Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Сотовый тип-специфический Джин Выражение Профилирование в печени мыши

Published: September 17, 2019 doi: 10.3791/60242

Summary

Перевод рибосомной очистки сродства (TRAP) обеспечивает быструю и эффективную изоляцию клеточного типа переноса мРНК. Здесь мы демонстрируем метод, который сочетает в себе гидродинамические инъекции хвостовой вена в мышиной модели репопуляции печени и TRAP для изучения экспрессии профиля перенаселенности гепатоцитов.

Abstract

Репопуляция печени после травмы является важной особенностью млекопитающих, которая предотвращает немедленную отказ органов и смерть после воздействия токсинов окружающей среды. Более глубокое понимание изменений в экспрессии генов, которые происходят во время репопуляции может помочь определить терапевтические цели для содействия восстановлению функции печени в обстановке травм. Тем не менее, методы изоляции конкретно перенаселенности гепатоцитов тормозятся отсутствием клеточных маркеров, ограниченным и хрупкость этих клеток. Развитие технологии очистки рибосомы сродства (TRAP) в сочетании с моделью мыши для повторения репопуляции при настройке травмы печени позволяет профилировать экспрессию генов в перенаселенности Гепатоцитов. С TRAP, тип клеток конкретных перевода мРНК быстро и эффективно изолированы. Мы разработали метод, который использует TRAP с сродством основе изоляции перевода мРНК от гепатоцитов, которые избирательно выразить зеленый флуоресцентный белок (GFP) помечены рибосомный белок (RP), GFP:RPL10A. TRAP обходит длительный период времени, необходимый для сортировки клеток, активированных флуоресценцией, который может изменить профиль экспрессии гена. Кроме того, поскольку только перенаселенности гепатоцитов выражают GFP:RPL10A синтез белка, изолированные мРНК лишен загрязнения от окружающих поврежденных гепатоцитов и других типов клеток в печени. Сродство очищенной мРНК имеет высокое качество и позволяет ниже по течению ПЦР- или высокой пропускной способности на основе анализа экспрессии генов.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Как основной метаболический орган у позвоночных, печень отвечает за гомеостаз глюкозы, синтез белка сыворотки, секрецию желчных кислот, ксенобиотический метаболизм и детоксикацию. Печень обладает чрезвычайной способностью к регенерации травмированной паренхимы при воздействии токсинов, чтобы предотвратить немедленную печеночную недостаточность1. Однако сбой регенерации может произойти при возникновении ацетаминофена или алкогольного чрезмерного потребления, что может привести к острой печеночной недостаточности2. Кроме того, хроническая травма печени, вызванная вирусной инфекцией гепатита, жировой болезнью печени и стеатогепатитом, может вызвать фиброз печени, цирроз и гепатоцеллюлялическую карциному3. Единственным доступным лечебным лечением заболевания печени на конечном этапе является трансплантация, но она ограничена нехваткой органов, что препятствует эффективному лечению для всех пациентов4. Более глубокое понимание процесса восстановления после токсической травмы печени, следовательно, имеет решающее значение для развития лечения, чтобы стимулировать регенерацию достаточно, чтобы спасти функцию в больном органе.

Наиболее широко применяемой модельной системой для изучения регенерации печени является частичная гепатэктомия у грызунов, при которой значительная часть печени резецируется для стимуляции быстрого расширения гепатоцитов5. Тем не менее, частичная гепатэктомия не резюмирует расширение гепатоцитов после токсической травмы печени из-за отсутствия инфильтрации иммунных клеток и некроза клеток гепатоцитов, часто наблюдаемых при установлении острой травмы печени у людей6. Более подходящей системой для моделирования этой формы обновления органов является Fah-/- мышь, которая не имеет функциональной гидролазы фумарицетоацета (FAH), необходимой для правильного метаболизма тирозинов и развивает серьезные повреждения печени, приводящие к смерти7. Эти мыши могут поддерживаться в здоровом состоянии на неопределенный срок путем лечения препаратом нитинон в питьевой воде. Кроме того, выражение FAH может быть восстановлено трансгенной доставкой в подмножество гепатоцитов, которые будут расширяться, чтобы заселить печень после удаления нитисинона8.

Для профиля изменения экспрессии генов перенаселенности гепатоцитов, инструмент для специального изолировать репликации гепатоцитов в Фах-/- мышь без загрязнения от соседних раненых гепатоцитов и других типов клеток не требуется. К сожалению, флуоресценция при содействии клеточной сортировки (FACS) гепатоцитов трудно, так как (1) хрупкость перенаселенности гепатоцитов приводит к плохому восстановлению после перфузии печени, (2) репликации гепатоцитов весьма изменчивы по размеру, что делает изоляцию чистой популяции FACS трудно, и (3) процедура время от перфузии печени до изоляции РНК больше, чем 2 ч, следовательно, профили экспрессии генов могут претерпеть существенные искусственные изменения, прежде чем образцы приобретены9.

Кроме того, выражение эпитоп-тегами рибосом, специально в перенаселенности гепатоцитов позволяет быстро изоляции активно перевод яРНК связаны рибосомы с помощью сродства очистки сразу после сбора органов, с объемной печени тл. Здесь мы описываем протокол для выполнения очистки сродства с сородия для перевода (TRAP)10 с последующим высокой пропускной способностью РНК-секвенирования (TRAP-seq), чтобы специально изолировать и профиль мРНК в перенаселенности гепатоцитов в Фах-/- мышь9. Коэкспрессия зеленого флуоресцентного белка помечены рибосомный белок (GFP:RPL10A) с FAH позволяет сродство очистки перевода мРНК связаны полисомы, содержащие GFP:RPL10A. Этот метод позволяет избежать любых клеточных этапов диссоциации, таких как перфузия печени, чтобы изолировать хрупкие перенаселенности гепатоцитов. Вместо этого, он использует лисис целой ткани органа и антител, чтобы быстро извлечь РНК специально из клеток-мишеней. Наконец, изоляция обильной, высококачественной мРНК через TRAP-seq позволяет приложениям вниз по течению, таким как анализ секвенирования, профилировать динамическое изменение экспрессии генов в процессе перенаселения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Все методы, связанные с использованием мышей, согласуются с руководящими принципами, предусмотренными IACUC Управления пенна по защите животных при Университете Пенсильвании.

1. Подготовка реагента

  1. Циклогексид
    1. Чтобы сделать 500 л 0,1 г/мл циклогексидида, приостановите 50 мг циклогексидида в 500 л метанола.
      ПРЕДЕКТО: Циклогексимид чрезвычайно токсичен для окружающей среды и может вызвать врожденные пороки развития. Все отходы и буферы, содержащие циклогексимид, должны быть собраны для надлежащей утилизации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Циклогексимид может храниться при 4 градусах Цельсия в течение 1 дня. Циклогексимид подавляет перевод.
  2. Дитиотрейтол (DTT)
    1. Чтобы сделать 1 мл 1 М DTT, приостановить 0,15 г порошка DTT в RNase свободной воды.
      ПРЕДЕКТО: DTT может вызвать раздражение кожи, глаз и дыхательных путей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: DTT является моющим средством. DTT может храниться при -20 градусах Цельсия. Рекомендуется хранить 1 M DTT в одноразовых aliquots 50 Зл.
  3. Дезоксихолат (DOC)
    1. Чтобы сделать 10% DOC, приостановить 1 г DOC в 50 мл конической трубки и добавить RNase-бесплатноводы до 10 мл. Встряхните энергично, пока порошок не растворится.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор DOC 10% слегка желтый и может храниться при комнатной температуре (RT) до 1 года. DOC используется для ядерного лиза.
  4. Антитела GFP
    1. Аликвот GFP антитела при использовании в первый раз. Привязать заморозить aliquots и хранить на -80 градусов по Цельсию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется хранить 50 мкг антител GFP в одноразовых aliquots.
  5. B биотинилаповый белок L
    1. Приостановить биоинтинилатированный белок L в 1x фосфат-буферный солен (PBS), чтобы сделать окончательную концентрацию 1 мкг /Зл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Повторное решение может храниться при -20 градусов по Цельсию в течение 6 месяцев.

2. Подготовка буфера

  1. Буфер сыворотки крупного бордюра (BSA)
    1. Чтобы сделать 50 мл 3% буфера BSA, добавьте 1,5 г порошка BSA igG- и протеазы в 40 мл PBS с последующим вихрем. После растворения BSA добавьте PBS в окончательный объем 50 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер BSA может храниться при 4 градусах Цельсия в течение шести месяцев.
  2. Буфер рассечения
    1. Чтобы сделать 50 мл буферного запаса вскрытия, объедините 5 мл сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS), 125 л 1 М 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазазетанесульфоновая кислота (HEPES),1750 л 1 М глюкозы и 200 л 1 М. Добавьте воду без RNase до конечного объема 50 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Буферный запас вскрытия может храниться при 4 градусах По Цельсию в течение шести месяцев.
    2. Непосредственно перед использованием добавьте 100 мкг/мл 0,1 г/мл циклогексида и держитесь на льду.
  3. Буфер с высоким содержанием соли
    1. Чтобы сделать 50 мл высокосолевого буферного запаса, добавьте 1 мл 1 M HEPES, 8,75 мл 2 M KCl, 500 л 1 M MgCl2, и 500 л 100% неилфенил овый глихол(Таблица материалов)в RNase-свободной воды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Буферный запас с высокой солью может храниться при 4 градусах Цельсия в течение шести месяцев.
    2. Непосредственно перед использованием добавьте 0,5 л/мл 1 М ДТТ и 1 л/мл 0,1 г/мл циклогексида. Держите свежий буфер с высоким содержанием соли на льду.
  4. Низкосолевой буфер
    1. Чтобы сделать 50 мл низкосолевого буферного запаса, добавьте 1 мл 1 M HEPES, 3,75 мл 2 M KCl, 500 л 1 M MgCl2, и 500 л 100% неилфенил полиэтиленгликоль до 44,25 Мл RNase-свободной воды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Низкосолевой буферный запас может храниться при 4 градусах Цельсия в течение шести месяцев.
    2. Добавьте 0,5 л/мл 1 М ДТТ и 1 л/мл 0,1 г/м циклогексида перед использованием. Держите свежий буфер с низким содержанием соли на льду.
  5. Ткань лиза буфера
    1. Чтобы сделать 50 мл буферного запаса тканевого лисиса, смешайте 1 мл 1 M HEPES, 3,75 мл 2 М ККЛ и 500 л 1 М МГКл2. Добавьте воду без RNase в финал 50 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Буферный запас вскрытия может храниться при 4 градусах По Цельсию в течение шести месяцев.
    2. Добавьте 1 таблетку/10 мл ингибитора протеазы без ЭДТА, 1 л/мл циклогексида, 10 л/м ингибиторов RNase непосредственно перед использованием. Держите буфер лиза свежей ткани на льду.

3. Спряжение антител к магнитным бусинкам

  1. Антитела
    1. Рассчитайте количество антител GFP, необходимых для всех образцов, и подготовьте для одного дополнительного образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого образца требуется 50 мкг каждого антитела GFP.
    2. Оттепель GFP антитела на льду и спина на максимальной скорости (13000 х г)в течение 10 мин при 4 КС и передачи супернатантов в новую микроцентрифугую трубку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг подготовки антител может быть выполнен до подготовки биса и оттаять антитела могут быть сохранены на льду. Кроме того, эта часть может быть выполнена во время инкубации магнитного бисора и биотинилапопротека L.
  2. Перезагрузка магнитных бусин
    1. Resuspend магнитные бусы(Таблица материалов) нежным пипеттингом.
    2. Для каждого образца используйте 150 л магнитного биса. Рассчитайте объем магнитного бусы, необходимого для всех образцов, и подготовьте один дополнительный. Перенесите перепровизиваемые магнитные бусы на микроцентрифугную трубку 1,5 мл или 2 мл. Если для эксперимента требуется более 1 мл, разделите общую сумму на равные объемы.
    3. Соберите бисер на магнитной подставке в течение 1 мин и удалить супернатант. Удалите микроцентрифуг трубки с магнитной подставки и добавить 1 мл PBS следуют пипетки вверх и вниз, чтобы мыть бисер. Соберите бисер на магнитной подставке в течение 1 мин и удалить PBS.
  3. Приготовление белковых бусинок с покрытием L
    1. Для каждого образца используйте 60 л биотинилапотного белка Л. Если белок L ранее переприостанавливается и хранится при -20 градусах Цельсия, оттаивает белок L на льду. Если белок L переприостанавливается перед использованием, возьмите сумму, необходимую для всех образцов и подготовить один дополнительный.
    2. Добавьте рассчитанный объем биотинители белка L к повторной и промытой магнитной бусины. Добавьте 1x PBS, чтобы сделать окончательный объем 1 мл при использовании 1,5 мл микроцентрифуговой трубки, или 1,5 мл при использовании 2 мл микроцентрифугной трубки. Инкубировать магнитные бусы с биотинилатным белком L в течение 35 мин на РТ на трубчатом ротаторе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Антитела могут быть подготовлены на этом этапе в то время как бисер инкубации с биотинилатамидным белком L.
    3. Соберите белок L-покрытием бисера на магнитной подставке для йgt;1 мин и удалить супернатант. Удалите микроцентрифуг трубку с магнитной подставки и добавить 1 мл 3% буфера BSA следуют нежные pipetting, по крайней мере 5 раз, чтобы мыть белок L покрытием бисера.
    4. Соберите покрытые бусины на магнитной подставке для йgt;1 мин и удалить супернатант. Повторите стирки с 3% BSA еще 4 раза (в общей сложности 5 раз).
  4. Связывание антител
    1. Добавьте рассчитанное количество антител GFP в белок С покрытием бусы и инкубировать в течение 1 ч при 4 градусов по Цельсию на трубчатом ротаторе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После инкубации антител, принять особую осторожность, чтобы не вихрь сродства матрицы.
    2. Во время инкубации подготовьте низкосолевой буфер путем расчета общего объема, необходимого для всех образцов, и добавьте 0,5 л/мл 1 М ДТТ и 1 л/мл циклофоксидида к низкососольному буферному запасу перед использованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 3 мл низкосолевого буфера для мытья каждой трубки GFP-конъюгированных бусин и 200 Л/образец для повторной подвески GFP-конъюгированных бусин. Свежий буфер с низким содержанием соли можно хранить на льду в течение нескольких часов.
    3. Соберите матрицу сродства на магнитной подставке для йgt;1 мин и удалить супернатант. Добавьте 1 мл низкосолевого буфера и аккуратно пипетку вверх и вниз, чтобы помыть матрицу сродства. Соберите матрицу сродства на магнитной подставке для йgt;1 мин и удалить низкосолевой буфер. Повторите шаги стирки с низким содержанием соли буфера еще 2 раза (в общей сложности 3 раза).
    4. Приостановите действие бисера в низкосолевой буфер, чтобы каждый образец имеет 200 юртей матрицы сродства.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Матрица сродства может храниться в 0,02% NaN3 при 4 градусах Цельсия в течение 2 недель. Матрицу сродства следует быстро промыть в низкосолевой буфере 3 раза и аккуратно перенаsuspendedа на ротаторе трубки при 4 градусах по Цельсию в течение по крайней мере 10 мин, если матрица сродства подготовлена в течение 1 недели или на ночь, если матрица сродства хранится в течение 1 недели. Протокол может быть приостановлен после этого шага.
      ПРЕДЕКТО: Азид натрия чрезвычайно токсичен для окружающей среды. Контакт с кислотами производит токсичный газ. Все отходы должны быть собраны для надлежащего удаления.

4. Лиза ткани печени

  1. Подготовка буфера и установка оборудования
    1. Рассчитайте количество микроцентрифуговых трубок, которые требуются, маркировать и охлаждать на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно для каждого образца требуется семь микроцентрифуговых трубок мощностью 1,5 мл: 1 для оставшейся расчлененной печени, 4 на 4 мл гомогенизированного лизата печени и 2 для переноса супернациантов.
    2. Подготовьте свежий буфер вскрытия, вычислив общий объем, необходимый для всех образцов, и добавьте 1 л/мл 0,1 г/мл циклогексида. Поместите свежий буфер вскрытия на лед, чтобы сохранить холод на протяжении всего эксперимента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого образца требуется 10 мл буфера вскрытия.
    3. Приготовьте свежий буфер лизиса, вычислив общий объем, необходимый для всех образцов, и добавьте 1 таблетку/10 мл ингибитора протеазы без ЭДТА, 1 л/мл циклогексида 0,1 г/мл и 10 л/мингусингидов RNase каждый. Держите буфер лисиса на льду на протяжении всего эксперимента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого образца требуется 4 мл буфера лисиса.
    4. Настройте тризнит ткани(Таблица материалов)так, что политетрафторэтилен (PTFE)-стеклянные трубки могут быть помещены на льду во время гомогенизации частей печени. Положите 4 мл холодного буфера лиза в трубки PTFE-стеклянных.
  2. Перенаселенная гомогенизация печени
    1. Эвтаназия 8'12-недельный Фах-/- мышь вводили с вектором TRAP и заселены в течение 1'4 недель с анестезией и шейки матки дислокации в соответствии с утвержденными экспериментальными руководящими принципами животных.
    2. Поместите мышь на доску для вскрытия и распылите живот 70% этанола. Палатка кожи и брюшной полости низко в животе с помощью щипцы и использовать ножницы, чтобы сделать поперечный разрез. Продолжайте резать ножницами, чтобы сделать широкий U-образный перитонеальный лоскут, с осторожностью, чтобы не сократить внутренности. Переверните перитонеальный лоскут над грудиной, чтобы разоблачить печень.
    3. Тщательно удалить печень с помощью тонких ножниц и щипцы и быстро поместить ткани в холодный буфер вскрытия для промывки. Для гомогенизации замороженных тканей, быстро переместить нужное количество ткани печени в PTFE-стеклянные трубки с холодным буфером лизиса без оттаивания ткани.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Расчлененная ткань может быть заморожена и храниться при -80 градусов по Цельсию после того, как ее промывают буфером вскрытия. Протокол может быть приостановлен после этого шага.
    4. Взвесьте печень на чашке Петри и изолировать 200-500 мг кусочков печени и перейдите в трубки PTFE-стеклянные. Поместите оставшуюся ткань печени в предварительно охлажденной микроцентрифуговой трубки и флэш-заморозки.
    5. Гомогенизировать образцы в мотор-управляемый гомогенизатор, начиная с 300 об/ ч, чтобы отделить гепатоцитов от структуры печени, по крайней мере 5 ударов. Нижняя стеклянная трубка каждый раз, но заботиться, чтобы не позволить пестик подняться над раствором, чтобы предотвратить аэрацию, которая может вызвать денатурацию белка.
    6. Поднимите скорость до 900 об/мин, чтобы полностью гомогензировать ткани печени, по крайней мере 12 полных ударов.
    7. Перенесите лизат в маркированные и предварительно охлажденные трубки, с не более чем 1 мл лисата на 1,5 мл микроцентрифуговых труб. Если используется 4 мл буфера лисиса, держите 1 трубку и флэш заморозить оставшиеся 3 трубки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лисаты могут храниться на льду до 1 ч при вскрытии следующего животного и подготовке свежих лисатов. Гомогенизированная печень может быть заморожена после шага лизиса и храниться при -80 градусах Цельсия. Там может быть 50% снижение изолированных РНК, если замороженные лисаты используются. Протокол может быть приостановлен после этого шага.
  3. Ядерный лисис
    1. Центрифуга печени lysate на 2000 х г при 4 кв кв в течение 10 минут и передать супернатант в новый, прехлафтил микроцентрифуг трубки на льду.
    2. Добавьте 1/9 супернатантного объема 10% нонилфенил полиэтиленгликоль, чтобы сделать окончательную концентрацию 1% неилфенил полиэтиленгликоль и перемешать, мягко инвертируя микроцентрифуговых труб.
    3. Быстро спина вниз микроцентрифуговых труб и добавить 1/9 от объема образца 10% DOC, чтобы сделать окончательную концентрацию 1% DOC и смешать путем мягкоинтенвертивания микроцентрифуговых труб. Быстро вращать вниз микроцентрифуговых труб и инкубировать на льду в течение 5 минут.
    4. Центрифуга ядерного лисата на 20000 х г при 4 кв кв в течение 10 минут и передать супернатант в новый, прехлафтил микроцентрифуг трубки на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Митохондрий-обедированный супернатант может быть помещен на лед в течение нескольких часов, пока собираются оставшиеся образцы.

5. Иммунопрецистома

  1. Для каждой трубки, вынуть 1% от общего объема супернатанта в качестве предварительного иммунопрецитарного контроля для сравнения целевого обогащения после инкубации с сродством матрицы. Поместите предиммунопреционные элементы управления на ротатор трубки при температуре 4 градуса Цельсия на ночь, так же, как иммунопрогцидированные образцы обрабатываются.
  2. Добавьте 200 юаней матрицы сродства к каждому образцу. Будьте особенно осторожны, чтобы resuspend бисернежный пипетки до добавления сродства матрицы для каждого образца. Инкубировать lysates с сродством матрицы на 4 кв' ночь с нежным смешивания на трубе ротатора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен на день после этого шага.

6. Изоляция РНК

  1. Подготовка буфера и установка оборудования
    1. Поместите магнитную стойку при 4 градусах по Цельсию в течение по крайней мере 30 минут, чтобы предварительно охладить и держать стойку на льду на протяжении всего эксперимента.
    2. Рассчитайте количество микроцентрифуговых труб, необходимых и предварительно охладите на льду или при 4 градусах Цельсия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, каждый образец требует 1 микроцентрифугтрубки для окончательной очищенной РНК.
    3. Быстро вращать трубки от шага 5.2 и собирать бисер, поместив на магнитную стойку, по крайней мере 1 мин. Соберите или отбросить супернатант в дополнительных микроцентрифуговых труб.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Собранный супернатант, содержащий несвязанную фракцию, может быть заморожен и храниться при -80 градусов по Цельсию, чтобы сравнить с связанной фракцией для обогащения транскрипта после очистки. Протокол может быть приостановлен после этого шага.
    4. Приготовьте буфер с высоким содержанием соли, добавив 0,5 л/мл 1 М ДТТ и 1 л/мл 0,1 г/мл циклоксимида к буферному запасу с высоким содержанием соли.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого образца требуется 5 мл буфера с высоким содержанием соли.
  2. Изоляция РНК
    1. Добавьте 1 мл свежего буфера с высоким содержанием соли в каждую трубку с последующим нежным пайпеттингом не менее 5 раз без введения пузырьков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Недостаточное мытье может привести к фону несвязанных транскриптов, в то время как введение пузырьков может ускорить деградацию РНК.
    2. Соберите бисер на магнитной подставке в течение 1 мин и удалить супернатант. Повторите шаги стирки с высоким содержанием соли буфера еще 4 раза (в общей сложности 5 раз).
    3. Удалите оставшийся буфер с высокой солью и удалите микроцентрифугные трубки с магнитной стойки и поместите на RT в течение 5 минут, чтобы согреться.
    4. Отреприжить бусы в 100 л буфера лизиса (при условии, в комплекте изоляции РНК) с помощью к-меркаптоэтанола.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Любой комплект изоляции РНК и очистки, содержащий денатурантный генидин тиоцианат, может быть использован в качестве буфера лисиса для высвобождения связанной РНК из матрицы сродства. Извлечение РНК должно быть обработано на RT, так как гуанидин тиоцианат может кристаллизоваться при низких температурах.
    5. Vortex бусы и буфер, по крайней мере 5 с на самой высокой скорости, быстро спина вниз, чтобы собрать буфер на стороне микроцентрифуги трубки и инкубировать бусы с буфером на RT в течение 10 минут, чтобы освободить шарик связаны РНК в лисис буфера.
    6. Соберите бисер на магнитной подставке в течение 1 мин и собирать супернатант, чтобы немедленно приступить к очистке РНК в соответствии с протоколом очистки РНК, как указано в комплекте (Таблица материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Супернатант, содержащий элетированную РНК в буфере излинеза, также может храниться при -80 градусов по Цельсию в течение 1 месяца до очистки путем разогрева до RT при оттаивании.
    7. Для достижения максимального качества изолированной РНК, выполнить все факультативные шаги, включая dNase пищеварения и все шаги elution РНК. Нагрейте буфер elution обеспеченный набором изоляции RNA или RNase-свободной водой до 60 c для максимального спасения РНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изолированная РНК может храниться при -20 градусов по Цельсию в течение 1 месяца или до -80 градусов по Цельсию в течение нескольких лет. Протокол может быть приостановлен после этого шага.

7. Дополнительный анализ качества РНК (Рекомендуется)

  1. Оцените качество РНК с помощью биоанализа11 и количество с помощью спектрофотометра12, чтобы определить, требуется ли повторение процесса иммунопрецитификации для получения достаточной и высококачественной РНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное качество РНК для секвенирования высокой пропускной способности должно следовать протоколам, указанным комплектами подготовки библиотеки и платформами секвенирования.

8. Приложения вниз по течению

ПРИМЕЧАНИЕ: Общая РНК, изолированная протоколом TRAP, может быть использована в ряде стандартных приложений ниже по течению, включая RNA-seq (TRAP-seq). Стандартная обратная транскрипция и количественные протоколы ПЦР также могут быть использованы после TRAP.

  1. Для TRAP-seq, выполнять РНК-сек подготовки библиотеки в соответствии со стандартными методами13.
  2. Для РНК-сек, подготовить кДНК секвенирования библиотек с использованием коммерческих РНК-сек комплекты с олиго d (T) на основе обогащения полиаденелата поли (A) стенограммы. Кроме того, если общее качество РНК ниже, чем рекомендовано для поли(A) обогащения, используйте модули истощения RRNA. Тем не менее, ожидать увидеть больше rRNA выравнивание после секвенирования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Для профиля экспрессии генов в перенаселенности гепатоцитов Фах-/- мышь, Gfp:Rpl10a слияния и Fah трансгены совместно доставлены в транспозон-содержащих плазмид8 (TRAP вектор) к печени гидродинамический впрыск(рисунок 1A). Удаление нитизинона вызывает токсическую травму печени, которая создает давление отбора для гепатоцитов устоиживая FAH, чтобы заселить травмированную паренхима9. Иммунофлуоресцентное окрашивание подтверждает совместное выражение FAH и GFP:RPL10A синтез абелка в перенаселенности гепатоцитов после двух недель репопуляции печени(рисунок 1B).

В следующем репрезентативном эксперименте TRAP-seq был выполнен с использованием тихих и заселенных гепатоцитов мыши. Во-первых, для получения GFP помечены рибосомы от quiescent гепатоцитов, трансгенных РозаLSL-GFP-L10A мышей были введены с AAV8-TBG-Cre 7 дней до жертвы, чтобы вызвать GFP:RPL10A выражение во всех гепатоцитов14. Мы также обработали образец печени, собранный из мыши дикого типа, как отрицательный контроль для обеспечения изоляции перевода мРНК был специфичен, то есть РНК может быть извлечена только из мышей, выражающих GFP:RPL10A. Концентрация изолированной РНК коррелирует с количеством клеток, выражающих синтез белка, с тихим образцом, производящим самый высокий урожай, так как все гепатоциты выражают GFP:RPL10A после инъекции AAV8-TBG-Cre(Рисунок 2A). И наоборот, едва ли КАКАЯ-либо РНК была обнаружена в диких элементов управления типа, которые не имеют Трансгена GFP:RPL10A, что указывает на то, что процедура TRAP очень специфична и имеет низкий фон. Когда TRAP был использован на ткани печени, претерпевающей репопуляцию с помощью GFP:RPL10A-трансумированных гепатоцитов, обильные, высококачественные РНК была получена(рисунок 2B). В отличие от этого, не было обнаружено НИ клиарке биоанализа для отрицательного контрольного образца.

Анализ экспрессии генов вниз по течению может быть проведен с помощью обратной транскрипции и количественного ПЦР или РНК-сек на TRAP-изолированной РНК. Gsta1 кодирует глутатион S-трансферазы, которая играет важную роль для метаболизма глутатиона, основной детоксикации пептид для защиты печени от окислительного стресса ущерб15. Выражение Gsta1 индуцируется более чем в 10 раз в перенаселенности гепатоцитов по сравнению с тихие гепатоциты, в то время как значение порогового цикла (Ct) не было обнаружено с TRAP-изолированной РНК из мыши дикого типа из-за отсутствия входной РНК(Рисунок 3 A), Обратите внимание, что качество РНК может значительно повлиять на анализ экспрессии генов. В случае экспериментов с РНК-сек, оценка качества РНК должна проводиться в соответствии с рекомендациями комплекта подготовки библиотеки и платформы секвенирования(рисунок 3B). Биоанализатор часто используется для определения числа целостности РНК (RIN), с высоким RIN коррелирует с более высокой скоростью мРНК выравнивания к геному(Рисунок 3B, слева), в то время как более низкий RIN приводит к более высокой скорости рибосомных читает, указывая деградация мРНК(рисунок 3B, справа). Рисунок 3 C,D демонстрирует, что TRAP-seq может определить дифференциальную экспрессию генов в quiescent и засекреченных гепатоцитов. Например, выражение Alb ингибируется и экспрессия Afp upregulated во время репопуляции печени, отражая что реплицируя гепатоциты принимают более менее дифференцированное положение для того чтобы ингибировать функции метаболизма печенки во время перенаселение9,16.

Figure 1
Рисунок 1: Реализация TRAP с Fah-/- в профиль изменения экспрессии гена перенаселенности гепатоцитов. (A) Схема выражения GFP:RPL10A синтеза белка с FAH в системе Транспона Спящая красавица с последующим инъекцией в Fah-/- мышь. Зеленые шестиугольники указывают на заселятые гепатоциты со стабильным выражением FAH и GFP:RPL10A, в то время как черные шестиугольники представляют раненых, умирающих гепатоцитов. (B) Представитель иммунофлуоресценции окрашивания демонстрирует коэкспрессонирование GFP помечены рибосомный белок L10A (зеленый) и FAH (красный) в заселении гепатоцитов. Шкала бар 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: TRAP позволяет cell type-специфической изоляции высококачественной РНК. (A) Доходность РНК положительно коррелирует с количеством гепатоцитов, выражающих GFP:RPL10A. Низкая урожайность РНК от мыши дикого типа демонстрирует специфику TRAP из источников без выражения GFP:RPL10A. (B) Биоанализаторные следы общей РНК, изолированной от заселения печени, выражающих GFP:RPL10A и от диких печени типа демонстрируют специфику TRAP. Общая РНК, выделенная из ткани печени дикого типа, лишенная трансгена GFP:RPL10A, показывает, что была собрана минимальная РНК, в то время как трансгено-выражающая ткань обеспечивает достаточное высокое качество РНК. Обратите внимание, что рибосомные пики РНК присутствуют после успешного TRAP10. FU, флуоресценция. RIN, номер целостности РНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: TRAP-изолированная РНК может быть использована для анализа экспрессии генов ниже по течению. (A) Представитель обратной транскрипции и количественных результатов ПЦР Gsta1 в quiescent и заселятых гепатоцитов. Значение Ct не было обнаружено с РНК, изолированных от диких животных типа. (B) Анализ выравнивания изолированной РНК после секвенирования высокой пропускной способности, демонстрируя важность определения целостности РНК после изоляции. Высококачественная РНК приводит к более высокому проценту считываемых мРНК (зеленый), в то время как низкокачественная РНК приводит к гораздо более высокому проценту рибосомных считываний (красный), так как большинство мРНК деградирует. RIN, номер целостности РНК. (C,D) Интегративная Genomics Viewer (IGV) треки РНК-сек читает мРНК сродство очищены от quiescent и заселены гепатоцитов на (C) Alb и (D) Afp loci. Обратите внимание, что 3' прочитано смещение характерно для трубопровода выбора поли (A). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

TRAP-seq является методом для клеточного типа-специфической изоляции перевода мРНК через эпитоп-тегами рибосомы и представляет собой альтернативу faCS подходов, так как он обходит ограничения, такие как временные требования FACS9. Вместо этого, TRAP позволяет быстрой и эффективной изоляции РНК непосредственно от объемных тканей, помогая избежать каких-либо изменений в экспрессии генов. TRAP-seq особенно хорошо подходит для использования в перенаселенности Фах-/- мышь печени, как гепатоцитов расширения после удаления нитизинона является автономной клетки и позволяет экспрессии генов профилирования подмножество гепатоцитов с интегрированной Трансгенов. Вектор TRAP также может быть выражен с геноактивирующими или -глушительными молекулами17, включая кДНК, короткошерстную РНК и руководство РНК, для изучения влияния на глобальную экспрессию гена активации или ингибирования конкретного гена. Кроме того, трансгенная мышь RosaLSL-GFP-L10A обеспечивает возможность профилировать экспрессию генов в любой клетке с активностью рекомбиназы. Так как GFP:RPL10A может быть конкретно выражена в любых клетках, которые выражают Cre, роль других типов клеток в печени во время травмы печени и перенаселения могут быть изучены. Например, пересечение ck19-Cre мыши с трансгенной мышью TRAP может быть использовано для выражения GFP:RPL10A в холангиоцитах, а затем TRAP-seq для изучения изменения экспрессии генов в желчных эпителиях во время процесса перенаселения.

Для обеспечения точного профилирования экспрессии генов крайне важно подготовить все буферы и матрицу сродства до вскрытия тканей. Все шаги должны выполняться на льду с холодными буферами, если иное не указано для обеспечения полисомной стабилизации10 и предотвращения деградации РНК. Все буферы должны быть подготовлены с RNase-бесплатных реагентов и протокол TRAP-seq должны осуществляться в среде, свободной от RNase для предотвращения деградации РНК и низкой урожайности иммунопрористированной РНК. Матрица сродства может быть подготовлена до 2 недель до использования с нежной повторной подвеской на ротаторе трубки на ночь. Особое применение следует предпринять, чтобы не энергично встряхнуть матрицу, чтобы предотвратить нарушение антител-конъюгированных, белка L-покрытие магнитных бусин. Методы подготовки матрицы сродства включают спряжение магнитных бусин овеки с биотинилаповым белком L с последующим инкубированием антител против GFP. Тем не менее, коммерчески доступные белок A / G магнитные бусы могут быть заменены; при использовании пропустите начальный шаг спряжения и перейдите непосредственно к связыванию антител. Кроме того, альтернативные эпитопные метки, по-видимому, осуществимы с вышеуказанным протоколом с соответствующей модификацией.

Существуют различные точки, в которых можно приложить шаг по изоляции РНК и очищению (см. протокол выше). Однако, как только образцы печени были собраны, продолжая иммунопрециститив рекомендуется, как выход изолированных РНК может упасть на 50% с замораживанием на этом этапе10. Ткани должны быть быстро промзаированы с вскрытием буфера, который содержит циклогексимид, чтобы ингибировать перевод мРНК. Недостаточное лиза ткани может также способствовать низкой урожайности РНК. Очень важно гомогенизировать ткани на льду, пока не видны куски ткани с мотором гомогенизатора, обеспечивая при этом минимальную аэрацию10. Кроме того, достаточное мытье с высоким содержанием соли буфер имеет решающее значение для обеспечения удаления неспецифических связывания рибосомных белков в матрице сродства. В том числе дикий тип отрицательного контроля помогает оценить специфику иммунопрециционности и эффективность стирки шагов. Кроме того, использование коммерческого комплекта очистки РНК, который включает в себя лечение DNase без РНК, повысит чистоту РНК.

Кроме того, рекомендуется проверить экспрессию и обилие белка синтеза GFP:RPL10A и оценить количество ткани, необходимой для получения достаточной РНК для анализа вниз по течению. Ткань разделы или lysates могут быть использованы для иммуно-методов обнаружения для проверки выражения GFP:RPL10A. Количество изолированных РНК может варьироваться в зависимости от: (1) количество клеток, выражающих GFP:RPL10A, (2) уровень экспрессии трансгена, и (3) размер и ploidy клеток, выражающих трансген. Экспериментальный эксперимент с использованием половины и удвоить количество рекомендуемого количества ткани может быть полезным в определении оптимального входного лизата для TRAP-seq. В наших руках, мы могли бы получить 150 нг РНК с всего лишь 1-2% гепатоцитов, выражающих GFP:RPL10A от 200 мг перенаселенности Фах-/- печень, представляющие 2 х 105 полиплоидных гепатоцитов с трансгенным выражением9.

Методология TRAP-seq изолирует ribosome-связанный мРНК для профиля пула мРНК клетки. Таким образом, результирующее секвенирование соответствует "транслатому", а не транскриптому. Обратите внимание, что перевод рибосомных следов собираться не будет, так как TRAP выполняется на родных, а не перекрестных комплексах. Если анализы следа желательны, то вышеуказанный протокол должен быть изменен с соответствующими перекрестными ссылками последованных за immunoprecipitation (CLIP) методологиями18. Еще одним ограничением TRAP является требование достаточного количества клеток, выражающих белок синтеза GFP:RPL10A. Для экспериментов, в которых тип клеток небольшой, объединение нескольких биологических образцов может потребоваться для изоляции достаточной РНК, чтобы РНК-сек19. Кроме того, TRAP-seq требует присутствия GFP:RPL10A в типе клеток. Это может создать проблему, если нет конкретной системы доставки в клетки или если клетка типа конкретного промоутера для привода Cre выражение не доступен.

Недавняя разработка одноклеточной технологии РНК-сек (scRNA-seq) позволила прямое секвенирование с последующим определением силико различных типов клеток, что позволило секвенировать без сортировки для конкретных типов клеток интересов20 ,21,22. Тем не менее, scRNA-seq по-прежнему требует диссоциации клеток от органа. В случае Fah-/- модель перенаселения, изоляция перфузии печени и гепатоцитов чрезвычайно сложна и неэффективна из-за хрупкости как раненых, так и репликационных гепатоцитов. В самом деле, мы еще не смогли изолировать достаточно гепатоцитов от Фах- / - мышей, переживаемых репопуляции после гидродинамических инъекций плазмиды Фах. Кроме того, за время, затрагиваемый для обработки тканей, уровни экспрессии генов могут измениться. Протоколы для перфузии печени занимают до 30 минут теплого времени ишемии. Будущие методологии для оптимизации перфузии печени для уменьшения времени обработки и повышения эффективности изоляции могут позволить scRNA-seq интеграции в Fah-/- мышь модель системы и, возможно, для других моделей травм и перенаселения. Это также позволит изучить все типы клеток печени.

В заключение, интеграция TRAP-seq с Fah-/- мышь позволяет конкретной изоляции и экспрессии генов профилирования репликации гепатоцитов для выявления терапевтических целей, которые могли бы способствовать репопуляции печени. Этот метод может быть реализован для изучения других типов клеток в печени и других системах органов для специфической для болезни идентификации изменений экспрессии генов для выявления потенциальных целей наркотиков или биомаркеров. Аналогичная техника может быть использована для сбора ядер от заслатывания гепатоцитов с помощью очистки сродства, а затем для выполнения эпигенетического анализа этих конкретных клеток16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана следующими грантами: F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (АМЗ), K08-DK106478 (KJW) и P30-DK050306 (пилотный грант KJW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated DWK Life Sciences (Wheaton) 358007
Absolutely RNA Miniprep Kit Agilent 400800
Anti-GFP antibodies Memorial Sloan-Kettering Antibody & Bioresource Core GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7
Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free Jackson ImmunoResearch 001-000-162
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836170001
Cycloheximide Millipore Sigma C7698
Deoxycholic acid, DOC Millipore Sigma D2510
D-Glucose, Dextrose Fisher Scientific D16
DL-Dithiothreitol Millipore Sigma D9779
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 Thermo Fisher Scientific 65602
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Fisher Scientific FB0875712
HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red Thermo Fisher Scientific 14065-056
HEPES, 1 M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific Thermo Fisher Scientific AAJ16924AE
Magnesium chloride, MgCl2  Millipore Sigma M8266
Methanol Fisher Scientific A452
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific VV-83061-00
NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module New England BioLabs E7490S
NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina New England BioLabs E7530S
Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630 Millipore Sigma I8896
Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated Ambion AM9932
Overhead Stirrer DWK Life Sciences (Wheaton) 903475
PBS Buffer (10x), pH 7.4 Ambion AM9625
Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated Thermo Fisher Scientific 29997
Potassium chloride, KCl Millipore Sigma P4504
RNA 6000 Pico Kit & Reagents Agilent 5067-1513
RNaseZap RNase Decontamination Solution Invitrogen AM9780
RNasin Ribonuclease Inhibitors Promega N2515
Sodium azide, NaN3 Millipore Sigma S2002
Sodium bicarbonate, NaHCO3 Millipore Sigma S6297
SUPERase·In RNase Inhibitor Invitrogen AM2694

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, (10), 836-847 (2004).
  2. Lee, W. M. Etiologies of acute liver failure. Seminars in Liver Disease. 28, (2), 142-152 (2008).
  3. Sanyal, A. J., Yoon, S. K., Lencioni, R. The etiology of hepatocellular carcinoma and consequences for treatment. The Oncologist. 15 Suppl 4, 14-22 (2010).
  4. Jadlowiec, C. C., Taner, T. Liver transplantation: Current status and challenges. World Journal of Gastroenterology. 22, (18), 4438-4445 (2016).
  5. Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. Liver regeneration. Science. 276, (5309), 60-66 (1997).
  6. Michalopoulos, G. K. Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas. The American Journal of Pathology. 176, (1), 2-13 (2010).
  7. Grompe, M., et al. Loss of fumarylacetoacetate hydrolase is responsible for the neonatal hepatic dysfunction phenotype of lethal albino mice. Genes & Development. 7, (12A), 2298-2307 (1993).
  8. Wangensteen, K. J., et al. A facile method for somatic, lifelong manipulation of multiple genes in the mouse liver. Hepatology. 47, (5), 1714-1724 (2008).
  9. Wang, A. W., et al. TRAP-seq identifies cystine/glutamate antiporter as a driver of recovery from liver injury. The Journal of Clinical Investigation. 128, (6), 2297-2309 (2018).
  10. Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9, (6), 1282-1291 (2014).
  11. Agilent Technologies. Agilent RNA 6000 Pico: User Manual. Retrieved from https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90046_RNA600Pico_KG_EN.pdf (2016).
  12. NEBNext. NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina: User Manual. Retrieved from https://international.neb.com/-/media/nebus/files/manuals/manuale7530.pdf (2018).
  13. NanoDrop. 2000/2000c Spectrophotomerter: User Manual. Retrieved from https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CAD/manuals/NanoDrop-2000-User-Manual-EN.pdf (2009).
  14. Liu, J., et al. Cell-specific translational profiling in acute kidney injury. The Journal of Clinical Investigation. 124, (3), 1242-1254 (2014).
  15. Lu, S. C. Regulation of glutathione synthesis. Molecular Aspects of Medicine. 30, (1-2), 42-59 (2009).
  16. Wang, A. W., et al. The dynamic chromatin architecture of the regenerating liver. bioRxiv. (2019).
  17. Zahm, A. M., et al. A high-content in vivo screen to identify microRNA epistasis in the repopulating mouse liver. bioRxiv. (2019).
  18. Stork, C., Zheng, S. Genome-Wide Profiling of RNA-Protein Interactions Using CLIP-Seq. Methods in Molecular Biology. 1421, 137-151 (2016).
  19. Zhao, X., et al. Glutathione antioxidant pathway activity and reserve determine toxicity and specificity of the biliary toxin biliatresone in zebrafish. Hepatology. 64, (3), 894-907 (2016).
  20. Halpern, K. B., et al. Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver. Nature. 542, (7641), 352-356 (2017).
  21. Camp, J. G., et al. Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency. Nature. 546, (7659), 533-538 (2017).
  22. Wang, Y. J., Kaestner, K. H. Single-Cell RNA-Seq of the Pancreatic Islets--a Promise Not yet Fulfilled? Cell Metabolism. 29, (3), 539-544 (2019).
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, A. W., Zahm, A. M., Wangensteen, K. J. Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver. J. Vis. Exp. (151), e60242, doi:10.3791/60242 (2019).More

Wang, A. W., Zahm, A. M., Wangensteen, K. J. Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver. J. Vis. Exp. (151), e60242, doi:10.3791/60242 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter