माउस लिवर में सेल प्रकार-विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ेशन
Summary
अनुवाद राइबोसोम आत्मीयता शुद्धिकरण (TRAP) सेल प्रकार के विशेष अनुवाद MRNA के तेजी से और कुशल अलगाव सक्षम बनाता है. यहाँ, हम एक विधि है कि जिगर repopulation और TRAP के एक माउस मॉडल में hydrodynamic पूंछ नस इंजेक्शन को जोड़ती है repopulating hepatocytes की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल की जांच प्रदर्शित करता है.
Abstract
चोट के बाद जिगर repopulation स्तनधारियों की एक महत्वपूर्ण विशेषता है जो पर्यावरण विषाक्त पदार्थों के जोखिम के बाद तत्काल अंग विफलता और मौत से बचाता है. जीन अभिव्यक्ति है कि repopulation के दौरान होने में परिवर्तन की गहरी समझ में मदद कर सकता है चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए चोटों की स्थापना में जिगर समारोह की बहाली को बढ़ावा देने के. फिर भी, विशेष रूप से repopulating hepatocytes को अलग करने के तरीके सेल मार्करों की कमी से बाधित कर रहे हैं, सीमित सेल संख्या, और इन कोशिकाओं की कमजोरी. जिगर की चोट की स्थापना में repopulation recapitulate करने के लिए माउस मॉडल के साथ संयोजन के रूप में राइबोसोम आत्मीयता शुद्धि (TRAP) प्रौद्योगिकी का अनुवाद करने के विकास की अनुमति देता है जीन अभिव्यक्ति repopulating की रूपरेखा हेप्टोसाइट्स. TRAP के साथ, सेल प्रकार-विशिष्ट अनुवाद MRNA तेजी से और कुशलता से अलग है. हम एक विधि है कि hepatocytes से MRNA अनुवाद के आत्मीयता के आधार पर अलगाव के साथ TRAP का उपयोग करता है कि चुनिंदा हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP)-टैग ribosomal प्रोटीन (आरपी), GFP: RPL10A व्यक्त विकसित की है. TRAP फ्लोरोसेंट-सक्रिय सेल छँटाई के लिए आवश्यक लंबे समय की अवधि को दरकिनार करता है जो जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल को बदल सकता है। इसके अलावा, के बाद से केवल repopulating hepatocytes GFP व्यक्त: RPL10A संलयन प्रोटीन, अलग MRNA आसपास के घायल hepatocytes और जिगर में अन्य सेल प्रकार से संदूषण से रहित है. आत्मीयता-शुद्ध MRNA उच्च गुणवत्ता का है और जीन अभिव्यक्ति के डाउनस्ट्रीम पीसीआर- या उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण-आधारित विश्लेषण की अनुमति देता है।
Introduction
कशेरुकी में मुख्य चयापचय अंग के रूप में, जिगर ग्लूकोज homeostasis, सीरम प्रोटीन संश्लेषण, पित्त एसिड स्राव, और विदेशी जीवचयापचय और detoxification के लिए जिम्मेदार है. जिगर के पास तत्काल जिगर की विफलता को रोकने के लिए विषाक्त पदार्थों के संपर्क में घायल पैरेन्काइमा को पुनर्जीवित करने की असाधारण क्षमता होतीहै. हालांकि, पुनर्जनन की विफलता acetaminophen या शराब overconsumption की स्थापना में हो सकता है, जो तीव्र जिगर की विफलता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं2. इसके अलावा, वायरल हेपेटाइटिस संक्रमण, फैटी यकृत रोग, और स्टेटोहेपेटाइटिस के कारण पुरानी जिगर की चोट यकृत फाइब्रोसिस, सिरोसिस, और हेपेटोकोशिकीय कार्सिनोमा3का कारण बन सकती है। अंत चरण जिगर की बीमारी के लिए केवल उपलब्ध उपचारात्मक उपचार प्रत्यारोपण है, लेकिन अंग की कमी से सीमित है, सभी रोगियों के लिए कुशल उपचार को रोकने4. विषाक्त जिगर की चोट के बाद वसूली की प्रक्रिया का एक बेहतर समझ इसलिए उपचार के विकास के लिए महत्वपूर्ण है पुनर्जनन रोगग्रस्त अंग में समारोह बचाव के लिए पर्याप्त प्रोत्साहित करने के लिए.
यकृत पुनर्जनन के अध्ययन के लिए सबसे व्यापक रूप से अनुप्रयुक्त मॉडल प्रणाली कृन्तकों में आंशिक हेपेटेक्टॉमी है, जिसमें यकृत का एक बड़ा हिस्सा तेजी से हेप्टोसाइट विस्तार को प्रोत्साहित करने के लिए पुनर्कृत ीकृत किया जाता है5. हालांकि, आंशिक hepatectomy प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ की कमी के कारण विषाक्त जिगर की चोट के बाद hepatocyte विस्तार recapitulate नहीं करता है और hepatocye सेल नेक्रोसिस अक्सर मनुष्यों में तीव्र जिगर की चोट की स्थापना में मनाया6. अंग नवीकरण के इस रूप को मॉडल करने के लिए एक अधिक उपयुक्त प्रणाली फह-/- माउस है, जिसमें उचित टायरोसिन चयापचय के लिए आवश्यक कार्यात्मक fumarylacetoaceate hydrolase (FAH) का अभाव है और गंभीर जिगर की क्षति विकसित करता है जिससे7मौत हो जाती है। इन चूहों पीने के पानी में दवा nitisinone के साथ उपचार के द्वारा अनिश्चित काल के लिए एक स्वस्थ राज्य में बनाए रखा जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, FAH अभिव्यक्ति hepatocytes के एक सबसेट है, जो nitisinone हटाने8पर जिगर repopulate करने के लिए विस्तार होगा transgene वितरण द्वारा बहाल किया जा सकता है.
हेप्टोसाइट्स repopulating के जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन प्रोफ़ाइल करने के लिए, विशेष रूप से पड़ोसी घायल hepatocytes और अन्य सेल प्रकार से संदूषण के बिना फूमें hepatocytes नकल को अलग करने के लिए एक उपकरण की आवश्यकता है. दुर्भाग्य से, हैपेटोसाइट्स के फ्लोरोसेंट-सहायता प्राप्त सेल छँटाई (FACS) मुश्किल है क्योंकि (1) यकृत भ्रम के बाद खराब वसूली की ओर जाता है, (2) हेपेटोसाइट्स की प्रतिकृति आकार में अत्यधिक चर रहे हैं, अलगाव बनाने एफएसीएस द्वारा एक शुद्ध जनसंख्या का मुश्किल, और (3) जिगर perfusion से आरएनए अलगाव के लिए प्रक्रिया समय 2 ज से अधिक है, इसलिए जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल पर्याप्त कृत्रिम परिवर्तन से गुजरना हो सकता है इससे पहले कि नमूने प्राप्त कर रहे हैं9.
वैकल्पिक रूप से, विशेष रूप से hepatocytes repopulating hepatocytes में विशेष रूप से epitope-tagged ribosomes की अभिव्यक्ति सक्रिय रूप से अंग फसल के बाद तुरंत आत्मीयता शुद्धि का उपयोग कर ribosomes द्वारा बाध्य MRNA अनुवाद के तेजी से अलगाव के लिए अनुमति देता है, थोक जिगर के साथ ऊतक lysates. यहाँ, हम अनुवाद करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन-रिबोसम आत्मीयता शुद्धि (TRAP)10 उच्च throughput आरएनए अनुक्रमण (TRAP-सेक) के बाद, विशेष रूप से अलग करने के लिए और प्रोफ़ाइल MRNA Fahमें hepatocytes repopulating में-/ मूषक9| एएचए के साथ ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन-टैगकिए रिबोसोमल प्रोटीन (जीएफपी: RPL10A) का सह-अभिव्यक्ति GFP:RPL10A युक्त पॉलीसोम ्स्स्ड एमआरएनए का अनुवाद करने की आत्मीयता शुद्धि की अनुमति देता है। इस विधि कमजोर repopulating hepatocytes को अलग करने के लिए जिगर perfusion के रूप में किसी भी सेल वियोजन चरणों से बचा जाता है. इसके बजाय, यह तेजी से लक्ष्य कोशिकाओं से विशेष रूप से आरएनए निकालने के लिए पूरे अंग ऊतक और एंटीबॉडी के lysis का इस्तेमाल करता है। अंत में, TRAP-सेक के माध्यम से प्रचुर मात्रा में, उच्च गुणवत्ता वाले एमआरएनए का अलगाव पुनर्जनसंख्या प्रक्रिया के दौरान जीन अभिव्यक्ति के गतिशील परिवर्तन को प्रोफ़ाइल करने के लिए अनुक्रमण विश्लेषण जैसे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों को सक्षम बनाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
TRAP-सेक एपिटो-टैग्ड राइबोसोम के माध्यम से MRNA अनुवाद के सेल प्रकार-विशिष्ट अलगाव के लिए एक तकनीक है और FACS दृष्टिकोण के लिए एक विकल्प प्रस्तुत करता है, क्योंकि यह FACS9के समय आवश्यकताओं के रूप में सीमा?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह कार्य निम्नलिखित अनुदानों द्वारा समर्थित था: F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (AM$), K08-DK106478 (KJW), और P30-DK050306 (Pilot grant kJW).
Materials
| 10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated | DWK Life Sciences (Wheaton) | 358007 | |
| Absolutely RNA Miniprep Kit | Agilent | 400800 | |
| Anti-GFP antibodies | Memorial Sloan-Kettering Antibody & Bioresource Core | GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7 | |
| Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Cycloheximide | Millipore Sigma | C7698 | |
| Deoxycholic acid, DOC | Millipore Sigma | D2510 | |
| D-Glucose, Dextrose | Fisher Scientific | D16 | |
| DL-Dithiothreitol | Millipore Sigma | D9779 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Thermo Fisher Scientific | 65602 | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| HEPES, 1M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific | Thermo Fisher Scientific | AAJ16924AE | |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Millipore Sigma | M8266 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | VV-83061-00 | |
| NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module | New England BioLabs | E7490S | |
| NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7530S | |
| Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630 | Millipore Sigma | I8896 | |
| Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated | Ambion | AM9932 | |
| Overhead Stirrer | DWK Life Sciences (Wheaton) | 903475 | |
| PBS Buffer (10x), pH 7.4 | Ambion | AM9625 | |
| Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated | Thermo Fisher Scientific | 29997 | |
| Potassium chloride, KCl | Millipore Sigma | P4504 | |
| RNA 6000 Pico Kit & Reagents | Agilent | 5067-1513 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitors | Promega | N2515 | |
| Sodium azide, NaN3 | Millipore Sigma | S2002 | |
| Sodium bicarbonate, NaHCO3 | Millipore Sigma | S6297 | |
| SUPERase·In RNase Inhibitor | Invitrogen | AM2694 | |
References
- Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).
- Lee, W. M. Etiologies of acute liver failure. Seminars in Liver Disease. 28 (2), 142-152 (2008).
- Sanyal, A. J., Yoon, S. K., Lencioni, R. The etiology of hepatocellular carcinoma and consequences for treatment. The Oncologist. 15 Suppl 4, 14-22 (2010).
- Jadlowiec, C. C., Taner, T. Liver transplantation: Current status and challenges. World Journal of Gastroenterology. 22 (18), 4438-4445 (2016).
- Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. Liver regeneration. Science. 276 (5309), 60-66 (1997).
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas. The American Journal of Pathology. 176 (1), 2-13 (2010).
- Grompe, M., et al. Loss of fumarylacetoacetate hydrolase is responsible for the neonatal hepatic dysfunction phenotype of lethal albino mice. Genes & Development. 7 (12A), 2298-2307 (1993).
- Wangensteen, K. J., et al. A facile method for somatic, lifelong manipulation of multiple genes in the mouse liver. Hepatology. 47 (5), 1714-1724 (2008).
- Wang, A. W., et al. TRAP-seq identifies cystine/glutamate antiporter as a driver of recovery from liver injury. The Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2297-2309 (2018).
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).
- Agilent Technologies. . Agilent RNA 6000 Pico: User Manual. , (2016).
- NEBNext. . NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina: User Manual. , (2018).
- NanoDrop. . 2000/2000c Spectrophotomerter: User Manual. , (2009).
- Liu, J., et al. Cell-specific translational profiling in acute kidney injury. The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1242-1254 (2014).
- Lu, S. C. Regulation of glutathione synthesis. Molecular Aspects of Medicine. 30 (1-2), 42-59 (2009).
- Wang, A. W., et al. The dynamic chromatin architecture of the regenerating liver. bioRxiv. , (2019).
- Zahm, A. M., et al. A high-content in vivo screen to identify microRNA epistasis in the repopulating mouse liver. bioRxiv. , (2019).
- Stork, C., Zheng, S. Genome-Wide Profiling of RNA-Protein Interactions Using CLIP-Seq. Methods in Molecular Biology. 1421, 137-151 (2016).
- Zhao, X., et al. Glutathione antioxidant pathway activity and reserve determine toxicity and specificity of the biliary toxin biliatresone in zebrafish. Hepatology. 64 (3), 894-907 (2016).
- Halpern, K. B., et al. Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver. Nature. 542 (7641), 352-356 (2017).
- Camp, J. G., et al. Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency. Nature. 546 (7659), 533-538 (2017).
- Wang, Y. J., Kaestner, K. H. Single-Cell RNA-Seq of the Pancreatic Islets–a Promise Not yet Fulfilled?. Cell Metabolism. 29 (3), 539-544 (2019).
