Summary

마우스 간에서 세포 유형 별 유전자 발현 프로파일링

Published: September 17, 2019
doi:

Summary

리보솜 친화도 정제(TRAP)를 번역하면 세포 유형별 번역 mRNA를 신속하고 효율적으로 분리할 수 있습니다. 여기서, 우리는 간 재모독 및 TRAP의 마우스 모델에서 유체역학적 꼬리 정맥 주입을 결합하여 간세포를 재채우는 발현 프로필을 검사하는 방법을 입증한다.

Abstract

상해 후에 간 재인구는 환경 독소의 노출 후에 즉각적인 기관 실패 그리고 죽음을 방지하는 포유동물의 중요한 특징입니다. 재인구 도중 생기는 유전자 발현에 있는 변경의 더 깊은 이해는 상해의 조정에 있는 간 기능의 회복을 승진시키기 위하여 치료 표적을 확인하는 것을 도울 수 있었습니다. 그럼에도 불구하고, 재채백 간세포를 구체적으로 분리하는 방법은 세포 마커의 부족, 제한된 세포 수, 및 이들 세포의 취약성에 의해 억제된다. Fah -/- 마우스 모델과 함께 리보솜 친화성 정제(TRAP) 기술을 번역하여 간 손상 설정에서 재인구를 재추정할 수 있도록 하여 재채우기의 유전자 발현 프로파일링을 허용합니다. 간세포. TRAP을 사용하면 세포 유형별 번역 mRNA가 신속하고 효율적으로 분리됩니다. 우리는 녹색 형광 단백질 (GFP)태그 리보좀 단백질 (RP), GFP :RPL10A를 선택적으로 발현하는 간세포에서 mRNA를 번역하는 친화성 기반 격리와 TRAP을 활용하는 방법을 개발했습니다. TRAP은 유전자 발현 단면도를 바꿀 수 있는 형광 활성화 세포 선별에 필요한 긴 기간을 우회한다. 더욱이, 재채백 된 간세포만이 GFP:RPL10A 융합 단백질을 발현하기 때문에, 단리된 mRNA는 주변의 부상당한 간세포 및 간에서 다른 세포 유형으로부터의 오염이 결여된다. 친화도 정제 mRNA는 고품질이며 다운스트림 PCR- 또는 고처리량 시퀀싱 기반 유전자 발현 분석을 허용합니다.

Introduction

척추 동물의 주요 대사 기관으로, 간은 포도 당 항상성에 대 한 책임, 혈 청 단백질 합성, 담 즙 산 분 비, 그리고 xenobiotic 물질 대사 와 해독. 간은 즉각적인 간 부전을 방지하기 위해 독소에 노출시 부상당한 자렌치를 재생하는 특별한 능력을 가지고1. 그러나, 재생의 실패는 급성 간 기능 부전으로 이어질 수있는 아세트 아미노 펜 또는 알코올 과소비의 설정에서 발생할 수 있습니다2. 또한, 바이러스성 간염 감염, 지방간 질환 및 지방 간염으로 인한 만성 간 손상은 간 섬유증, 간경변 및 간세포 암종을 일으킬 수 있습니다3. 말기 간 질환에 대한 유일한 치료 치료는 이식이지만 장기 부족에 의해 제한되어 모든 환자에 대한 효율적인 치료를방지4. 따라서 독성 간 손상 후 회복 과정을 더 잘 이해하는 것은 병들린 장기의 기능을 구출하기에 충분한 재생을 자극하는 치료법의 개발에 중요합니다.

간 재생 연구를 위한 가장 광범위하게 적용된 모델 시스템은 설치류의 부분 간절제술이며, 이 때 간장의 상당 부분이 절제되어 급속한 간세포 팽창을자극한다 5. 그러나, 부분 간절제술은 인간에서 급성 간 손상의 설정에서 종종 관찰되는 면역 세포 침윤 및 간세포 괴사의 부족으로 인한 독성 간 손상에 따른 간세포 팽창을 되풀이하지 않는다6. 장기 재생의이 형태를 모델링하는 더 적합한 시스템은 Fah-/- 마우스, 이는 적절한 티로신 대사에 필요한 기능적 fumarylacetoacetatetatehydrolase (FAH)가 부족하고 죽음에 이르는 심각한 간 손상을 개발7. 이들 마우스는 식수에서 니티시논의 약물로 치료함으로써 무기한 건강한 상태로 유지될 수 있다. 대안적으로, FAH 발현은 간세포의 서브세트로의 이식유전자 전달에 의해 복원될 수 있으며, 이는 니티시노네 제거 시 간을 다시 채우도록 확장될 것이다8.

간세포 를 다시 채우는 유전자 발현 변화를 프로파일링하기 위해, 이웃의 부상당한 간세포 및 기타 세포 유형으로부터의 오염 없이Fah-/- 마우스에서 복제 된 간세포를 구체적으로 분리하는 도구가 필요합니다. 불행하게도, 간세포의 형광 보조 세포 선별 (FACS)은 (1) 간 관류 후 가난한 회복으로 이어지기 때문에 어렵고, (2) 간세포를 복제하는 것은 크기가 매우 다양하여 격리를 만듭니다. FACS에 의한 순수한 집단의 어렵고, (3) 간 관류에서 RNA 격리까지의 절차 시간이 2시간보다 크므로, 따라서 유전자 발현 프로파일은 샘플이 획득되기 전에 상당한 인공 변화를 겪을 수 있다9.

양자구를 다시 채우는 데 에피토프 태그가 달린 리보솜의 발현은 장기 수확 직후, 대량 간으로 리보솜에 의해 결합된 리보솜에 의한 mRNA를 능동적으로 번역하는 신속한 분리를 허용한다. 조직이 lysates. 여기서, 우리는 번역-리보솜 친화도 정제(TRAP)10을 수행하고 고처리량 RNA-seq(TRAP-seq)를 수행하는 프로토콜을 설명하고, Fah에서간세포를 재채우시에서 mRNA를 구체적으로 분리및 프로파일링하는 데있다.– 마우스9. FAH를 가진 녹색 형광 단백질 태그 리보솜 단백질 (GFP:RPL10A)의 공동 발현은 GFP:RPL10A를 포함하는 폴리좀에 의해 결합된 mRNA번역의 친화도 정제를 허용합니다. 이 방법은 간 관류와 같은 모든 세포 해리 단계를 피하여 간세포를 다시 채우는 연약한 것을 분리합니다. 대신, 그것은 표적으로 한 세포에서 RNA를 급속하게 추출하기 위하여 전체 기관 조직 및 항체의 lysis를 이용합니다. 마지막으로 TRAP-seq를 통해 풍부하고 고품질의 mRNA를 분리하면 시퀀싱 분석과 같은 다운스트림 애플리케이션을 통해 재수집 프로세스 중에 유전자 발현의 동적 변화를 프로파일링할 수 있습니다.

Protocol

마우스의 사용을 관련시키는 모든 방법은 펜실베니아 대학에 있는 동물 복지의 펜트 오피스의 IACUC에 의해 제공된 지침과 일치합니다. 1. 시약 준비 사이클로색시미드 0.1 g/mL 사이클로헨시미드 500 μL을 만들려면 50 mg의 사이클로헵시미드를 메탄올 500 μL에 일시 중단하십시오.주의 사항: 사이클로육시미드는 환경에 매우 독성이 있으…

Representative Results

Fah-/- 마우스의 간세포를 다시 채우는 유전자 발현을 프로파일링하기 위해, Gfp:Rpl10a 융합 및 Fah 트랜스게전유전자는 트랜스포종 함유 플라스미드8(TRAP 벡터) 내에서 간으로 공동 전달된다. 유체 역학 주입(그림 1A). 니티시돈의 제거는 부상당한 자렌치마를 다시 채우기 위해 FAH를 안정적으로 ?…

Discussion

TRAP-seq는 에피토프 태그리보솜을 통해 mRNA를 번역하는 세포 유형별 격리를 위한 기술이며 FACS9의시간 요구 사항과 같은 제한을 우회하기 때문에 FACS 접근법에 대한 대안을 제시한다. 대신, TRAP은 대량 조직에서 직접 RNA의 신속하고 효율적인 격리를 허용, 유전자 발현에 있는 어떤 변경든지 피하는 것을 돕습니다. TRAP-seq는 특히 다시 채우는 Fah-/- 마우스 간에서 사용…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (AMZ), K08-DK106478 (KJW), P30-DK050306 (KJW에 대한 파일럿 보조금)에 의해 지원되었습니다.

Materials

10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated DWK Life Sciences (Wheaton) 358007
Absolutely RNA Miniprep Kit Agilent 400800
Anti-GFP antibodies Memorial Sloan-Kettering Antibody & Bioresource Core GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7
Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free Jackson ImmunoResearch 001-000-162
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836170001
Cycloheximide Millipore Sigma C7698
Deoxycholic acid, DOC Millipore Sigma D2510
D-Glucose, Dextrose Fisher Scientific D16
DL-Dithiothreitol Millipore Sigma D9779
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 Thermo Fisher Scientific 65602
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Fisher Scientific FB0875712
HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red Thermo Fisher Scientific 14065-056
HEPES, 1M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific Thermo Fisher Scientific AAJ16924AE
Magnesium chloride, MgCl2  Millipore Sigma M8266
Methanol Fisher Scientific A452
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific VV-83061-00
NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module New England BioLabs E7490S
NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina New England BioLabs E7530S
Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630 Millipore Sigma I8896
Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated Ambion AM9932
Overhead Stirrer DWK Life Sciences (Wheaton) 903475
PBS Buffer (10x), pH 7.4 Ambion AM9625
Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated Thermo Fisher Scientific 29997
Potassium chloride, KCl Millipore Sigma P4504
RNA 6000 Pico Kit & Reagents Agilent 5067-1513
RNaseZap RNase Decontamination Solution Invitrogen AM9780
RNasin Ribonuclease Inhibitors Promega N2515
Sodium azide, NaN3 Millipore Sigma S2002
Sodium bicarbonate, NaHCO3 Millipore Sigma S6297
SUPERase·In RNase Inhibitor Invitrogen AM2694

References

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Cite This Article
Wang, A. W., Zahm, A. M., Wangensteen, K. J. Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver. J. Vis. Exp. (151), e60242, doi:10.3791/60242 (2019).

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