Celle type-specifik genekspression profilering i muse leveren
Summary
Oversættelse af ribosom affinitets rensning (Trap) muliggør hurtig og effektiv isolering af celletype specifik oversættelse af mRNA. Her demonstrerer vi en metode, der kombinerer Hydrodynamisk hale-vene injektion i en musemodel af leveren genindsættelse og fælde for at undersøge udtryks profilen for at genbefolde hepatocytter.
Abstract
Lever genbestand efter skade er et afgørende træk ved pattedyr, som forhindrer umiddelbar organsvigt og død efter eksponering af miljømæssige toksiner. En dybere forståelse af ændringerne i genekspression, der opstår under genpopulation kunne hjælpe med at identificere terapeutiske mål for at fremme genoprettelsen af leverfunktionen i fastsættelsen af skader. Ikke desto mindre, metoder til at isolere specifikt de genbefolgende hepatocytter hæmmes af en mangel på celle markører, begrænsede cellenumre, og skrøbelighed af disse celler. Udviklingen af oversætte ribosom affinitets rensning (Trap) teknologi i forbindelse med Fah-/- musemodel til at rekapitulere genpopulation i fastsættelsen af leverskade tillader genekspression profilering af genbefolkning Hepatocytter. Med TRAP, celletype-specifikke oversætte mRNA er hurtigt og effektivt isoleret. Vi udviklede en metode, der udnytter FÆLDE med affinitets baseret isolering af oversættelse af mRNA fra hepatocytter, der selektivt udtrykker det grønne fluorescerende protein (GFP)-Tagged ribosomale protein (RP), GFP: RPL10A. TRAP omgår den lange tidsperiode, der kræves for fluorescens-aktiveret celle sortering, som kan ændre genekspressions profilen. Desuden, da kun de genbefolkede hepatocytter udtrykker GFP: RPL10A fusion protein, den isolerede mRNA er blottet for kontaminering fra de omgivende skadede hepatocytter og andre celletyper i leveren. Affiniteten-renset mRNA er af høj kvalitet og tillader downstream PCR-eller High-gennemløb sekvensering-baseret analyse af genekspression.
Introduction
Som det vigtigste metaboliske organ i hvirveldyr er leveren ansvarlig for glucosehomøostase, serumprotein syntese, galdesyre sekretion og xenobiotisk metabolisme og afgiftning. Leveren besidder en ekstraordinær evne til at regenerere den skadede parenkym ved udsættelse for toksiner for at forhindre umiddelbar leversvigt1. Men, svigt af regenerering kan forekomme i fastsættelsen af acetaminophen eller alkohol overforbrug, hvilket kan føre til akut leversvigt2. Endvidere, kronisk leverskade forårsaget af viral hepatitis infektion, fedt leversygdom, og steatohepatitis kan forårsage lever fibrose, cirrhose, og hepatocellulære karcinom3. Den eneste tilgængelige helbredende behandling for slutstadiet leversygdom er transplantation, men er begrænset af organmangel, forhindrer effektiv behandling for alle patienter4. En bedre forståelse af nyttiggørelsesprocessen efter giftig leverskade er derfor afgørende for udviklingen af behandlinger til stimulering af regenerering, der er tilstrækkelig til at redde funktionen i det sygdomsramte organ.
Den mest bredt anvendte model system til studiet af lever regenerering er delvis hepatektomi i gnavere, hvor en stor del af leveren er gensendt til at stimulere hurtig hepatocyt ekspansion5. Men, delvis hepatektomi ikke rekapitulere hepatocyt ekspansion efter giftige leverskade på grund af manglen på immuncelle infiltration og hepatocyt celle nekrose ofte observeret i fastsættelsen af akut leverskade hos mennesker6. En mere egnet system til at modellere denne form for organ fornyelse er Fah-/- mus, som mangler funktionelle fumarylacetoacetat hydrolase (Fah) kræves for korrekt tyrosin metabolisme og udvikler alvorlige leverskader fører til døden7. Disse mus kan vedligeholdes i en sund tilstand på ubestemt tid ved behandling med lægemidlet nitisinin i drikkevandet. Alternativt kan FAH-ekspression genoprettes ved transgene levering til en delmængde af hepatocytter, som vil ekspandere for at genbefolke leveren ved nitisinaffjernelse8.
For at profilere genekspression ændringer af genbefolkede hepatocytter, et værktøj til specifikt at isolere replisering hepatocytter i Fah-/- mus uden kontaminering fra de tilstødende skadede hepatocytter og andre celletyper er påkrævet. Desværre, fluorescens-assisteret celle sortering (FACS) af hepatocytter er vanskelig, da (1) skrøbelighed af genbefolker hepatocytter fører til dårlig genopretning efterlever perfusion, (2) replicerende hepatocytter er meget varierende i størrelse, gør isolation af en ren population af FACS vanskeligt, og (3) proceduren tid fra leveren perfusion til RNA isolation er større end 2 h, dermed genekspression profiler kan undergår betydelige kunstige ændringer, før prøverne erhverves9.
Alternativt giver ekspression af epitope-mærkede ribosomer specifikt til genbefolkning af hepatocytter mulighed for hurtig isolering af aktivt at oversætte mRNA bundet af ribosomer ved hjælp af affinitets rensning umiddelbart efter organhøst, med bulk lever vævs lysater. Her beskriver vi en protokol til at udføre oversættelse-ribosome affinitet rensning (TRAP)10 efterfulgt af High-gennemløb RNA-sekventering (Trap-SEQ), til specifikt at isolere og profilere mRNA i genbefolkning hepatocytter i Fah-/- mus9. Coexpression af grønt fluorescerende protein-Tagged ribosomale protein (GFP: RPL10A) med FAH tillader affinitet rensning af oversætte mRNA bundet af polysomer indeholdende GFP: RPL10A. Denne metode undgår enhver celle dissociation trin, såsom leveren perfusion at isolere skrøbelige genbefolgende hepatocytter. I stedet, det udnytter lysis af hele orgel væv og antistoffer til hurtigt at udtrække RNA specifikt fra målcellerne. Endelig giver isolering af rigelig, høj kvalitet mRNA via TRAP-SEQ mulighed for downstream-applikationer såsom sekvensering analyse til at profilere den dynamiske ændring af genekspression under genpopulationsprocessen.
Protocol
Representative Results
Discussion
TRAP-SEQ er en teknik til celletype-specifik isolering af oversætte mRNA via epitope-mærkede ribosomer og præsenterer et alternativ til FACS tilgange, da det omgår begrænsninger såsom tids krav af FACS9. I stedet, FÆLDE tillader hurtig og effektiv isolering af RNA direkte fra bulk væv, hjælpe med at undgå eventuelle ændringer i genekspression. Trap-SEQ er især velegnet til brug i den genbefolke Fah-/- muselever, da hepatocytter ekspansion efter fjernelse af nitisin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af følgende tilskud: F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (AMZ), K08-DK106478 (KJW) og P30-DK050306 (pilot Grant til KJW).
Materials
| 10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated | DWK Life Sciences (Wheaton) | 358007 | |
| Absolutely RNA Miniprep Kit | Agilent | 400800 | |
| Anti-GFP antibodies | Memorial Sloan-Kettering Antibody & Bioresource Core | GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7 | |
| Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Cycloheximide | Millipore Sigma | C7698 | |
| Deoxycholic acid, DOC | Millipore Sigma | D2510 | |
| D-Glucose, Dextrose | Fisher Scientific | D16 | |
| DL-Dithiothreitol | Millipore Sigma | D9779 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Thermo Fisher Scientific | 65602 | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| HEPES, 1M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific | Thermo Fisher Scientific | AAJ16924AE | |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Millipore Sigma | M8266 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | VV-83061-00 | |
| NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module | New England BioLabs | E7490S | |
| NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7530S | |
| Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630 | Millipore Sigma | I8896 | |
| Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated | Ambion | AM9932 | |
| Overhead Stirrer | DWK Life Sciences (Wheaton) | 903475 | |
| PBS Buffer (10x), pH 7.4 | Ambion | AM9625 | |
| Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated | Thermo Fisher Scientific | 29997 | |
| Potassium chloride, KCl | Millipore Sigma | P4504 | |
| RNA 6000 Pico Kit & Reagents | Agilent | 5067-1513 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitors | Promega | N2515 | |
| Sodium azide, NaN3 | Millipore Sigma | S2002 | |
| Sodium bicarbonate, NaHCO3 | Millipore Sigma | S6297 | |
| SUPERase·In RNase Inhibitor | Invitrogen | AM2694 | |
References
- Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).
- Lee, W. M. Etiologies of acute liver failure. Seminars in Liver Disease. 28 (2), 142-152 (2008).
- Sanyal, A. J., Yoon, S. K., Lencioni, R. The etiology of hepatocellular carcinoma and consequences for treatment. The Oncologist. 15 Suppl 4, 14-22 (2010).
- Jadlowiec, C. C., Taner, T. Liver transplantation: Current status and challenges. World Journal of Gastroenterology. 22 (18), 4438-4445 (2016).
- Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. Liver regeneration. Science. 276 (5309), 60-66 (1997).
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas. The American Journal of Pathology. 176 (1), 2-13 (2010).
- Grompe, M., et al. Loss of fumarylacetoacetate hydrolase is responsible for the neonatal hepatic dysfunction phenotype of lethal albino mice. Genes & Development. 7 (12A), 2298-2307 (1993).
- Wangensteen, K. J., et al. A facile method for somatic, lifelong manipulation of multiple genes in the mouse liver. Hepatology. 47 (5), 1714-1724 (2008).
- Wang, A. W., et al. TRAP-seq identifies cystine/glutamate antiporter as a driver of recovery from liver injury. The Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2297-2309 (2018).
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).
- Agilent Technologies. . Agilent RNA 6000 Pico: User Manual. , (2016).
- NEBNext. . NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina: User Manual. , (2018).
- NanoDrop. . 2000/2000c Spectrophotomerter: User Manual. , (2009).
- Liu, J., et al. Cell-specific translational profiling in acute kidney injury. The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1242-1254 (2014).
- Lu, S. C. Regulation of glutathione synthesis. Molecular Aspects of Medicine. 30 (1-2), 42-59 (2009).
- Wang, A. W., et al. The dynamic chromatin architecture of the regenerating liver. bioRxiv. , (2019).
- Zahm, A. M., et al. A high-content in vivo screen to identify microRNA epistasis in the repopulating mouse liver. bioRxiv. , (2019).
- Stork, C., Zheng, S. Genome-Wide Profiling of RNA-Protein Interactions Using CLIP-Seq. Methods in Molecular Biology. 1421, 137-151 (2016).
- Zhao, X., et al. Glutathione antioxidant pathway activity and reserve determine toxicity and specificity of the biliary toxin biliatresone in zebrafish. Hepatology. 64 (3), 894-907 (2016).
- Halpern, K. B., et al. Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver. Nature. 542 (7641), 352-356 (2017).
- Camp, J. G., et al. Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency. Nature. 546 (7659), 533-538 (2017).
- Wang, Y. J., Kaestner, K. H. Single-Cell RNA-Seq of the Pancreatic Islets–a Promise Not yet Fulfilled?. Cell Metabolism. 29 (3), 539-544 (2019).
