) GFP व्यक्त कोशिकाओं की संख्या: RPL10A, (2) transgene की अभिव्यक्ति स्तर, और (3) आकार और transgene व्यक्त कोशिकाओं के loidy. एक पायलट प्रयोग आधा और ऊतक की सिफारिश की राशि की मात्रा दोगुनी का उपयोग कर TRAP-सेक के लिए इष्टतम इनपुट lysate निर्धारित करने में उपयोगी हो सकता है. हमारे हाथों में, हम GFP व्यक्त hepatocytes के रूप में कम के रूप में 1-2% के साथ आरएनए के 150 एनजी प्राप्त कर सकता है: RPL10A से 200 मिलीग्राम repopulating Fah-/- जिगर, transgene अभिव्यक्ति के साथ $ 2 x 105 बहुगुणित hepacytes का प्रतिनिधित्व9.

TRAP-सेक पद्धति एक सेल के अनुवाद MRNA पूल प्रोफ़ाइल करने के लिए ribosome-बाउंड MRNA को अलग करता है। परिणामी अनुक्रमण इसलिए transcriptome के बजाय 'अनुवाद' करने के लिए अनुरूप पढ़ता है. ध्यान दें कि राइबोसोम पैरों के निशान का अनुवाद एकत्र नहीं किया जाएगा, क्योंकि TRAP क्रॉसलिंक किए गए परिसरों के बजाय देशी पर किया जाता है। यदि पदचिह्न विश्लेषण वांछित हैं, तो उपरोक्त प्रोटोकॉल को प्रासंगिक क्रॉस-लिंकिंग के साथ संशोधित किया जाना चाहिए जिसके बाद इम्यूनोप्रीसिप्शन (CLIP) के तरीके18हैं। TRAP की एक अन्य सीमा GFP व्यक्त कोशिकाओं की एक पर्याप्त संख्या की आवश्यकता है: RPL10A संलयन प्रोटीन. उन प्रयोगों के लिए जिनमें सेल प्रकार का ब्याज छोटा होता है, कई जैविक नमूनों को संयोजित करने के लिए आरएनए-सेक19को सक्षम करने के लिए पर्याप्त आरएनए को अलग करने की आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा, TRAP-सेक GFP की उपस्थिति की आवश्यकता है: RPL10A ब्याज की सेल प्रकार में. यदि कक्षों के लिए कोई विशिष्ट वितरण प्रणाली नहीं है या क्रे एक्सप्रेशन ड्राइव करने के लिए कोई सेल-प्रकार विशिष्ट प्रमोटर उपलब्ध नहीं है, तो यह एक चुनौती हो सकती है।

एकल-सेल आरएनए-सेक (scRNA-सेक) प्रौद्योगिकी के हाल के विकास ने विभिन्न सेल प्रकारों की सिलिको पहचान में प्रत्यक्ष अनुक्रमण की अनुमति दी है, जिससे विशिष्ट सेल प्रकार के हितों के लिए छँटाई के बिना अनुक्रमण को सक्षम किया जा सकता है20 ,21,22. हालांकि, scRNA-सेक अभी भी अंग से कोशिकाओं के विच्छेदन की आवश्यकता है. Fahके मामले में- / - repopulation मॉडल, जिगर भ्रम और hepatocyte अलगाव अत्यंत कठिन और दोनों घायलों की कमजोरी के कारण अक्षम है और hepatocytes नकल. वास्तव में, हम अभी तक फाहसे पर्याप्त हेपाटोसाइट्स को अलग नहीं कर पाए हैं- /- चूहों ने फाह प्लाज्मिड के हाइड्रोडायनामिक इंजेक्शन के बाद पुनर्जनसंख्या के दौर से गुजर रहा है। इसके अतिरिक्त, समय में यह ऊतकों को संसाधित करने के लिए लेता है, जीन अभिव्यक्ति का स्तर बदल सकता है. जिगर perfusion के लिए प्रोटोकॉल गर्म ischemia समय के 30 मिनट तक ले. भविष्य के तरीके प्रसंस्करण समय को कम करने और अलगाव दक्षता बढ़ाने के लिए जिगर perfusion का अनुकूलन करने के लिए Fahके लिए scRNA-सेक एकीकरण की अनुमति दे सकता है- माउस मॉडल प्रणाली और संभवतः अन्य चोट और repopulation मॉडल के लिए. यह भी सभी जिगर सेल प्रकार के अध्ययन में सक्षम होगा.

अंत में, Fahके साथ TRAP-सेक के एकीकरण- माउस विशिष्ट अलगाव और जीन अभिव्यक्ति hepatocytes नकल की रूपरेखा चिकित्सकीय लक्ष्य है कि जिगर repopulation को बढ़ावा दे सकता है की पहचान करने की अनुमति देता है. इस विधि को संभावित दवा लक्ष्यों या बायोमार्कर की पहचान करने के लिए जीन अभिव्यक्ति परिवर्तनों की रोग-विशिष्ट पहचान के लिए यकृत और अन्य अंग प्रणालियों में अन्य कोशिका प्रकारों का अध्ययन करने के लिए कार्यान्वित किया जा सकता है। एक अनुरूप तकनीक आत्मीयता शुद्धि का उपयोग कर hepatocytes repopulating से नाभिक इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और फिर इन विशिष्ट कोशिकाओं16के एक epigenetic विश्लेषण करने के लिए.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह कार्य निम्नलिखित अनुदानों द्वारा समर्थित था: F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (AM$), K08-DK106478 (KJW), और P30-DK050306 (Pilot grant kJW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated DWK Life Sciences (Wheaton) 358007
Absolutely RNA Miniprep Kit Agilent 400800
Anti-GFP antibodies Memorial Sloan-Kettering Antibody & Bioresource Core GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7
Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free Jackson ImmunoResearch 001-000-162
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836170001
Cycloheximide Millipore Sigma C7698
Deoxycholic acid, DOC Millipore Sigma D2510
D-Glucose, Dextrose Fisher Scientific D16
DL-Dithiothreitol Millipore Sigma D9779
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 Thermo Fisher Scientific 65602
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Fisher Scientific FB0875712
HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red Thermo Fisher Scientific 14065-056
HEPES, 1 M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific Thermo Fisher Scientific AAJ16924AE
Magnesium chloride, MgCl2  Millipore Sigma M8266
Methanol Fisher Scientific A452
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific VV-83061-00
NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module New England BioLabs E7490S
NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina New England BioLabs E7530S
Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630 Millipore Sigma I8896
Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated Ambion AM9932
Overhead Stirrer DWK Life Sciences (Wheaton) 903475
PBS Buffer (10x), pH 7.4 Ambion AM9625
Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated Thermo Fisher Scientific 29997
Potassium chloride, KCl Millipore Sigma P4504
RNA 6000 Pico Kit & Reagents Agilent 5067-1513
RNaseZap RNase Decontamination Solution Invitrogen AM9780
RNasin Ribonuclease Inhibitors Promega N2515
Sodium azide, NaN3 Millipore Sigma S2002
Sodium bicarbonate, NaHCO3 Millipore Sigma S6297
SUPERase·In RNase Inhibitor Invitrogen AM2694

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References

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माउस लिवर में सेल प्रकार-विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ेशन
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Wang, A. W., Zahm, A. M., Wangensteen, K. J. Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver. J. Vis. Exp. (151), e60242, doi:10.3791/60242 (2019).More

Wang, A. W., Zahm, A. M., Wangensteen, K. J. Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver. J. Vis. Exp. (151), e60242, doi:10.3791/60242 (2019).

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