マウス肝臓における細胞型特異的遺伝子発現プロファイリング
Summary
リボソームアフィニティ精製(TRAP)の翻訳により、細胞型特異的翻訳mRNAの迅速かつ効率的な単離が可能になります。ここでは、肝再集団とTRAPのマウスモデルにおける流体力学的尾静脈注射を組み合わせた方法を示し、再入発性肝細胞の発現プロファイルを調べる。
Abstract
損傷後の肝臓の再集団は、環境毒素の暴露後の即時臓器不全および死亡を防ぐ哺乳類の重要な特徴である。再集団化中に起こる遺伝子発現の変化をより深く理解することは、傷害の設定における肝機能の回復を促進する治療標的の同定に役立つ可能性がある。それにもかかわらず、再入発性肝細胞を特異的に単離する方法は、細胞マーカーの欠如、限られた細胞数、およびこれらの細胞の脆弱性によって阻害される。肝臓損傷の設定で再集団を再キャパチングするFah-/-マウスモデルと連動したリボソームアフィニティ精製(TRAP)技術の開発により、再入生の遺伝子発現プロファイリングが可能肝 細胞。TRAPを使用すると、細胞型特異的翻訳mRNAは迅速かつ効率的に単離されます。緑色蛍光タンパク質(GFP)タグ付きリボソームタンパク質(RP)、GFP:RPL10Aを選択的に発現する肝細胞からのmRNAの翻訳を親和性ベースで単離したTRAPを利用する方法を開発した。TRAPは、遺伝子発現プロファイルを変化させる可能性のある蛍光活性化細胞選別に必要な長い期間を回避します。さらに、再入発性肝細胞のみがGFP:RPL10A融合タンパク質を発現するので、単離されたmRNAは、肝臓の周囲の負傷した肝細胞および他の細胞型からの汚染を欠いている。親和性精製mRNAは高品質であり、遺伝子発現の下流PCRまたはハイスループットシーケンシングベースの解析を可能にします。
Introduction
脊椎動物の主要な代謝器官として、肝臓はグルコース恒常性、血清タンパク質合成、胆汁酸分泌、および異生物代謝および解毒を担当しています。肝臓は、即時肝不全を防ぐために毒素にさらされた場合に負傷したパレンキマを再生する特別な能力を有する1.しかし、再生の失敗は、アセトアミノフェンまたはアルコール過剰摂取の設定で起こり、急性肝不全2を引き起こす可能性がある。さらに、ウイルス性肝炎感染、脂肪肝疾患、および脂肪肝炎によって引き起こされる慢性肝損傷は、肝線維症、肝硬変、および肝細胞癌3を引き起こす可能性がある。終末期肝疾患に対する唯一の利用可能な治癒治療は移植であるが、臓器不足によって制限され、すべての患者に対する効率的な治療を妨げる4.したがって、有毒な肝臓損傷後の回復過程のより良い理解は、病気の臓器の機能を救出するのに十分な再生を刺激する治療法の開発のために重要である。
肝臓再生の研究のための最も広く適用されたモデルシステムは、げっ歯類の部分肝切除術であり、肝臓の大部分が急速な肝細胞拡張を刺激するために切除される5。しかし、部分的肝切除術は、ヒト6における急性肝傷害の設定においてしばしば観察される免疫細胞浸潤および肝細胞壊死の欠如による有毒な肝損傷に続く肝細胞拡張を再発しない。臓器再生のこの形態をモデル化するより適切なシステムは、適切なチロシン代謝に必要な機能性フマリアルセトー酢酸ヒドロラーゼ(FAH)を欠き、死亡につながる重度の肝臓損傷を発症するFah-/-マウスである7。これらのマウスは、飲料水中の薬物ニティシネによる治療によって無期限に健康な状態に維持することができる。あるいは、FAH発現は、肝細胞のサブセットへのトランスジーン送達によって復元することができ、これはニティシノン除去8の際に肝臓を再設定するために拡大する。
再入発肝細胞の遺伝子発現変化をプロファイリングするためには、隣接する負傷した肝細胞および他の細胞型から汚染されることなく、Fah-/-マウス中の複製肝細胞を特異的に分離するツールが必要である。残念ながら、(1)肝細胞の再入発性の脆弱性は肝灌流後の回復不良につながり、(2)肝細胞の複製は大きさが大きく変動し、単離を行うため、肝細胞の蛍光補助細胞選別(FACS)は困難である。FACSによる純粋な集団の困難な、および(3)肝臓灌流からRNA単離までの手順時間が2時間を超えるため、遺伝子発現プロファイルは、サンプルが獲得される前に実質的な人工的な変化を受ける可能性がある9。
あるいは、肝細胞の再入発におけるエピトープタグ付きリボソームの発現は、臓器収穫直後の親和性精製を用いてリボソームに結合したmRNAをバルク肝臓で積極的に翻訳する迅速な単離を可能にする。組織は、ライサットします。ここでは、翻訳リボソームアフィニティ精製(TRAP)10に続いてハイスループットRNAシーケンシング(TRAP-seq)を行い、Fah-/–における肝細胞の再入発においてmRNAを特異的に分離およびプロファイルするプロトコルについて説明する。マウス9.FAHと緑色蛍光タンパク質タグ付きリボソームタンパク質(GFP:RPL10A)の共発現により、GFP:RPL10Aを含むポリソームに結合したmRNAの翻訳の親和性精製が可能になります。この方法は、肝細胞の再入発性に脆弱な再入発性を分離するために肝灌流などの細胞解離ステップを回避する。代わりに、臓器組織および抗体全体のリシスを利用して、標的細胞から特異的にRNAを迅速に抽出します。最後に、TRAP-seqを介した豊富で高品質なmRNAの単離により、シーケンシング解析などの下流アプリケーションを使用して、再集団化プロセス中の遺伝子発現の動的変化をプロファイリングすることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
TRAP-seqは、エピトープタグ付きリボソームを介してmRNAを翻訳する細胞タイプ特異的な単離のための技術であり、FACS9の時間要件などの制限を回避するFACSアプローチに代わるものを提示する。その代わりに、TRAPはバルク組織から直接RNAを迅速かつ効率的に単離できるため、遺伝子発現の変化を回避できます。TRAP-seqは、ニチシノンの除去後の肝細胞拡張が細胞自律性であり、?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、F31-DK113666 (AWW)、K01-DK102868 (AMZ)、K08-DK106478 (KJW)、および P30-DK050306 (KJW へのパイロット補助金) によってサポートされました。
Materials
| 10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated | DWK Life Sciences (Wheaton) | 358007 | |
| Absolutely RNA Miniprep Kit | Agilent | 400800 | |
| Anti-GFP antibodies | Memorial Sloan-Kettering Antibody & Bioresource Core | GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7 | |
| Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Cycloheximide | Millipore Sigma | C7698 | |
| Deoxycholic acid, DOC | Millipore Sigma | D2510 | |
| D-Glucose, Dextrose | Fisher Scientific | D16 | |
| DL-Dithiothreitol | Millipore Sigma | D9779 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Thermo Fisher Scientific | 65602 | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| HEPES, 1M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific | Thermo Fisher Scientific | AAJ16924AE | |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Millipore Sigma | M8266 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | VV-83061-00 | |
| NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module | New England BioLabs | E7490S | |
| NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7530S | |
| Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630 | Millipore Sigma | I8896 | |
| Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated | Ambion | AM9932 | |
| Overhead Stirrer | DWK Life Sciences (Wheaton) | 903475 | |
| PBS Buffer (10x), pH 7.4 | Ambion | AM9625 | |
| Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated | Thermo Fisher Scientific | 29997 | |
| Potassium chloride, KCl | Millipore Sigma | P4504 | |
| RNA 6000 Pico Kit & Reagents | Agilent | 5067-1513 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitors | Promega | N2515 | |
| Sodium azide, NaN3 | Millipore Sigma | S2002 | |
| Sodium bicarbonate, NaHCO3 | Millipore Sigma | S6297 | |
| SUPERase·In RNase Inhibitor | Invitrogen | AM2694 | |
References
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