Perfil de expressão gênica específica do tipo de célula no fígado do mouse
Summary
Traduzir a purificação da afinidade do Ribossoma (armadilha) permite a isolação rápida e eficiente do tipo de pilha-específico que traduz o mRNA. Aqui, Nós demonstramos um método que combine a injeção hidrodinâmico da cauda-veia em um modelo do rato do repovoamento do fígado e da armadilha para examinar o perfil da expressão de repovoamento hepatocytes.
Abstract
O repovoamento do fígado após ferimento é uma característica crucial dos mamíferos que impede a falha imediata do órgão e a morte após a exposição de toxinas ambientais. Uma compreensão mais profunda das mudanças na expressão gênica que ocorrem durante a repovoação poderia ajudar a identificar alvos terapêuticos para promover a restauração da função hepática no cenário de lesões. No entanto, os métodos para isolar especificamente os hepatócitos repovoadores são inibidos pela falta de marcadores celulares, números de células limitados e a fragilidade dessas células. O desenvolvimento de traduzir a tecnologia Ribossoma da purificação da afinidade (armadilha) conjuntamente com o modelo de Fah-/- mouse para recapitular o repovoamento no ajuste de ferimento de fígado permite o perfilamento da expressão de gene do repovoamento Hepatócitos. Com TRAP, o tipo de célula-específico traduzindo mRNA é rapidamente e eficientemente isolado. Nós desenvolvemos um método que utilize a armadilha com isolação afinidade-baseada de traduzir o mRNA dos hepatócitos que expressam seletivamente a proteína fluorescente verde (GFP)-etiquetaram a proteína ribosomal (RP), GFP: RPL10A. A armadilha contorna o período de tempo longo exigido para a classificação fluorescência-ativada da pilha que poderia mudar o perfil da expressão de Gene. Além disso, desde que somente os hepatócitos repovoamento expressam a proteína de fusão de GFP: RPL10A, o mRNA isolado é desprovido da contaminação dos hepatócitos feridos circunvizinhos e dos outros tipos da pilha no fígado. O mRNA afinidade-purified é da alta qualidade e permite a jusante PCR-ou a análise sequenciando-baseada high-throughput da expressão de Gene.
Introduction
Como o principal órgão metabólico em vertebrados, o fígado é responsável pela homeostase da glicose, síntese de proteínas séricas, secreção de ácido biliar e metabolismo xenobiótico e desintoxicação. O fígado possui uma extraordinária capacidade de regenerar o parênquima lesionado após a exposição a toxinas para prevenir a insuficiência hepática imediata1. Entretanto, a falha da regeneração pode ocorrer no ajuste do overconsumption do paracetamol ou do álcool, que pode conduzir à falha de fígado aguda2. Além disso, a lesão hepática crônica causada por infecção por hepatite viral, doença hepática gordurosa e esteatohepatite pode causar fibrose hepática, cirrose e carcinoma hepatocelular3. O único tratamento curativo disponível para doença hepática em estágio terminal é o transplante, mas é limitado pela escassez de órgãos, impedindo o tratamento eficiente para todos os pacientes4. Uma melhor compreensão do processo de recuperação após lesão hepática tóxica é, portanto, crucial para o desenvolvimento de tratamentos para estimular a regeneração suficiente para resgatar a função no órgão doente.
O sistema modelo mais amplamente aplicado para o estudo da regeneração hepática é a hepatectomia parcial em roedores, em que uma grande proporção do fígado é ressecada para estimular a rápida expansão do hepatócitos5. No entanto, a hepatectomia parcial não recapitulou a expansão dos hepatócitos após lesão hepática tóxica devido à falta de infiltração de células imunológicas e necrose celular de hepatócitos, muitas vezes observada no ajuste de lesão hepática aguda em humanos6. Um sistema mais adequado para modelar esta forma de renovação de órgãos é o Fah-/- mouse, que carece de fumarilacetoacetato hidrolase funcional (Fah) necessário para o metabolismo da tirosina adequada e desenvolve danos graves no fígado levando à morte7. Estes ratos podem ser mantidos em um estado saudável indefinidamente pelo tratamento com o nitisinona da droga na água bebendo. Alternativamente, a expressão de Fah pode ser restaurada pela entrega do transgene a um subconjunto dos hepatocytes, que expandirá para repovoar o fígado em cima da remoção do nitisinona8.
Para analisar as alterações da expressão gênica de repovoamento de hepatócitos, é necessária uma ferramenta para isolar especificamente os hepatócitos replicantes no Fah-/- mouse sem contaminação dos hepatócitos feridos vizinhos e outros tipos de células. Infelizmente, a triagem celular por fluorescência (FACS) dos hepatócitos é difícil, pois (1) a fragilidade dos hepatócitos que repovoam leva à má recuperação após a perfusão hepática, (2) replicar hepatócitos são altamente variáveis em tamanho, tornando o isolamento de uma população pura por FACS difícil, e (3) o tempo do procedimento da perfusão do fígado ao isolamento do RNA é maior de 2 h, daqui os perfis da expressão de gene podem sofrer mudanças artificiais substanciais antes que as amostras estejam adquiridas9.
Alternativamente, a expressão de ribossomas epitope-etiquetados especificamente em repovoamento hepatócitos permite o isolamento rápido de traduzir ativamente o mRNA limitado por ribossomas usando a purificação da afinidade imediatamente depois da colheita do órgão, com fígado maioria lisados de tecido. Aqui, nós descrevemos um protocolo para executar a purificação da afinidade da traduzir-ribosome (armadilha)10 seguido pelo RNA-seqüenciamento da elevado-produção (armadilha-Seq), para isolar especificamente e perfil mRNA em repovoamento hepatócitos no Fah-/- rato9. A coexpressão da proteína ribossomal proteína-etiquetada verde fluorescente (GFP: RPL10A) com Fah permite a purificação da afinidade de traduzir o mRNA limitado por detectados que contem GFP: RPL10A. Este método evita todas as etapas da dissociação da pilha, tais como a perfusão do fígado para isolar os hepatocytes repovoamento frágeis. Em lugar de, utiliza o lysis do tecido inteiro do órgão e os anticorpos para extrair ràpida o RNA especificamente das pilhas do alvo. Finalmente, o isolamento de mRNA abundante e de alta qualidade via TRAP-Seq permite que aplicações downstream, como a análise de sequenciamento, analisem a mudança dinâmica da expressão gênica durante o processo de repopulação.
Protocol
Representative Results
Discussion
A armadilha-seq é uma técnica para o isolamento tipo-específico da pilha de traduzir o mRNA através dos ribossomas epitope-etiquetados e apresenta uma alternativa às aproximações de FACS, porque contorna limitações tais como exigências de tempo de FACS9. Em vez disso, TRAP permite o isolamento rápido e eficiente do RNA diretamente dos tecidos a granel, ajudando a evitar quaisquer alterações na expressão gênica. Trap-seq é especialmente adequado para uso no fígado de repovoamento <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelas seguintes concessões: F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (AMZ), K08-DK106478 (KJW), e p30-DK050306 (concessão do piloto a KJW).
Materials
| 10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated | DWK Life Sciences (Wheaton) | 358007 | |
| Absolutely RNA Miniprep Kit | Agilent | 400800 | |
| Anti-GFP antibodies | Memorial Sloan-Kettering Antibody & Bioresource Core | GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7 | |
| Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Cycloheximide | Millipore Sigma | C7698 | |
| Deoxycholic acid, DOC | Millipore Sigma | D2510 | |
| D-Glucose, Dextrose | Fisher Scientific | D16 | |
| DL-Dithiothreitol | Millipore Sigma | D9779 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Thermo Fisher Scientific | 65602 | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| HEPES, 1M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific | Thermo Fisher Scientific | AAJ16924AE | |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Millipore Sigma | M8266 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | VV-83061-00 | |
| NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module | New England BioLabs | E7490S | |
| NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7530S | |
| Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630 | Millipore Sigma | I8896 | |
| Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated | Ambion | AM9932 | |
| Overhead Stirrer | DWK Life Sciences (Wheaton) | 903475 | |
| PBS Buffer (10x), pH 7.4 | Ambion | AM9625 | |
| Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated | Thermo Fisher Scientific | 29997 | |
| Potassium chloride, KCl | Millipore Sigma | P4504 | |
| RNA 6000 Pico Kit & Reagents | Agilent | 5067-1513 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitors | Promega | N2515 | |
| Sodium azide, NaN3 | Millipore Sigma | S2002 | |
| Sodium bicarbonate, NaHCO3 | Millipore Sigma | S6297 | |
| SUPERase·In RNase Inhibitor | Invitrogen | AM2694 | |
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