Zelltypspezifische Gene Expression Profiling in der Mausleber
Summary
Die Übersetzung der Ribosomenaffinitätsreinigung (TRAP) ermöglicht eine schnelle und effiziente Isolierung der zelltypspezifischen mRNA. Hier zeigen wir eine Methode, die hydrodynamische Schwanzveneninjektion in einem Mausmodell der Leberrepopulation und TRAP kombiniert, um das Expressionsprofil von wiederbevölkerten Hepatozyten zu untersuchen.
Abstract
Die Wiederbesiedlung der Leber nach verletzungen ist ein entscheidendes Merkmal von Säugetieren, das sofortiges Organversagen und den Tod nach Exposition von Umweltgiften verhindert. Ein tieferes Verständnis der Veränderungen in der Genexpression, die während der Repopulation auftreten, könnte helfen, therapeutische Ziele zu identifizieren, um die Wiederherstellung der Leberfunktion bei der Einstellung von Verletzungen zu fördern. Nichtsdestotrotz werden Methoden, um speziell die wiederbevölkerten Hepatozyten zu isolieren, durch einen Mangel an Zellmarkern, begrenzte Zellzahlen und die Fragilität dieser Zellen gehemmt. Die Entwicklung der Übersetzung der Ribosomenaffinitätsreinigung (TRAP) Technologie in Verbindung mit dem Fah-/- Mausmodell, um die Repopulation bei der Einstellung von Leberverletzungen zu rekapitulieren, ermöglicht die Genexpression-Profilierung der Repopulation Hepatozyten. Mit TRAP wird zelltypspezifische sendemRNA schnell und effizient isoliert. Wir haben eine Methode entwickelt, die TRAP mit Affinitäts-basierter Isolierung der Übersetzung von mRNA aus Hepatozyten verwendet, die selektiv das grüne fluoreszierende Protein (GFP)-getaggtes ribosomales Protein (RP), GFP:RPL10A ausdrücken. TRAP umgeht den langen Zeitraum, der für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung erforderlich ist, die das Genexpressionsprofil verändern könnte. Da nur die wiederbevölkerten Hepatozyten das GFP:RPL10A-Fusionsprotein ausdrücken, ist die isolierte mRNA frei von Verunreinigungen durch die umliegenden verletzten Hepatozyten und andere Zelltypen in der Leber. Die affinitätsgereinigte mRNA ist von hoher Qualität und ermöglicht eine nachgeschaltete PCR- oder High-Throughput-Sequenzierungs-basierte Analyse der Genexpression.
Introduction
Als wichtigstes Stoffwechselorgan bei Wirbeltieren ist die Leber für Glukosehomöostase, Serumproteinsynthese, Gallensäuresekretion und xenobiotischen Stoffwechsel und Entgiftung verantwortlich. Die Leber besitzt eine außergewöhnliche Fähigkeit, das verletzte Parenchym bei Exposition gegenüber Toxinen zu regenerieren, um sofortiges Leberversagen zu verhindern1. Jedoch, Versagen der Regeneration kann bei der Einstellung von Acetaminophen oder Alkohol Überkonsum auftreten, die zu akutem Leberversagen führen kann2. Darüber hinaus können chronische Leberschäden durch virale Hepatitis-Infektion, Fettleber-Krankheit und Steatohepatitis Leberfibrose, Zirrhose und hepatozelluläres Karzinom3verursachen. Die einzige verfügbare heilende Behandlung für Lebererkrankungen im Endstadium ist die Transplantation, wird aber durch Organmangel begrenzt, wodurch eine effiziente Behandlung für alle Patienten verhindert wird4. Ein besseres Verständnis des Genesungsprozesses nach toxischen Leberverletzungen ist daher entscheidend für die Entwicklung von Behandlungen zur Stimulierung der Regeneration ausreichend, um die Funktion im erkrankten Organ zu retten.
Das am weitesten verbreitete Modellsystem zur Untersuchung der Leberregeneration ist die partielle Hepatektomie bei Nagetieren, bei der ein großer Teil der Leber reseciert wird, um die schnelle Hepatozytenexpansion zu stimulieren5. Jedoch, partielle Hepatectomie rekapituliert Hepatozyten-Expansion nach toxischen Leberverletzungen aufgrund des Mangels an Immunzellinfiltration und Hepatozytenzellnekrose oft bei der Einstellung von akuten Leberverletzungen beim Menschen beobachtet6. Ein geeigneteres System zur Modellierung dieser Form der Organerneuerung ist die Fah-/- Maus, der es an funktionellem Fumarylacetoacetathydrolase (FAH) fehlt, das für den richtigen Tyrosinstoffwechsel erforderlich ist und schwere Leberschäden entwickelt, die zum Tod führen7. Diese Mäuse können in einem gesunden Zustand auf unbestimmte Zeit durch die Behandlung mit dem Medikament Nitisinon im Trinkwasser gehalten werden. Alternativ kann der FAH-Ausdruck durch Transgenabgabe an eine Teilmenge von Hepatozyten wiederhergestellt werden, die sich ausdehnen wird, um die Leber bei Nitisinonentfernung wieder zu bevölkern8.
Um die Genexpressionsänderungen von wiederbevölkerten Hepatozyten zu profilieren, ist ein Werkzeug erforderlich, um replizierende Hepatozyten in der Fah-/- Maus ohne Kontamination durch die benachbarten verletzten Hepatozyten und andere Zelltypen gezielt zu isolieren. Leider ist die fluoreszenbasierte Zellsortierung (FACS) von Hepatozyten schwierig, da (1) die Fragilität der wiederbevölkerten Hepatozyten zu einer schlechten Erholung nach Leberperfusion führt, (2) die Replizieren von Hepatozyten sind sehr variabel in der Größe, was die Isolation einer reinen Population durch FACS schwierig ist, und (3) die Verfahrenszeit von der Leberperfusion bis zur RNA-Isolierung größer als 2 h ist, daher können Genexpressionsprofile erheblichen künstlichen Veränderungen unterzogen werden, bevor Proben erworben werden9.
Alternativ ermöglicht die Expression von Epitop-markierten Ribosomen speziell bei der Wiederbesiedlung von Hepatozyten die schnelle Isolierung der aktiv übersetzenden mRNA, die durch Ribosomen gebunden ist, indem sie unmittelbar nach der Organernte mit Bulk-Leber Gewebelysate. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Translating-Ribosome-Affinitätsreinigung (TRAP)10, gefolgt von RNA-Sequenzierung mit hohem Durchsatz (TRAP-seq), um mRNA gezielt zu isolieren und zu profilieren, um Hepatozyten im Fah-/- Maus9. Die Coexpression von grünem fluoreszierendem proteingetaggtem ribosomalem Protein (GFP:RPL10A) mit FAH ermöglicht die Affinitätsreinigung der Übersetzung von mRNA gebunden durch Polysomen, die GFP:RPL10A enthalten. Diese Methode vermeidet alle Zelldissoziationsschritte, wie Leberperfusion, um zerbrechliche wiederbevölkerende Hepatozyten zu isolieren. Stattdessen nutzt es die Lyse des gesamten Organgewebes und Antikörper, um die RNA schnell gezielt aus den Zielzellen zu extrahieren. Schließlich ermöglicht die Isolierung reichlich vorhandener, hochwertiger mRNA über TRAP-seq nachgeschaltete Anwendungen wie sequenziumierende Analysen, um die dynamische Veränderung der Genexpression während des Repopulation-Prozesses zu profilieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
TRAP-seq ist eine Technik zur zelltypspezifischen Isolierung der Übersetzung von mRNA über epitopgetaggte Ribosomen und stellt eine Alternative zu FACS-Ansätzen dar, da sie Beschränkungen wie den Zeitbedarf von FACS9umgeht. Stattdessen ermöglicht TRAP eine schnelle und effiziente Isolierung von RNA direkt aus Schüttgewebe n. Chr. und hilft, Veränderungen in der Genexpression zu vermeiden. TRAP-seq eignet sich besonders gut für den Einsatz in der wiederbevölkernden Fah-/- </…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch folgende Stipendien unterstützt: F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (AMZ), K08-DK106478 (KJW) und P30-DK050306 (Pilotzuschuss an KJW).
Materials
| 10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated | DWK Life Sciences (Wheaton) | 358007 | |
| Absolutely RNA Miniprep Kit | Agilent | 400800 | |
| Anti-GFP antibodies | Memorial Sloan-Kettering Antibody & Bioresource Core | GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7 | |
| Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Cycloheximide | Millipore Sigma | C7698 | |
| Deoxycholic acid, DOC | Millipore Sigma | D2510 | |
| D-Glucose, Dextrose | Fisher Scientific | D16 | |
| DL-Dithiothreitol | Millipore Sigma | D9779 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Thermo Fisher Scientific | 65602 | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| HEPES, 1M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific | Thermo Fisher Scientific | AAJ16924AE | |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Millipore Sigma | M8266 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | VV-83061-00 | |
| NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module | New England BioLabs | E7490S | |
| NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7530S | |
| Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630 | Millipore Sigma | I8896 | |
| Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated | Ambion | AM9932 | |
| Overhead Stirrer | DWK Life Sciences (Wheaton) | 903475 | |
| PBS Buffer (10x), pH 7.4 | Ambion | AM9625 | |
| Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated | Thermo Fisher Scientific | 29997 | |
| Potassium chloride, KCl | Millipore Sigma | P4504 | |
| RNA 6000 Pico Kit & Reagents | Agilent | 5067-1513 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitors | Promega | N2515 | |
| Sodium azide, NaN3 | Millipore Sigma | S2002 | |
| Sodium bicarbonate, NaHCO3 | Millipore Sigma | S6297 | |
| SUPERase·In RNase Inhibitor | Invitrogen | AM2694 | |
References
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