Profiling dell'espressione genica specifica del tipo di cella nel fegato del mouse
Summary
La traduzione della purificazione dell’affinità dei ribosomi (TRAP) consente un isolamento rapido ed efficiente dell’mRNA di traslazione specifico del tipo di cellula. Qui, dimostriamo un metodo che combina l’iniezione idrodinamica della vena della coda in un modello murino di ripopolamento e del trap per esaminare il profilo di espressione degli epatociti ripopolamento.
Abstract
Il ripopolamento del fegato dopo lesioni è una caratteristica cruciale dei mammiferi che previene l’insufficienza e la morte immediata degli organi dopo l’esposizione di tossine ambientali. Una comprensione più approfondita dei cambiamenti nell’espressione genica che si verificano durante il ripopolamento potrebbe aiutare a identificare gli obiettivi terapeutici per promuovere il ripristino della funzione epatica in caso di lesioni. Ciò nonostante, i metodi per isolare specificamente gli epatociti ripopolati sono inibiti dalla mancanza di marcatori cellulari, da un numero limitato di cellule e dalla fragilità di queste cellule. Lo sviluppo della tecnologia trap (Rato) di traduzione della purificazione dell’affinità riboscanda (TRAP) in combinazione con il modello murino Fah-/- per ricapitolare il ripopolamento del ripopolamento nell’impostazione delle lesioni epatiche consente la profilazione genica del ripopolamento Epatociti. Con trap, l’mRNA di traduttura specifico del tipo di cellula è isolato rapidamente ed efficacemente. Abbiamo sviluppato un metodo che utilizza trap con isolamento basato sull’affinità di traduzione di mRNA da epatociti che esprimono selettivamente la proteina ribosomica marcata GFP (GFP) (RP), GFP:RPL10A. TRAP aggira il lungo periodo di tempo necessario per lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza che potrebbe cambiare il profilo dell’espressione genica. Inoltre, poiché solo gli epatociti che ripopolano esprimono la proteina di fusione GFP:RPL10A, l’mRNA isolato è privo di contaminazione dagli epatociti feriti circostanti e da altri tipi di cellule nel fegato. L’mRNA purificato dall’affinità è di alta qualità e consente l’analisi pcR o ad alta velocità pcR o ad alta velocità dell’espressione genica.
Introduction
Come principale organo metabolico nei vertebrati, il fegato è responsabile dell’omeostasi del glucosio, sintesi proteica del siero, secrezione dell’acido biliare e metabolismo xenobiotico e disintossicazione. Il fegato possiede una straordinaria capacità di rigenerare il parenchyma ferito dopo l’esposizione alle tossine per prevenire l’insufficienza epatica immediata1. Tuttavia, il fallimento della rigenerazione può verificarsi nella cornice di acetaminofene o consumo eccessivo di alcol, che può portare a insufficienza epatica acuta2. Inoltre, lesioni epatiche croniche causate da infezione da epatite virale, malattia del fegato grasso, e steatoepatite può causare fibrosi epatica, cirrosi, e carcinoma epatocellulare3. L’unico trattamento curativo disponibile per la malattia epatica in fase avanzata è il trapianto, ma è limitato dalla carenza di organi, prevenendo un trattamento efficiente per tutti i pazienti4. Una migliore comprensione del processo di recupero dopo lesioni epatiche tossiche è quindi cruciale per lo sviluppo di trattamenti per stimolare la rigenerazione sufficiente per salvare la funzione nell’organo malato.
Il sistema modello più ampiamente applicato per lo studio della rigenerazione del fegato è l’epatectomia parziale nei roditori, in cui una grande percentuale del fegato viene reseguita per stimolare una rapida espansione dell’epatocito5. Tuttavia, l’epatectomia parziale non ricapitola l’espansione dell’epatocite a seguito di lesioni epatiche tossiche a causa della mancanza di infiltrazione delle cellule immunitarie e necrosi delle cellule epatocitiche spesso osservata nell’impostazione di lesioni epatiche acute negli esseri umani6. Un sistema più adatto per modellare questa forma di rinnovamento dell’organo è il fah-/- mouse, che manca di idrolasi funzionale ylacetoacetate (FAH) necessaria per il corretto metabolismo della tirosina e sviluppa gravi danni al fegato che portano alla morte7. Questi topi possono essere mantenuti in uno stato sano a tempo indeterminato dal trattamento con il farmaco nitisinone nell’acqua potabile. In alternativa, l’espressione FAH può essere ripristinata con la consegna transgene a un sottoinsieme di epatociti, che si espanderà per ripopolare il fegato al momento della rimozione del nidino8.
Per profilare i cambiamenti di espressione genica del ripopolamento degli epatociti, è necessario uno strumento per isolare specificamente gli epatociti nel topo Fah-/- senza contaminazione da epatociti feriti vicini e altri tipi di cellule. Purtroppo, lo smistamento delle cellule assistite dalla fluorescenza (FACS) degli epatociti è difficile poiché (1) la fragilità del ripopolamento degli epatociti porta a un recupero inadeguato dopo la perfusione epatica, (2) replicando gli epatociti sono di dimensioni altamente variabili, rendendo l’isolamento di una popolazione pura da FACS difficile, e (3) il tempo di procedura dalla perfusione epatica all’isolamento dell’RNA è maggiore di 2 h, quindi i profili di espressione genica possono subire sostanziali modifiche artificiali prima dell’acquisizione dei campioni9.
In alternativa, l’espressione di ribosomi con etichettatura epitope specificamente nel ripopolamento degli epatociti consente il rapido isolamento della traduzione attiva dell’mRNA legato dai ribosomi utilizzando la purificazione dell’affinità subito dopo la raccolta dell’organo, con fegato sfuso listi tistali. Qui, descriviamo un protocollo per eseguire la purificazione dell’affinità trasbora-ribosomica (TRAP)10 seguito dal sequenziamento dell’RNA ad alto rendimento (TRAP-seq), per isolare e profilare specificamente l’mRNA nel ripopolamento degli epatociti nel Fah-/- mouse9. La coespressione della proteina ribossomica marcata proteica fluorescente verde (GFP:RPL10A) con FAH consente la purificazione dell’affinità dell’mRNA traducivo vincolato da polinomi contenenti GFP:RPL10A. Questo metodo evita qualsiasi fase di dissociazione cellulare, come la perfusione epatica per isolare epatiti epopultanti fragili. Invece, utilizza la lisi di tessuto intero dell’organo e anticorpi per estrarre rapidamente l’RNA specificamente dalle cellule bersaglio. Infine, l’isolamento di un abbondante mRNA di alta qualità tramite TRAP-seq consente ad applicazioni a valle come l’analisi del sequenziamento di profilare il cambiamento dinamico dell’espressione genica durante il processo di ripopolamento.
Protocol
Representative Results
Discussion
IL TRAP-seq è una tecnica per l’isolamento specifico del tipo di cellula della traduzione dell’mRNA tramite ribosomi con tag epipito e presenta un’alternativa agli approcci FACS, in quanto elude limitazioni come i requisiti di tempo di FACS9. Invece, TRAP consente un rapido ed efficiente isolamento dell’RNA direttamente dai tessuti sfusi, contribuendo a evitare qualsiasi alterazione nell’espressione genica. TRAP-seq è particolarmente adatto per l’uso nel ripopolante fegato di topo Fah-/…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalle seguenti sovvenzioni: F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (AM) , K08-DK106478 (KJW) e P30-DK050306 (Pilot grant to KJW).
Materials
| 10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated | DWK Life Sciences (Wheaton) | 358007 | |
| Absolutely RNA Miniprep Kit | Agilent | 400800 | |
| Anti-GFP antibodies | Memorial Sloan-Kettering Antibody & Bioresource Core | GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7 | |
| Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Cycloheximide | Millipore Sigma | C7698 | |
| Deoxycholic acid, DOC | Millipore Sigma | D2510 | |
| D-Glucose, Dextrose | Fisher Scientific | D16 | |
| DL-Dithiothreitol | Millipore Sigma | D9779 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Thermo Fisher Scientific | 65602 | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| HEPES, 1M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific | Thermo Fisher Scientific | AAJ16924AE | |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Millipore Sigma | M8266 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | VV-83061-00 | |
| NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module | New England BioLabs | E7490S | |
| NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7530S | |
| Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630 | Millipore Sigma | I8896 | |
| Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated | Ambion | AM9932 | |
| Overhead Stirrer | DWK Life Sciences (Wheaton) | 903475 | |
| PBS Buffer (10x), pH 7.4 | Ambion | AM9625 | |
| Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated | Thermo Fisher Scientific | 29997 | |
| Potassium chloride, KCl | Millipore Sigma | P4504 | |
| RNA 6000 Pico Kit & Reagents | Agilent | 5067-1513 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitors | Promega | N2515 | |
| Sodium azide, NaN3 | Millipore Sigma | S2002 | |
| Sodium bicarbonate, NaHCO3 | Millipore Sigma | S6297 | |
| SUPERase·In RNase Inhibitor | Invitrogen | AM2694 | |
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