Сотовый тип-специфический Джин Выражение Профилирование в печени мыши
Summary
Перевод рибосомной очистки сродства (TRAP) обеспечивает быструю и эффективную изоляцию клеточного типа переноса мРНК. Здесь мы демонстрируем метод, который сочетает в себе гидродинамические инъекции хвостовой вена в мышиной модели репопуляции печени и TRAP для изучения экспрессии профиля перенаселенности гепатоцитов.
Abstract
Репопуляция печени после травмы является важной особенностью млекопитающих, которая предотвращает немедленную отказ органов и смерть после воздействия токсинов окружающей среды. Более глубокое понимание изменений в экспрессии генов, которые происходят во время репопуляции может помочь определить терапевтические цели для содействия восстановлению функции печени в обстановке травм. Тем не менее, методы изоляции конкретно перенаселенности гепатоцитов тормозятся отсутствием клеточных маркеров, ограниченным и хрупкость этих клеток. Развитие технологии очистки рибосомы сродства (TRAP) в сочетании с моделью мыши для повторения репопуляции при настройке травмы печени позволяет профилировать экспрессию генов в перенаселенности Гепатоцитов. С TRAP, тип клеток конкретных перевода мРНК быстро и эффективно изолированы. Мы разработали метод, который использует TRAP с сродством основе изоляции перевода мРНК от гепатоцитов, которые избирательно выразить зеленый флуоресцентный белок (GFP) помечены рибосомный белок (RP), GFP:RPL10A. TRAP обходит длительный период времени, необходимый для сортировки клеток, активированных флуоресценцией, который может изменить профиль экспрессии гена. Кроме того, поскольку только перенаселенности гепатоцитов выражают GFP:RPL10A синтез белка, изолированные мРНК лишен загрязнения от окружающих поврежденных гепатоцитов и других типов клеток в печени. Сродство очищенной мРНК имеет высокое качество и позволяет ниже по течению ПЦР- или высокой пропускной способности на основе анализа экспрессии генов.
Introduction
Как основной метаболический орган у позвоночных, печень отвечает за гомеостаз глюкозы, синтез белка сыворотки, секрецию желчных кислот, ксенобиотический метаболизм и детоксикацию. Печень обладает чрезвычайной способностью к регенерации травмированной паренхимы при воздействии токсинов, чтобы предотвратить немедленную печеночную недостаточность1. Однако сбой регенерации может произойти при возникновении ацетаминофена или алкогольного чрезмерного потребления, что может привести к острой печеночной недостаточности2. Кроме того, хроническая травма печени, вызванная вирусной инфекцией гепатита, жировой болезнью печени и стеатогепатитом, может вызвать фиброз печени, цирроз и гепатоцеллюлялическую карциному3. Единственным доступным лечебным лечением заболевания печени на конечном этапе является трансплантация, но она ограничена нехваткой органов, что препятствует эффективному лечению для всех пациентов4. Более глубокое понимание процесса восстановления после токсической травмы печени, следовательно, имеет решающее значение для развития лечения, чтобы стимулировать регенерацию достаточно, чтобы спасти функцию в больном органе.
Наиболее широко применяемой модельной системой для изучения регенерации печени является частичная гепатэктомия у грызунов, при которой значительная часть печени резецируется для стимуляции быстрого расширения гепатоцитов5. Тем не менее, частичная гепатэктомия не резюмирует расширение гепатоцитов после токсической травмы печени из-за отсутствия инфильтрации иммунных клеток и некроза клеток гепатоцитов, часто наблюдаемых при установлении острой травмы печени у людей6. Более подходящей системой для моделирования этой формы обновления органов является Fah-/- мышь, которая не имеет функциональной гидролазы фумарицетоацета (FAH), необходимой для правильного метаболизма тирозинов и развивает серьезные повреждения печени, приводящие к смерти7. Эти мыши могут поддерживаться в здоровом состоянии на неопределенный срок путем лечения препаратом нитинон в питьевой воде. Кроме того, выражение FAH может быть восстановлено трансгенной доставкой в подмножество гепатоцитов, которые будут расширяться, чтобы заселить печень после удаления нитисинона8.
Для профиля изменения экспрессии генов перенаселенности гепатоцитов, инструмент для специального изолировать репликации гепатоцитов в Фах-/- мышь без загрязнения от соседних раненых гепатоцитов и других типов клеток не требуется. К сожалению, флуоресценция при содействии клеточной сортировки (FACS) гепатоцитов трудно, так как (1) хрупкость перенаселенности гепатоцитов приводит к плохому восстановлению после перфузии печени, (2) репликации гепатоцитов весьма изменчивы по размеру, что делает изоляцию чистой популяции FACS трудно, и (3) процедура время от перфузии печени до изоляции РНК больше, чем 2 ч, следовательно, профили экспрессии генов могут претерпеть существенные искусственные изменения, прежде чем образцы приобретены9.
Кроме того, выражение эпитоп-тегами рибосом, специально в перенаселенности гепатоцитов позволяет быстро изоляции активно перевод яРНК связаны рибосомы с помощью сродства очистки сразу после сбора органов, с объемной печени тл. Здесь мы описываем протокол для выполнения очистки сродства с сородия для перевода (TRAP)10 с последующим высокой пропускной способностью РНК-секвенирования (TRAP-seq), чтобы специально изолировать и профиль мРНК в перенаселенности гепатоцитов в Фах-/- мышь9. Коэкспрессия зеленого флуоресцентного белка помечены рибосомный белок (GFP:RPL10A) с FAH позволяет сродство очистки перевода мРНК связаны полисомы, содержащие GFP:RPL10A. Этот метод позволяет избежать любых клеточных этапов диссоциации, таких как перфузия печени, чтобы изолировать хрупкие перенаселенности гепатоцитов. Вместо этого, он использует лисис целой ткани органа и антител, чтобы быстро извлечь РНК специально из клеток-мишеней. Наконец, изоляция обильной, высококачественной мРНК через TRAP-seq позволяет приложениям вниз по течению, таким как анализ секвенирования, профилировать динамическое изменение экспрессии генов в процессе перенаселения.
Protocol
Representative Results
Discussion
TRAP-seq является методом для клеточного типа-специфической изоляции перевода мРНК через эпитоп-тегами рибосомы и представляет собой альтернативу faCS подходов, так как он обходит ограничения, такие как временные требования FACS9. Вместо этого, TRAP позволяет быстрой и эффективной …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана следующими грантами: F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (АМЗ), K08-DK106478 (KJW) и P30-DK050306 (пилотный грант KJW).
Materials
| 10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated | DWK Life Sciences (Wheaton) | 358007 | |
| Absolutely RNA Miniprep Kit | Agilent | 400800 | |
| Anti-GFP antibodies | Memorial Sloan-Kettering Antibody & Bioresource Core | GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7 | |
| Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Cycloheximide | Millipore Sigma | C7698 | |
| Deoxycholic acid, DOC | Millipore Sigma | D2510 | |
| D-Glucose, Dextrose | Fisher Scientific | D16 | |
| DL-Dithiothreitol | Millipore Sigma | D9779 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Thermo Fisher Scientific | 65602 | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| HEPES, 1M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific | Thermo Fisher Scientific | AAJ16924AE | |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Millipore Sigma | M8266 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | VV-83061-00 | |
| NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module | New England BioLabs | E7490S | |
| NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7530S | |
| Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630 | Millipore Sigma | I8896 | |
| Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated | Ambion | AM9932 | |
| Overhead Stirrer | DWK Life Sciences (Wheaton) | 903475 | |
| PBS Buffer (10x), pH 7.4 | Ambion | AM9625 | |
| Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated | Thermo Fisher Scientific | 29997 | |
| Potassium chloride, KCl | Millipore Sigma | P4504 | |
| RNA 6000 Pico Kit & Reagents | Agilent | 5067-1513 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitors | Promega | N2515 | |
| Sodium azide, NaN3 | Millipore Sigma | S2002 | |
| Sodium bicarbonate, NaHCO3 | Millipore Sigma | S6297 | |
| SUPERase·In RNase Inhibitor | Invitrogen | AM2694 | |
References
- Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).
- Lee, W. M. Etiologies of acute liver failure. Seminars in Liver Disease. 28 (2), 142-152 (2008).
- Sanyal, A. J., Yoon, S. K., Lencioni, R. The etiology of hepatocellular carcinoma and consequences for treatment. The Oncologist. 15 Suppl 4, 14-22 (2010).
- Jadlowiec, C. C., Taner, T. Liver transplantation: Current status and challenges. World Journal of Gastroenterology. 22 (18), 4438-4445 (2016).
- Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. Liver regeneration. Science. 276 (5309), 60-66 (1997).
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas. The American Journal of Pathology. 176 (1), 2-13 (2010).
- Grompe, M., et al. Loss of fumarylacetoacetate hydrolase is responsible for the neonatal hepatic dysfunction phenotype of lethal albino mice. Genes & Development. 7 (12A), 2298-2307 (1993).
- Wangensteen, K. J., et al. A facile method for somatic, lifelong manipulation of multiple genes in the mouse liver. Hepatology. 47 (5), 1714-1724 (2008).
- Wang, A. W., et al. TRAP-seq identifies cystine/glutamate antiporter as a driver of recovery from liver injury. The Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2297-2309 (2018).
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).
- Agilent Technologies. . Agilent RNA 6000 Pico: User Manual. , (2016).
- NEBNext. . NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina: User Manual. , (2018).
- NanoDrop. . 2000/2000c Spectrophotomerter: User Manual. , (2009).
- Liu, J., et al. Cell-specific translational profiling in acute kidney injury. The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1242-1254 (2014).
- Lu, S. C. Regulation of glutathione synthesis. Molecular Aspects of Medicine. 30 (1-2), 42-59 (2009).
- Wang, A. W., et al. The dynamic chromatin architecture of the regenerating liver. bioRxiv. , (2019).
- Zahm, A. M., et al. A high-content in vivo screen to identify microRNA epistasis in the repopulating mouse liver. bioRxiv. , (2019).
- Stork, C., Zheng, S. Genome-Wide Profiling of RNA-Protein Interactions Using CLIP-Seq. Methods in Molecular Biology. 1421, 137-151 (2016).
- Zhao, X., et al. Glutathione antioxidant pathway activity and reserve determine toxicity and specificity of the biliary toxin biliatresone in zebrafish. Hepatology. 64 (3), 894-907 (2016).
- Halpern, K. B., et al. Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver. Nature. 542 (7641), 352-356 (2017).
- Camp, J. G., et al. Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency. Nature. 546 (7659), 533-538 (2017).
- Wang, Y. J., Kaestner, K. H. Single-Cell RNA-Seq of the Pancreatic Islets–a Promise Not yet Fulfilled?. Cell Metabolism. 29 (3), 539-544 (2019).
