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Biology

Profiling dell'espressione genica specifica del tipo di cella nel fegato del mouse

Published: September 17, 2019 doi: 10.3791/60242

Summary

La traduzione della purificazione dell'affinità dei ribosomi (TRAP) consente un isolamento rapido ed efficiente dell'mRNA di traslazione specifico del tipo di cellula. Qui, dimostriamo un metodo che combina l'iniezione idrodinamica della vena della coda in un modello murino di ripopolamento e del trap per esaminare il profilo di espressione degli epatociti ripopolamento.

Abstract

Il ripopolamento del fegato dopo lesioni è una caratteristica cruciale dei mammiferi che previene l'insufficienza e la morte immediata degli organi dopo l'esposizione di tossine ambientali. Una comprensione più approfondita dei cambiamenti nell'espressione genica che si verificano durante il ripopolamento potrebbe aiutare a identificare gli obiettivi terapeutici per promuovere il ripristino della funzione epatica in caso di lesioni. Ciò nonostante, i metodi per isolare specificamente gli epatociti ripopolati sono inibiti dalla mancanza di marcatori cellulari, da un numero limitato di cellule e dalla fragilità di queste cellule. Lo sviluppo della tecnologia trap (Rato) di traduzione della purificazione dell'affinità riboscanda (TRAP) in combinazione con il modello murino Fah-/- per ricapitolare il ripopolamento del ripopolamento nell'impostazione delle lesioni epatiche consente la profilazione genica del ripopolamento Epatociti. Con trap, l'mRNA di traduttura specifico del tipo di cellula è isolato rapidamente ed efficacemente. Abbiamo sviluppato un metodo che utilizza trap con isolamento basato sull'affinità di traduzione di mRNA da epatociti che esprimono selettivamente la proteina ribosomica marcata GFP (GFP) (RP), GFP:RPL10A. TRAP aggira il lungo periodo di tempo necessario per lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza che potrebbe cambiare il profilo dell'espressione genica. Inoltre, poiché solo gli epatociti che ripopolano esprimono la proteina di fusione GFP:RPL10A, l'mRNA isolato è privo di contaminazione dagli epatociti feriti circostanti e da altri tipi di cellule nel fegato. L'mRNA purificato dall'affinità è di alta qualità e consente l'analisi pcR o ad alta velocità pcR o ad alta velocità dell'espressione genica.

Introduction

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Come principale organo metabolico nei vertebrati, il fegato è responsabile dell'omeostasi del glucosio, sintesi proteica del siero, secrezione dell'acido biliare e metabolismo xenobiotico e disintossicazione. Il fegato possiede una straordinaria capacità di rigenerare il parenchyma ferito dopo l'esposizione alle tossine per prevenire l'insufficienza epatica immediata1. Tuttavia, il fallimento della rigenerazione può verificarsi nella cornice di acetaminofene o consumo eccessivo di alcol, che può portare a insufficienza epatica acuta2. Inoltre, lesioni epatiche croniche causate da infezione da epatite virale, malattia del fegato grasso, e steatoepatite può causare fibrosi epatica, cirrosi, e carcinoma epatocellulare3. L'unico trattamento curativo disponibile per la malattia epatica in fase avanzata è il trapianto, ma è limitato dalla carenza di organi, prevenendo un trattamento efficiente per tutti i pazienti4. Una migliore comprensione del processo di recupero dopo lesioni epatiche tossiche è quindi cruciale per lo sviluppo di trattamenti per stimolare la rigenerazione sufficiente per salvare la funzione nell'organo malato.

Il sistema modello più ampiamente applicato per lo studio della rigenerazione del fegato è l'epatectomia parziale nei roditori, in cui una grande percentuale del fegato viene reseguita per stimolare una rapida espansione dell'epatocito5. Tuttavia, l'epatectomia parziale non ricapitola l'espansione dell'epatocite a seguito di lesioni epatiche tossiche a causa della mancanza di infiltrazione delle cellule immunitarie e necrosi delle cellule epatocitiche spesso osservata nell'impostazione di lesioni epatiche acute negli esseri umani6. Un sistema più adatto per modellare questa forma di rinnovamento dell'organo è il fah-/- mouse, che manca di idrolasi funzionale ylacetoacetate (FAH) necessaria per il corretto metabolismo della tirosina e sviluppa gravi danni al fegato che portano alla morte7. Questi topi possono essere mantenuti in uno stato sano a tempo indeterminato dal trattamento con il farmaco nitisinone nell'acqua potabile. In alternativa, l'espressione FAH può essere ripristinata con la consegna transgene a un sottoinsieme di epatociti, che si espanderà per ripopolare il fegato al momento della rimozione del nidino8.

Per profilare i cambiamenti di espressione genica del ripopolamento degli epatociti, è necessario uno strumento per isolare specificamente gli epatociti nel topo Fah-/- senza contaminazione da epatociti feriti vicini e altri tipi di cellule. Purtroppo, lo smistamento delle cellule assistite dalla fluorescenza (FACS) degli epatociti è difficile poiché (1) la fragilità del ripopolamento degli epatociti porta a un recupero inadeguato dopo la perfusione epatica, (2) replicando gli epatociti sono di dimensioni altamente variabili, rendendo l'isolamento di una popolazione pura da FACS difficile, e (3) il tempo di procedura dalla perfusione epatica all'isolamento dell'RNA è maggiore di 2 h, quindi i profili di espressione genica possono subire sostanziali modifiche artificiali prima dell'acquisizione dei campioni9.

In alternativa, l'espressione di ribosomi con etichettatura epitope specificamente nel ripopolamento degli epatociti consente il rapido isolamento della traduzione attiva dell'mRNA legato dai ribosomi utilizzando la purificazione dell'affinità subito dopo la raccolta dell'organo, con fegato sfuso listi tistali. Qui, descriviamo un protocollo per eseguire la purificazione dell'affinità trasbora-ribosomica (TRAP)10 seguito dal sequenziamento dell'RNA ad alto rendimento (TRAP-seq), per isolare e profilare specificamente l'mRNA nel ripopolamento degli epatociti nel Fah-/- mouse9. La coespressione della proteina ribossomica marcata proteica fluorescente verde (GFP:RPL10A) con FAH consente la purificazione dell'affinità dell'mRNA traducivo vincolato da polinomi contenenti GFP:RPL10A. Questo metodo evita qualsiasi fase di dissociazione cellulare, come la perfusione epatica per isolare epatiti epopultanti fragili. Invece, utilizza la lisi di tessuto intero dell'organo e anticorpi per estrarre rapidamente l'RNA specificamente dalle cellule bersaglio. Infine, l'isolamento di un abbondante mRNA di alta qualità tramite TRAP-seq consente ad applicazioni a valle come l'analisi del sequenziamento di profilare il cambiamento dinamico dell'espressione genica durante il processo di ripopolamento.

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Protocol

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Tutti i metodi che prevedono l'uso di topi sono coerenti con le linee guida fornite dall'IACUC dell'Ufficio Penn per il Benessere degli Animali dell'Università della Pennsylvania.

1. Preparazione del reagente

  1. Ciclolosmide
    1. Per fare 500 l of 0,1 g/mL ciclossimide, sospendere 50 mg di ciclossimide in 500 - L di metanolo.
      ATTENZIONE: La ciclologimide è estremamente tossica per l'ambiente e può causare malformazioni congenite. Tutti i rifiuti e le tamponamenti contenenti cicloseximide devono essere raccolti per un corretto smaltimento.
      NOT: La cicloxessimide può essere immagazzinata a 4 gradi centigradi per un massimo di 1 giorno. La cicloxeximide inibisce la traduzione.
  2. Dithiothreitol (DTT)
    1. Per fare 1 mL di 1 M DTT, sospendere 0,15 g di polvere DTT in acqua senza RNase.
      ATTENZIONE: DTT può causare irritazione alla pelle, occhio, e tratto respiratorio.
      NOT: DTT è un detergente. Il DTT può essere immagazzinato a -20 gradi centigradi. Si consiglia di conservare 1 M DTT in aliquote monouso di 50.L.
  3. Deoxycolato (DOC)
    1. Per fare il 10% di DOC, sospendere 1 g di DOC in un tubo conico da 50 ml e aggiungere acqua senza RNase fino a 10 mL. Agitare vigorosamente fino a quando la polvere non si dissolva.
      NOT: La soluzione DOC del 10% è leggermente gialla e può essere conservata a temperatura ambiente (RT) fino a 1 anno. Il DOC viene utilizzato per la lisi nucleare.
  4. Anticorpi GFP
    1. Anticorpi GFP aliquoti quando si utilizza per la prima volta. Snap congelare le aliquote e conservare a -80 gradi centigradi.
      NOT: Si raccomanda di conservare 50 g di anticorpi GFP in aliquote monouso.
  5. Proteina biomutata B L
    1. Risospendere la proteina biomutata L in 1x salina tamponata da fosfato (PBS) per rendere la concentrazione finale di 1 g/l.
      NOT: La soluzione di sospensione può essere conservata a -20 gradi centigradi per un massimo di 6 mesi.

2. Preparazione del buffer

  1. Buffer per albumina di siero bovina (BSA)
    1. Per fare 50 mL di 3% BSA buffer, aggiungere 1,5 g di IgG- e protease-free bsA polvere in 40 mL di PBS seguita da vortice. Dopo la dissolvimento della BSA, aggiungere PBS a un volume finale di 50 mL.
      NOT: Il tampone BSA può essere conservato a 4 gradi centigradi per un massimo di sei mesi.
  2. Buffer di dissezione
    1. Per fare 50 mL di riserva di dissezione, combinare 5 mL di 10x soluzione di sale equilibrato di Hank (HBSS), 125 l l di 1 M 4-(2-idxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), 1.750 l of 1 M di glucosio, e 200 L di 1 M NaHCO3 . Aggiungere acqua senza RNase a un volume finale di 50 mL.
      NOT: Lo stock di tampone di dissezione può essere immagazzinato a 4 gradi centigradi per un massimo di sei mesi.
    2. Immediatamente prima dell'uso, aggiungere 100 g/mL di 0,1 g/mL di cicloseximide e tenere sul ghiaccio.
  3. Buffer ad alto sale
    1. Per fare 50 mL di brodo da tampone ad alto sale, aggiungere 1 mL di 1 M HEPES, 8,75 mL di 2 M KCl, 500 L di 1 M MgCl2e 500 L del 100% di glicole di polietilene non tietilene (Tabella dei materiali) all'acqua senza RNase.
      NOT: Lo stock da tampone ad alto sale può essere immagazzinato a 4 gradi centigradi per un massimo di sei mesi.
    2. Immediatamente prima dell'uso, aggiungere 0,5 g/mL di 1 M DTT e 1 l/mL di 0,1 g/mL di cicloseximide. Mantenere il tamponi fresco di sale alto sul ghiaccio.
  4. Buffer a basso contenuto di sale
    1. Per fare 50 mL di brodo da riserva a basso sale, aggiungere 1 mL di 1 M HEPES, 3,75 mL di 2 M KCl, 500 L di 1 M MgCl2e 500 L del 100% di glietilene di polietilene non ylfenile a 44,25 Ml di acqua senza RNase.
      NOT: Lo stock tampone a basso contenuto di sale può essere immagazzinato a 4 gradi centigradi per un massimo di sei mesi.
    2. Aggiungete 0,5 l/mL di 1 M DTT e 1 l/mL di 0,1 g/mL di cicloseximide prima dell'uso. Mantenere il tamponi fresco a basso contenuto di sale sul ghiaccio.
  5. Buffer di lisi dei tessuti
    1. Per fare 50 mL di brodo buffer di lisi visi, combinare 1 mL di 1 M HEPES, 3,75 mL di 2 M KCl, e 500 L di 1 M MgCl2. Aggiungere acqua senza RNase a una finale di 50 mL.
      NOT: Lo stock di tampone di dissezione può essere immagazzinato a 4 gradi centigradi per un massimo di sei mesi.
    2. Aggiungete 1 compressa/10 mL di inibitore della proteasi senza EDTA, 1 luna/mL di 0,1 g/mL di cicloseximide, 10 l/mL di inibitori di RNase ogni immediatamente prima dell'uso. Mantenere il tendopo la lisi del tessuto fresco sul ghiaccio.

3. Coniugazione di anticorpi a perline magnetiche

  1. Anticorpi
    1. Calcolare la quantità di anticorpi GFP necessari per tutti i campioni e prepararsi per un campione in più.
      NOT: Per ogni campione, sono necessari 50 g di ogni anticorpo GFP.
    2. Gli anticorpi Scongelo GFP su ghiaccio e spin alla massima velocità (>13,000 x g) per 10 min a 4 gradi centigradi e trasferiscono i supernatanti in un nuovo tubo di microcentrifuga.
      NOT: La fase di preparazione degli anticorpi può essere eseguita prima della preparazione del tallone e gli anticorpi scongelati possono essere mantenuti sul ghiaccio. In alternativa, questa parte può essere eseguita durante l'incubazione del tallone magnetico e della proteina biotinylata L.
  2. Risospendere perline magnetiche
    1. Risospendere perline magnetiche (Tabella dei materiali) con tubi delicati.
    2. Per ogni campione, utilizzare 150 lofdi di perline magnetiche. Calcolare il volume di perline magnetico richiesto per tutti i campioni e preparare un extra. Trasferire le perline magnetiche risospese in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL o 2 mL. Se per un esperimento è necessario più di 1 mL, dividere l'importo totale in volumi uguali.
    3. Raccogliere perline su un supporto magnetico per >1 min e rimuovere il supernatante. Rimuovere il tubo di microcentrifuga dal supporto magnetico e aggiungere 1 mL di PBS seguito da tubazioni su e giù per lavare le perline. Raccogliere perline su un supporto magnetico per >1 min e rimuovere PBS.
  3. Preparazione di perline rivestite a L
    1. Per ogni campione, utilizzare 60 l di proteina biotinylata L. Se la proteina L viene precedentemente risospesa e immagazzinata a -20 gradi centigradi, scongelare la proteina L sul ghiaccio. Se la proteina L viene risospesa prima dell'uso, prendere la quantità necessaria per tutti i campioni e prepararne uno in più.
    2. Aggiungere il volume calcolato della proteina biotinylata L alle perle magnetiche risospese e lavate. Aggiungere 1x PBS per fare il volume finale 1 mL se si utilizza un tubo di microcentrismo da 1,5 ml, o 1,5 mL se si utilizza un tubo di microcentrifuga da 2 mL. Incubare perline magnetiche con proteina biotinylata L per 35 min a RT su un rotatore tubo.
      NOT: Gli anticorpi possono essere preparati in questa fase mentre le perline sono incubazioni con proteina Biotinylaleggi.
    3. Raccogliere proteine L rivestito perline su un supporto magnetico per >1 min e rimuovere il supernatante. Rimuovere il tubo di microcentrifuga dal supporto magnetico e aggiungere 1 mL di 3% tampone BSA seguito da tuboggio delicato per almeno 5 volte per lavare le perline rivestite a L.
    4. Raccogliere perline rivestite su un supporto magnetico per >1 min e rimuovere il supernatante. Ripetere i passaggi di lavaggio con 3% BSA per altre 4 volte (per un totale di 5 volte).
  4. Rilegatura anticorpale
    1. Aggiungere la quantità calcolata di anticorpi GFP nelle perline rivestite a L proteina e incubare per 1 h a 4 gradi centigradi su un rotatore tubo.
      NOT: Dopo l'incubazione degli anticorpi, prestare particolare attenzione a non vortice la matrice di affinità.
    2. Durante l'incubazione, preparare il buffer a basso contenuto di sale calcolando il volume totale richiesto per tutti i campioni e aggiungere 0,5 l/mL di 1 M DTT e 1 l/mL da 0,1 g/mL di ciclico a scorte di tamponamento a basso contenuto di sale prima dell'uso.
      NOTA: sono necessari 3 mL di tampone a basso contenuto di sale per il lavaggio di ciascun tubo di perline coniugate TFG e sono necessari 200 l/campione per la risospensione delle perline coniugate GFP. Il tampone fresco a basso contenuto di sale può essere conservato sul ghiaccio per un paio d'ore.
    3. Raccogliere la matrice di affinità su un supporto magnetico per >1 min e rimuovere il supernatante. Aggiungere 1 mL di tampone a basso contenuto di sale e pipetta retritare delicatamente su e giù per lavare la matrice di affinità. Raccogliere la matrice di affinità su un supporto magnetico per >1 min e rimuovere buffer a basso contenuto di sale. Ripetere i passaggi di lavaggio con tampone a basso contenuto di sale per altre 2 volte (per un totale di 3 volte).
    4. Risospendere le perline nel buffer a basso sale in modo che ogni campione abbia 200 - L di matrice di affinità.
      NOT: La matrice di affinità può essere memorizzata in 0.02% NaN3 a 4 gradi centigradi per un massimo di 2 settimane. La matrice di affinità deve essere rapidamente lavata nel buffer a basso contenuto di sale 3 volte e risospesa delicatamente su un rotatore tubo levante a 4 gradi centigradi per almeno 10 min se la matrice di affinità viene preparata entro 1 settimana o durante la notte se la matrice di affinità viene conservata per più di 1 settimana. Il protocollo può essere sospeso dopo questo passaggio.
      ATTENZIONE: L'azide di sodio è estremamente tossico per l'ambiente. Il contatto con gli acidi produce gas tossici. Tutti i rifiuti devono essere raccolti per un corretto smaltimento.

4. Lisi di tessuto del fegato

  1. Preparazione del buffer e configurazione dell'apparecchiatura
    1. Calcolare il numero di tubi di microcentrismo necessari, etichettare e raffreddare sul ghiaccio.
      NOT: Di solito, sette tubi di microcentrifuga da 1,5 ml sono necessari per ogni campione: 1 per il fegato sezionato rimanente, 4 per 4 mL di lisato epatico omogeneizzato e 2 per il trasferimento di supernatanti.
    2. Preparare il buffer di dissezione fresco calcolando il volume totale richiesto per tutti i campioni e aggiungere 1 l/mL di 0,1 g/mL di cicloseximide. Posizionare il cuscinetto di dissezione fresco sul ghiaccio per mantenere freddo durante l'esperimento.
      NOT: Per ogni campione, sono necessari 10 mL di buffer di dissezione.
    3. Preparare il buffer di lisi fresco calcolando il volume totale richiesto per tutti i campioni e aggiungere 1 compressa/10 mL di inibitore della proteasi senza EDTA, 1 l/mL di 0,1 g/mL di cicloseximide e 10 l/mL di inibitori di RNase ciascuno. Mantenere il tampone di lisi sul ghiaccio durante l'esperimento.
      NOT: Per ogni campione, sono necessari 4 mL di buffer di lisi.
    4. Impostare la smerigliatrice tissutale (Tabella dei materiali) in modo che i tubi di vetro in politetrafluoroetilene (PTFE) possano essere posizionati sul ghiaccio durante l'omogeneizzazione dei pezzi di fegato. Mettere 4 mL di tampone di lisi fredda nei tubi di vetro PTFE.
  2. Ripopolare l'omogeneizzazione del fegato
    1. Eutanasia un topo Fah-/- di 8-12 settimane iniettato con il vettore TRAP e ripopolato per 1-4 settimane con anestesia e lussazione cervicale secondo le linee guida sperimentali sugli animali approvate.
    2. Posizionare il mouse su una scheda di dissezione e spruzzare l'addome con 70% di etanolo. Tendare la pelle e il peritoneo basso nell'addome utilizzando pinze e utilizzare le forbici per fare un'incisione trasversale. Continuare a tagliare con le forbici per fare un ampio lembo peritoneale a forma di U, con la cura di non tagliare le viscere. Capovolgere il lembo peritoneale sullo sterno per esporre il fegato.
    3. Rimuovere con attenzione il fegato con forbici fini e pinze e posizionare rapidamente il tessuto nel tampone di dissezione freddo per risciacquare. Per omogeneizzare i tessuti congelati, spostare rapidamente la quantità desiderata di tessuto epatico in tubi di vetro PTFE con tampone di lisi fredda senza scongelare il tessuto.
      NOT: Il tessuto sezionato può essere congelato in flash e conservato a -80 gradi centigradi dopo essere stato lavato con buffer di dissezione. Il protocollo può essere sospeso dopo questo passaggio.
    4. Pesare il fegato su un piatto petri e isolare 200-500 mg di pezzi di fegato e spostarsi nei tubi di vetro PTFE. Collocare il tessuto epatico rimanente in un tubo di microcentrifuga preraffreddato e congelare il flash.
    5. Omogeneizzare i campioni in un omogeneizzatore a motore a partire da 300 rpm per dissociare gli epatociti dalla struttura epatica per almeno 5 colpi. Abbassare il tubo di vetro ogni volta, ma fare attenzione a non lasciare che il pestello salire al di sopra della soluzione per prevenire l'aerazione che potrebbe causare la denaturazione delle proteine.
    6. Aumentare la velocità a 900 rpm per omogeneizzare completamente i tessuti epatici per almeno 12 colpi completi.
    7. Trasferire il lisato nei tubi etichettati e pre-raffreddati, con non più di 1 mL di lisaper tubi microcentrici da 1,5 ml. Se si utilizzano 4 mL di tampone di lisi, tenere 1 tubo e congelare i restanti 3 tubi.
      NOT: Le lisati possono essere tenute sul ghiaccio fino a 1 h mentre sezionano l'animale successivo e preparano lisati freschi. Il fegato omogeneizzato può essere congelato flash dopo la fase di lisi e conservato a -80 gradi centigradi. Ci potrebbe essere una diminuzione del 50% dell'RNA isolato se si utilizzano lisamenti congelati. Il protocollo può essere sospeso dopo questo passaggio.
  3. Lisi nucleare
    1. Centrifugare il lisato del fegato a 2.000 x g a 4 gradi centigradi per 10 min e trasferire il supernatore in un nuovo tubo di microcentrifuga precillato sul ghiaccio.
    2. Aggiungere 1/9 del volume supernatante del 10% di glicole di polietilene nonilfenile per rendere la concentrazione finale 1% glietilene nonilfenilee e mescolare invertendo delicatamente i tubi di microcentrifuga.
    3. Ruotare rapidamente verso il basso i tubi di microcentrifuga e aggiungere 1/9 del volume del campione di 10% DOC per rendere la concentrazione finale 1% DOC e mescolare invertendo delicatamente i tubi di microcentrifuga. Girare rapidamente verso il basso i tubi di microcentrifuga e incubare sul ghiaccio per 5 min.
    4. Centrifugare il lisato nucleare a 20.000 x g a 4 gradi centigradi per 10 min e trasferire il supernatante in un nuovo tubo di microcentrifuga prefreddo sul ghiaccio.
      NOT: Il supernatante impoverito di mitocondri può essere messo sul ghiaccio per un paio d'ore mentre i campioni rimanenti vengono raccolti.

5. Immunoprecipitazioni

  1. Per ogni tubo, estrarre l'1% del volume totale del supernatale come controllo pre-immunoprecipitaziona per confrontare l'arricchimento bersaglio dopo l'incubazione con la matrice di affinità. Posizionare i controlli pre-immunoprecipitazioni su un rotatore tubolare a 4 gradi durante la notte, allo stesso modo dei campioni immunoprecipitati vengono elaborati.
  2. Aggiungere 200 l di matrice di affinità ad ogni campione. Prestare particolare attenzione a rispendere le perline con pipettaggio delicato prima di aggiungere la matrice di affinità per ogni campione. Incubare i lisati con matrice di affinità a 4 gradi durante la notte con una leggera miscelazione su un rotatore tubo.
    NOT: Il protocollo può essere sospeso fino a un giorno dopo questo passaggio.

6. Isolamento dell'RNA

  1. Preparazione del buffer e configurazione dell'apparecchiatura
    1. Posizionare il rack magnetico a 4 gradi centigradi per almeno 30 min per pre-raffreddare e mantenere il rack sul ghiaccio per tutta la durata dell'esperimento.
    2. Calcolare il numero di tubi di microcentrismo necessari e pre-freddo sul ghiaccio o a 4 gradi centigradi.
      NOT: Di solito, ogni campione richiede 1 tubo di microcentrifuga per l'RNA purificata finale.
    3. Ruotare rapidamente i tubi dal punto 5.2 e raccogliere le perline posizionando sul rack magnetico per almeno 1 min. Raccogliere o scartare il supernatante in ulteriori tubi di microcentrifuga.
      NOT: Il supernatante raccolto che contiene una frazione non legata può essere congelato in flash e conservato a -80 gradi centigradi per confrontarlo con la frazione legata per l'arricchimento della trascrizione dopo la purificazione. Il protocollo può essere sospeso dopo questo passaggio.
    4. Preparare il buffer ad alto sale aggiungendo 0,5 valori l/mL di 1 M DTT e 1 l/mL di 0,1 g/mL di cicloseximide al buffer di riserva ad alto sale.
      NOT: Per ogni campione sono necessari 5 mL di tampone di sale alto.
  2. Isolamento dell'RNA
    1. Aggiungere 1 mL di cuscinetto fresco ad alto sale ad ogni tubo seguito da pipettaggio delicato per almeno 5 volte senza introdurre bolle.
      NOT: Un lavaggio insufficiente potrebbe introdurre sfondi di trascrizioni non legate, mentre l'introduzione di bolle potrebbe accelerare la degradazione dell'RNA.
    2. Raccogliere perline su un supporto magnetico per >1 min e rimuovere il supernatante. Ripetere i passaggi di lavaggio con buffer ad alto sale per altre 4 volte (per un totale di 5 volte).
    3. Rimuovere il buffer ad alto sale rimanente e rimuovere i tubi di microcentrifuga dal supporto magnetico e mettere a RT per 5 minuti per riscaldarsi.
    4. Risospendere le perline in 100 gradi L di tampone di lisi (fornito nel kit di isolamento dell'RNA) con il mercaptoetanolo.
      NOT: Qualsiasi kit di isolamento e purificazione dell'RNA che contiene il tiocyanato di guanidina denaturalista può essere utilizzato come buffer di lisi per rilasciare l'RNA legato dalla matrice di affinità. L'estrazione dell'RNA deve essere trattata a RT poiché il tiocianato di guanidina può cristallizzarsi a basse temperature.
    5. Vorticare le perline e buffer per almeno 5 s alla massima velocità, ruotare rapidamente verso il basso per raccogliere il buffer sul lato del tubo di microcentrifuga e incubare le perline con il buffer a RT per 10 min per rilasciare l'RNA legato al tallone nel buffer di lisi.
    6. Raccogliere perline su un supporto magnetico per >1 min e raccogliere il supernatante per procedere immediatamente alla pulizia dell'RNA secondo il protocollo di purificazione dell'RNA come specificato nel kit (Tabella dei materiali).
      NOT: Il supernatante contenente l'RNA eluito nel tampone di lisi può anche essere conservato a -80 gradi centigradi per un massimo di 1 mese prima della pulizia riscaldandosi a RT al momento dello scongelamento.
    7. Per ottenere la massima qualità dell'RNA isolato, eseguire tutte le fasi facoltative, tra cui la digestione di DNase e tutte le fasi di eluizione dell'RNA. Riscaldare il buffer di eluizione fornito dal kit di isolamento dell'RNA o dall'acqua senza RNase a 60 gradi centigradi per il massimo recupero dell'RNA.
      NOT: L'RNA isolato può essere conservato a -20 gradi centigradi per un massimo di 1 mese o -80 gradi centigradi per diversi anni. Il protocollo può essere sospeso dopo questo passaggio.

7. Analisi opzionale della qualità dell'RNA (consigliato)

  1. Valutare la qualità dell'RNA utilizzando un bio/analizzatore11 e la quantità con uno spettrofotometro12 per determinare se ripetere il processo di immunoprecipitazioni è necessario per ottenere un RNA ampio e di alta qualità.
    NOT: La qualità ottimale dell'RNA per il sequenziamento ad alto contenuto di velocità effettiva deve seguire i protocolli specificati dai kit di preparazione della libreria e dalle piattaforme di sequenziamento.

8. Applicazioni a valle

NOT: L'RNA totale isolato dal protocollo TRAP può essere utilizzato in una serie di applicazioni standard a valle, tra cui RNA-seq (TRAP-seq). Anche la trascrizione inversa standard e i protocolli PCR quantitativi possono essere utilizzati seguendo TRAP.

  1. Per TRAP-seq, eseguire la preparazione della libreria RNA-seq secondo i metodi standard13.
  2. Per l'RNA-seq, preparare le librerie di sequenziamento cDNA utilizzando kit commerciali RNA-seq con arricchimento basato su oligo d(T) di trascrizioni poliadenilate (A). In alternativa, se la qualità totale dell'RNA è inferiore a quella raccomandata per l'arricchimento di poli(A), utilizzare moduli di esaurimento rRNA. Tuttavia, aspettatevi di vedere più allineamento rRNA dopo il sequenziamento.

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Representative Results

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Per profilare l'espressione genica nel ripopolamento degli epatociti del topo Fah-/-, la fusione Gfp:Rpl10a e le transgenie Fah sono co-consegnate all'interno di un plasmide contenente trasposoni8 (vettore TRAP) ai fegati iniezione idrodinamica (Figura 1A). La rimozione del nitisinone induce una lesione epatica tossica che crea una pressione di selezione per gli epatociti che esprimono stabilmente FAH per ripopolare il parenchyma ferito9. L'attenuazione dell'immunofluorescenza conferma la co-espressione della FAH e della proteina di fusione GFP:RPL10A nel ripopolamento degli epatociti dopo due settimane di ripopolamento epatico (Figura 1B).

Nel seguente esperimento rappresentativo, TRAP-seq è stato eseguito utilizzando epatociti di topo quiescenti e ripopolpati. In primo luogo, per ottenere ribosomi etichettati GFP da epatociti quiescenti, i topi transgenici RosaLSL-GFP-L10A sono stati iniettati con AAV8-TBG-Cre 7 giorni prima del sacrificio per indurre l'espressione GFP:RPL10A in tutti gli epatociti14. Abbiamo anche elaborato un campione di fegato raccolto da un topo di tipo selvatico come controllo negativo per garantire che l'isolamento della traduzione dell'mRNA fosse specifico, il che significa che l'RNA poteva essere estratto solo dai topi che esprimevano GFP:RPL10A. La concentrazione di RNA isolato era correlata al numero di cellule che esprimevano la proteina di fusione, con il campione quiescente che produce la resa più elevata poiché tutti gli epatociti esprimono GFP:RPL10A dopo l'iniezione di AAV8-TBG-Cre (Figura 2A). Al contrario, quasi nessun RNA era rilevabile nei controlli di tipo selvaggio che non avevano il transgene GFP:RPL10A, indicando che la procedura TRAP è altamente specifica e ha uno sfondo basso. Quando il TRAP è stato utilizzato sul tessuto epatico sottoposto a ripopolamento con GFP:RPL10A-traslazione epatcicita, abbondante, RNA di alta qualità è stato ottenuto (Figura 2B). Al contrario, nessuna traccia di RNA è stata rilevata tramite bioanalizzatore per il campione di controllo negativo.

L'analisi dell'espressione genica a valle può essere effettuata tramite la trascrizione inversa e la PCR quantitativa o l'RNA-seq sull'RNA isolato dal TRAP. Gsta1 codifica glutathione S-transferase che svolge un ruolo importante per il metabolismo del glutathione, il principale peptide disintossicante per proteggere il fegato dai danni da stress ossidativo15. L'espressione Gsta1 è indotta da oltre 10 volte nel ripopolamento degli epatociti rispetto agli epatociti quiescenti, mentre non è stato rilevato alcun valore del ciclo di soglia (Ct) con RNA isolato TRAP dal topo di tipo selvaggio a causa della mancanza di RNA di input (Figura 3 A). Si noti che la qualità dell'RNA può avere un notevole impatto sull'analisi dell'espressione genica. Nel caso di esperimenti RNA-seq, la valutazione della qualità dell'RNA deve essere eseguita in base alle raccomandazioni del kit di preparazione della libreria e della piattaforma di sequenziamento (Figura 3B). Un bioanalyzer viene spesso utilizzato per determinare il numero di integrità dell'RNA (RIN), con un alto RIN correlato con un più alto tasso di allineamenti mRNA al genoma (Figura 3B, a sinistra), mentre un RIN inferiore che porta ad un più alto tasso di letture ribosomiche, indicando un tasso inferiore di letture ribosomiche, indicando un tasso inferiore di letture ribosomiche, indicando un rIN più basso che porta a un più alto tasso di letture ribosomiche, indicando un tasso inferiore di letture ribosomiche, indicando un tasso inferiore di letture ribosomiche, degradazione dell'mRNA (Figura 3B, a destra). Figura 3 C,D dimostra che trap-seq può identificare l'espressione genica differenziale negli epaticiti quiescenti e ripopolati. Per esempio, Espressione di Alb è inibito e L'espressione di Afp è upregulated durante il ripopolamento del fegato, riflettendo che gli epatociti replicanti assumono uno stato meno differenziato per inibire le funzioni metaboliche durante ripopolamento9,16.

Figure 1
Figura 1: Implementazione del TRAP con Fah-/- per profilare il cambiamento dell'espressione genica degli epopulati epatociti. (A) Schematico di espressione della proteina di fusione GFP:RPL10A con FAH nel sistema di trasposoni Sleeping Beauty seguito da iniezione nel topo Fah-/-. Gli esagoni verdi indicano il ripopolamento degli epatociti con espressione stabile di FAH e GFP:RPL10A, mentre gli esagoni neri rappresentano feriti, morenti epatociti. (B) La colorazione immunofluorescenza rappresentativa dimostra la coespressione della proteina ribosomica etichettata TMF L10A (verde) e della FAH (rossa) negli epatociti ripopolanti. Barra di scala : 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: TRAP consente l'isolamento specifico del tipo di cellula dell'RNA di alta qualità. (A) La resa dell'RNA è positivamente correlata al numero di epatociti che esprimono GFP:RPL10A. Il basso rendimento dell'RNA da un topo di tipo selvaggio dimostra la specificità del TRAP da fonti senza l'espressione di GFP:RPL10A. (B) Le tracce bioanalizzatri dell'RNA totale isolato dal ripopolamento dei fegati che esprimono GFP:RPL10A e da fegati di tipo selvatico dimostrano la specificità del TRAP. L'RNA totale isolato dal tessuto epatico di tipo selvatico privo di transgene GFP:RPL10A mostra che è stata raccolta un RNA minimo, mentre il tessuto che esprime transgeni fornisce un ampio RNA di alta qualità. Si noti che i picchi di RNA ribosomico sono presenti dopo il successo TRAP10. FU, unità di fluorescenza. RIN, numero di integrità dell'RNA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: L'RNA isolato da TRAP può essere utilizzato per l'analisi dell'espressione genica a valle. (A) Trascrizione inversa rappresentativa e risultati quantitativi di PCR di Gsta1 in quiescenti e ripopolati epatociti. Non è stato rilevato alcun valore Ct con RNA isolato da animali selvatici di tipo. (B) Analisi di allineamento dell'RNA isolato dopo il sequenziamento ad alto contenuto di velocità, dimostrando l'importanza di determinare l'integrità dell'RNA dopo l'isolamento. L'RNA di alta qualità produce una percentuale più alta di letture di mRNA (verde), mentre l'RNA di bassa qualità porta ad una percentuale molto più alta di letture di ribosome (rosso), poiché la maggior parte degli mRNA è degradata. RIN, numero di integrità dell'RNA. (C,D) Tracce integrative di Genomics Viewer (IGV) di letture RNA-seq di affinità mRNA purificate da epatociti quiescenti e ripopolati al (C) Alb e (D) Afp loci. Si noti che la distorsione di lettura 3' è tipica di una pipeline di selezione poli(A). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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IL TRAP-seq è una tecnica per l'isolamento specifico del tipo di cellula della traduzione dell'mRNA tramite ribosomi con tag epipito e presenta un'alternativa agli approcci FACS, in quanto elude limitazioni come i requisiti di tempo di FACS9. Invece, TRAP consente un rapido ed efficiente isolamento dell'RNA direttamente dai tessuti sfusi, contribuendo a evitare qualsiasi alterazione nell'espressione genica. TRAP-seq è particolarmente adatto per l'uso nel ripopolante fegato di topo Fah-/-, poiché l'espansione degli epatociti dopo la rimozione del nitratoone è autonoma rispetto alle cellule e consente la profilazione dell'espressione genica del sottoinsieme di epatociti con transgeni. Il vettore TRAP può anche essere coespresso con molecole di 17 che attivano i geni o silenziano17, tra cui cDNA, RNA a pelo corto e guidano l'RNA, per studiare gli effetti sull'espressione genica globale dell'attivazione o dell'inibizione di un gene specifico. In alternativa, il topo transgenico RosaLSL-GFP-L10A offre la possibilità di profilare l'espressione genica in qualsiasi cellula con l'attività ricombinabile Cre. Poiché GFP:RPL10A può essere espresso in modo specifico in tutte le cellule che esprimono Cre, il ruolo di altri tipi di cellule nel fegato durante lesioni epatiche e ripopolamento potrebbe essere studiato. Ad esempio, l'attraversamento del topo CK19-Cre con il topo transgenico TRAP potrebbe essere usato per esprimere GFP:RPL10A in colgaliociti seguiti da TRAP-seq per studiare il cambiamento dell'espressione genica nell'epitelio biliare durante il processo di ripopolamento.

Per garantire una profilazione accurata dell'espressione genica, è fondamentale preparare tutti i buffer e la matrice di affinità prima della dissezione dei tessuti. Tutti i passaggi devono essere eseguiti su ghiaccio con tamponi freddi se non diversamente specificato per garantire la stabilizzazione del polisonte10 e prevenire la degradazione dell'RNA. Tutti i buffer devono essere preparati con reagenti privi di RNase e il protocollo TRAP-seq deve essere effettuato in un ambiente privo di RNae per prevenire la degradazione dell'RNA e la bassa resa di RNA immunoprecipitato. La matrice di affinità può essere preparata fino a 2 settimane prima dell'uso con una leggera sospensione su un rotatore tubo durante la notte. Prestare particolare attenzione a non scuotere vigorosamente la matrice per evitare l'interruzione delle perle magnetiche rivestite a L di anticorpo. I metodi per preparare la matrice di affinità includono la coniugazione delle perline magnetiche alla proteina L biotinylata seguita da incubazione con anticorpi anti-GFP. Tuttavia, le proteine A/G magnetiche a disponibilità commerciale possono essere sostituite; se utilizzato, saltare la fase di coniugazione iniziale e procedere direttamente al legame dell'anticorpo. Inoltre, i tag epitope alternativi sono presumibilmente fattibili con il protocollo di cui sopra con una modifica appropriata.

Ci sono vari punti in cui l'isolamento dell'RNA e la fase di purificazione possono essere messi in pausa (vedi protocollo sopra). Tuttavia, una volta che i campioni di fegato sono stati raccolti, si raccomanda di continuare con l'immunoprecipitazioni, poiché il rendimento dell'RNA isolato potrebbe diminuire del 50% con il congelamento in questo passaggio10. I tessuti devono essere rapidamente sciacquati con buffer di dissezione che contiene ciclosessimide per inibire la traduzione dell'mRNA. Una lisi tistrale insufficiente potrebbe anche contribuire a un basso rendimento dell'RNA. È fondamentale omogeneizzare i tessuti sul ghiaccio fino a quando non sono visibili blocchi di tessuto con l'omogeneizzatore motorio, garantendo al contempo un'aerazione minima10. Inoltre, un lavaggio sufficiente con tampone ad alto sale è fondamentale per garantire la rimozione del legame non specifico delle proteine ribosomiche alla matrice di affinità. L'inclusione di un controllo negativo di tipo selvaggio aiuta a valutare la specificità dell'immunoprecipitazioni e l'efficienza delle fasi di lavaggio. Inoltre, l'utilizzo di un kit commerciale di purificazione dell'RNA che include il trattamento DNase senza RNASe aumenterà la purezza dell'RNA.

Inoltre, si raccomanda di verificare l'espressione e l'abbondanza della proteina di fusione GFP:RPL10A e valutare la quantità di tessuto necessaria per ottenere ampi RNA per l'analisi a valle. Sezioni o listi tistali potrebbero essere utilizzati per metodi di rilevamento immuno-based per convalidare l'espressione di GFP:RPL10A. La quantità di RNA isolata può variare in base a: (1) il numero di cellule che esprimono GFP:RPL10A, (2) il livello di espressione del transgene e (3) le dimensioni e la ploidia delle cellule che esprimono il transgene. Un esperimento pilota che utilizza metà e il doppio della quantità raccomandata di tessuto potrebbe essere utile per determinare il lisadito di ingresso ottimale per TRAP-seq. Nelle nostre mani, potremmo ottenere 150 ng di RNA con appena 1-2% di epatociti che esprimono GFP:RPL10A da 200 mg del ripopolante Fah-/- fegato, che rappresenta 2 x 105 epatitoi poliploidi con espressione transgenica9.

La metodologia TRAP-seq isola l'mRNA ribosoma per profilare il pool di mRNA traducente di una cellula. Le letture di sequenziamento risultanti corrispondono quindi al "translatome" piuttosto che al trascrittoma. Si noti che la traduzione di impronte di ribosomie non verrà raccolta, poiché TRAP viene eseguita su complessi nativi anziché crosslinked. Se si desidera che si desiderino analisi di impronte, il protocollo di cui sopra deve essere modificato con rilevanti collegamenti incrociati seguiti da metodologie di immunoprecipitazioni (CLIP)18. Un'altra limitazione del TRAP è la necessità di un numero sufficiente di cellule che esprimono la proteina di fusione GFP:RPL10A. Per gli esperimenti in cui il tipo di cellula è piccolo, la combinazione di più campioni biologici può essere necessaria per isolare l'RNA sufficiente per abilitare RNA-seq19. Inoltre, TRAP-seq richiede la presenza di GFP:RPL10A nel tipo di cella di interesse. Questo potrebbe rappresentare una sfida se non esiste un sistema di consegna specifico alle celle o se un promotore specifico di tipo cella per guidare l'espressione Cre non è disponibile.

Il recente sviluppo della tecnologia RNA-seq (scRNA-seq) a cella singola ha permesso il sequenziamento diretto seguito dall'identificazione in silico di vari tipi di cellule, che consente il sequenziamento senza smistare per specifici tipi di cellule di interessi20 ,21,22. Tuttavia, scRNA-seq richiede ancora la dissociazione delle cellule dall'organo. Nel caso del modello di ripopolamento Fah-/-, la perfusione epatica e l'isolamento degli epatociti è estremamente difficile e inefficiente a causa della fragilità sia dei feriti che della replica degli epatociti. In fatti, non siamo ancora stati in grado di isolare un numero sufficiente di equalitociti dai topi Fah-/- sottoposti a ripopolamento dopo l'iniezione idrodinamica di fah plasmidi. Inoltre, nel tempo necessario per elaborare i tessuti, i livelli di espressione genica potrebbero cambiare. I protocolli per la perfusione epatica richiedono fino a 30 min di tempo caldo ischemia. Le metodologie future per ottimizzare la perfusione epatica per ridurre i tempi di elaborazione e aumentare l'efficienza di isolamento potrebbero consentire l'integrazione scRNA-seq al sistema del modello murino Fah-/- e possibilmente ad altri modelli di lesioni e ripopolamenti. Ciò consentirebbe anche lo studio di tutti i tipi di cellule epatiche.

In conclusione, l'integrazione del TRAP-seq con il topo Fah-/- consente l'isolamento specifico e la profilazione dell'espressione genica di replicare gli epatociti per identificare obiettivi terapeutici che potrebbero promuovere il ripopolamento epatico. Questo metodo può essere implementato per studiare altri tipi di cellule nel fegato e in altri sistemi di organi per l'identificazione specifica della malattia dei cambiamenti dell'espressione genica per identificare potenziali bersagli farmacologici o biomarcatori. Una tecnica analoga può essere utilizzata per raccogliere i nuclei dal ripopolamento degli epotociti utilizzando la purificazione dell'affinità, e quindi per eseguire un'analisi epigenetica di queste cellule specifiche16.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dalle seguenti sovvenzioni: F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (AM) , K08-DK106478 (KJW) e P30-DK050306 (Pilot grant to KJW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated DWK Life Sciences (Wheaton) 358007
Absolutely RNA Miniprep Kit Agilent 400800
Anti-GFP antibodies Memorial Sloan-Kettering Antibody & Bioresource Core GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7
Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free Jackson ImmunoResearch 001-000-162
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836170001
Cycloheximide Millipore Sigma C7698
Deoxycholic acid, DOC Millipore Sigma D2510
D-Glucose, Dextrose Fisher Scientific D16
DL-Dithiothreitol Millipore Sigma D9779
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 Thermo Fisher Scientific 65602
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Fisher Scientific FB0875712
HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red Thermo Fisher Scientific 14065-056
HEPES, 1 M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific Thermo Fisher Scientific AAJ16924AE
Magnesium chloride, MgCl2  Millipore Sigma M8266
Methanol Fisher Scientific A452
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific VV-83061-00
NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module New England BioLabs E7490S
NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina New England BioLabs E7530S
Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630 Millipore Sigma I8896
Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated Ambion AM9932
Overhead Stirrer DWK Life Sciences (Wheaton) 903475
PBS Buffer (10x), pH 7.4 Ambion AM9625
Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated Thermo Fisher Scientific 29997
Potassium chloride, KCl Millipore Sigma P4504
RNA 6000 Pico Kit & Reagents Agilent 5067-1513
RNaseZap RNase Decontamination Solution Invitrogen AM9780
RNasin Ribonuclease Inhibitors Promega N2515
Sodium azide, NaN3 Millipore Sigma S2002
Sodium bicarbonate, NaHCO3 Millipore Sigma S6297
SUPERase·In RNase Inhibitor Invitrogen AM2694

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References

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Profiling dell'espressione genica specifica del tipo di cella nel fegato del mouse
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Wang, A. W., Zahm, A. M., Wangensteen, K. J. Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver. J. Vis. Exp. (151), e60242, doi:10.3791/60242 (2019).More

Wang, A. W., Zahm, A. M., Wangensteen, K. J. Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver. J. Vis. Exp. (151), e60242, doi:10.3791/60242 (2019).

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