마우스 간에서 세포 유형 별 유전자 발현 프로파일링
Summary
리보솜 친화도 정제(TRAP)를 번역하면 세포 유형별 번역 mRNA를 신속하고 효율적으로 분리할 수 있습니다. 여기서, 우리는 간 재모독 및 TRAP의 마우스 모델에서 유체역학적 꼬리 정맥 주입을 결합하여 간세포를 재채우는 발현 프로필을 검사하는 방법을 입증한다.
Abstract
상해 후에 간 재인구는 환경 독소의 노출 후에 즉각적인 기관 실패 그리고 죽음을 방지하는 포유동물의 중요한 특징입니다. 재인구 도중 생기는 유전자 발현에 있는 변경의 더 깊은 이해는 상해의 조정에 있는 간 기능의 회복을 승진시키기 위하여 치료 표적을 확인하는 것을 도울 수 있었습니다. 그럼에도 불구하고, 재채백 간세포를 구체적으로 분리하는 방법은 세포 마커의 부족, 제한된 세포 수, 및 이들 세포의 취약성에 의해 억제된다. Fah -/- 마우스 모델과 함께 리보솜 친화성 정제(TRAP) 기술을 번역하여 간 손상 설정에서 재인구를 재추정할 수 있도록 하여 재채우기의 유전자 발현 프로파일링을 허용합니다. 간세포. TRAP을 사용하면 세포 유형별 번역 mRNA가 신속하고 효율적으로 분리됩니다. 우리는 녹색 형광 단백질 (GFP)태그 리보좀 단백질 (RP), GFP :RPL10A를 선택적으로 발현하는 간세포에서 mRNA를 번역하는 친화성 기반 격리와 TRAP을 활용하는 방법을 개발했습니다. TRAP은 유전자 발현 단면도를 바꿀 수 있는 형광 활성화 세포 선별에 필요한 긴 기간을 우회한다. 더욱이, 재채백 된 간세포만이 GFP:RPL10A 융합 단백질을 발현하기 때문에, 단리된 mRNA는 주변의 부상당한 간세포 및 간에서 다른 세포 유형으로부터의 오염이 결여된다. 친화도 정제 mRNA는 고품질이며 다운스트림 PCR- 또는 고처리량 시퀀싱 기반 유전자 발현 분석을 허용합니다.
Introduction
척추 동물의 주요 대사 기관으로, 간은 포도 당 항상성에 대 한 책임, 혈 청 단백질 합성, 담 즙 산 분 비, 그리고 xenobiotic 물질 대사 와 해독. 간은 즉각적인 간 부전을 방지하기 위해 독소에 노출시 부상당한 자렌치를 재생하는 특별한 능력을 가지고1. 그러나, 재생의 실패는 급성 간 기능 부전으로 이어질 수있는 아세트 아미노 펜 또는 알코올 과소비의 설정에서 발생할 수 있습니다2. 또한, 바이러스성 간염 감염, 지방간 질환 및 지방 간염으로 인한 만성 간 손상은 간 섬유증, 간경변 및 간세포 암종을 일으킬 수 있습니다3. 말기 간 질환에 대한 유일한 치료 치료는 이식이지만 장기 부족에 의해 제한되어 모든 환자에 대한 효율적인 치료를방지4. 따라서 독성 간 손상 후 회복 과정을 더 잘 이해하는 것은 병들린 장기의 기능을 구출하기에 충분한 재생을 자극하는 치료법의 개발에 중요합니다.
간 재생 연구를 위한 가장 광범위하게 적용된 모델 시스템은 설치류의 부분 간절제술이며, 이 때 간장의 상당 부분이 절제되어 급속한 간세포 팽창을자극한다 5. 그러나, 부분 간절제술은 인간에서 급성 간 손상의 설정에서 종종 관찰되는 면역 세포 침윤 및 간세포 괴사의 부족으로 인한 독성 간 손상에 따른 간세포 팽창을 되풀이하지 않는다6. 장기 재생의이 형태를 모델링하는 더 적합한 시스템은 Fah-/- 마우스, 이는 적절한 티로신 대사에 필요한 기능적 fumarylacetoacetatetatehydrolase (FAH)가 부족하고 죽음에 이르는 심각한 간 손상을 개발7. 이들 마우스는 식수에서 니티시논의 약물로 치료함으로써 무기한 건강한 상태로 유지될 수 있다. 대안적으로, FAH 발현은 간세포의 서브세트로의 이식유전자 전달에 의해 복원될 수 있으며, 이는 니티시노네 제거 시 간을 다시 채우도록 확장될 것이다8.
간세포 를 다시 채우는 유전자 발현 변화를 프로파일링하기 위해, 이웃의 부상당한 간세포 및 기타 세포 유형으로부터의 오염 없이Fah-/- 마우스에서 복제 된 간세포를 구체적으로 분리하는 도구가 필요합니다. 불행하게도, 간세포의 형광 보조 세포 선별 (FACS)은 (1) 간 관류 후 가난한 회복으로 이어지기 때문에 어렵고, (2) 간세포를 복제하는 것은 크기가 매우 다양하여 격리를 만듭니다. FACS에 의한 순수한 집단의 어렵고, (3) 간 관류에서 RNA 격리까지의 절차 시간이 2시간보다 크므로, 따라서 유전자 발현 프로파일은 샘플이 획득되기 전에 상당한 인공 변화를 겪을 수 있다9.
양자구를 다시 채우는 데 에피토프 태그가 달린 리보솜의 발현은 장기 수확 직후, 대량 간으로 리보솜에 의해 결합된 리보솜에 의한 mRNA를 능동적으로 번역하는 신속한 분리를 허용한다. 조직이 lysates. 여기서, 우리는 번역-리보솜 친화도 정제(TRAP)10을 수행하고 고처리량 RNA-seq(TRAP-seq)를 수행하는 프로토콜을 설명하고, Fah에서간세포를 재채우시에서 mRNA를 구체적으로 분리및 프로파일링하는 데있다.– 마우스9. FAH를 가진 녹색 형광 단백질 태그 리보솜 단백질 (GFP:RPL10A)의 공동 발현은 GFP:RPL10A를 포함하는 폴리좀에 의해 결합된 mRNA번역의 친화도 정제를 허용합니다. 이 방법은 간 관류와 같은 모든 세포 해리 단계를 피하여 간세포를 다시 채우는 연약한 것을 분리합니다. 대신, 그것은 표적으로 한 세포에서 RNA를 급속하게 추출하기 위하여 전체 기관 조직 및 항체의 lysis를 이용합니다. 마지막으로 TRAP-seq를 통해 풍부하고 고품질의 mRNA를 분리하면 시퀀싱 분석과 같은 다운스트림 애플리케이션을 통해 재수집 프로세스 중에 유전자 발현의 동적 변화를 프로파일링할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
TRAP-seq는 에피토프 태그리보솜을 통해 mRNA를 번역하는 세포 유형별 격리를 위한 기술이며 FACS9의시간 요구 사항과 같은 제한을 우회하기 때문에 FACS 접근법에 대한 대안을 제시한다. 대신, TRAP은 대량 조직에서 직접 RNA의 신속하고 효율적인 격리를 허용, 유전자 발현에 있는 어떤 변경든지 피하는 것을 돕습니다. TRAP-seq는 특히 다시 채우는 Fah-/- 마우스 간에서 사용…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (AMZ), K08-DK106478 (KJW), P30-DK050306 (KJW에 대한 파일럿 보조금)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| 10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated | DWK Life Sciences (Wheaton) | 358007 | |
| Absolutely RNA Miniprep Kit | Agilent | 400800 | |
| Anti-GFP antibodies | Memorial Sloan-Kettering Antibody & Bioresource Core | GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7 | |
| Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Cycloheximide | Millipore Sigma | C7698 | |
| Deoxycholic acid, DOC | Millipore Sigma | D2510 | |
| D-Glucose, Dextrose | Fisher Scientific | D16 | |
| DL-Dithiothreitol | Millipore Sigma | D9779 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Thermo Fisher Scientific | 65602 | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| HEPES, 1M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific | Thermo Fisher Scientific | AAJ16924AE | |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Millipore Sigma | M8266 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | VV-83061-00 | |
| NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module | New England BioLabs | E7490S | |
| NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7530S | |
| Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630 | Millipore Sigma | I8896 | |
| Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated | Ambion | AM9932 | |
| Overhead Stirrer | DWK Life Sciences (Wheaton) | 903475 | |
| PBS Buffer (10x), pH 7.4 | Ambion | AM9625 | |
| Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated | Thermo Fisher Scientific | 29997 | |
| Potassium chloride, KCl | Millipore Sigma | P4504 | |
| RNA 6000 Pico Kit & Reagents | Agilent | 5067-1513 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitors | Promega | N2515 | |
| Sodium azide, NaN3 | Millipore Sigma | S2002 | |
| Sodium bicarbonate, NaHCO3 | Millipore Sigma | S6297 | |
| SUPERase·In RNase Inhibitor | Invitrogen | AM2694 | |
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