Celltypspecifika gen uttrycks profilering i mus levern
Summary
Att översätta ribosom affinitetsrening (fälla) möjliggör snabb och effektiv isolering av celltypspecifika översätta mRNA. Här visar vi en metod som kombinerar hydrodynamisk svans-ven injektion i en musmodell av lever återinsättning och fälla för att undersöka uttrycks profilen för återinplantering hepatocyter.
Abstract
Lever återinsättning efter skada är ett viktigt inslag i däggdjur som förhindrar omedelbar organsvikt och död efter exponering av miljögifter. En djupare förståelse av de förändringar i genuttryck som uppstår under återinsättning kan bidra till att identifiera terapeutiska mål för att främja återställande av leverfunktionen vid fastställandet av skador. Icke desto mindre, metoder för att isolera specifikt återinplantering hepatocyter hämmas av en brist på cell markörer, begränsade cell nummer, och bräcklighet av dessa celler. Utvecklingen av att översätta ribosomteknik för affinitetsrening (trap) tillsammans med Fah-/-mus- modellen för att recapitulera återinsättning vid fastställandet av leverskada medger profilering av genuttryck för återinplantering Hepatocyter. Med TRAP, celltyp-specifika översätta mRNA är snabbt och effektivt isolerade. Vi utvecklade en metod som utnyttjar FÄLLAN med affinitetsbaserad isolering av översätta mRNA från hepatocyter som selektivt uttrycker den gröna fluorescerande protein (GFP)-märkta ribosomal protein (RP), GFP: RPL10A. TRAP kringgår den långa tidsperiod som krävs för fluorescensaktiverad cell sortering som kan förändra gen uttrycks profilen. Dessutom, eftersom endast de återinplantering hepatocyter uttrycka GFP: RPL10A fusionsprotein, den isolerade mRNA saknar förorening från omgivande skadade hepatocyter och andra celltyper i levern. Den affinitetsrenade mRNA är av hög kvalitet och medger nedströms PCR-eller högflödesekvensbaserad analys av genuttryck.
Introduction
Som den viktigaste metaboliska organ hos ryggradsdjur, levern är ansvarig för glukos homeostas, serumprotein syntes, Gall syra sekretion, och xenobiotiska metabolism och avgiftning. Levern besitter en extraordinär förmåga att regenerera den skadade parenkymet vid exponering för toxiner för att förhindra omedelbar leversvikt1. Emellertid, misslyckande regenerering kan inträffa i inställningen av paracetamol eller alkohol överkonsumtion, vilket kan leda till akut leversvikt2. Dessutom, kronisk leverskada orsakad av Viral hepatit infektion, fet leversjukdom, och steatohepatit kan orsaka leverfibros, cirros, och Hepatocellulär cancer3. Den enda tillgängliga kurativ behandling för slutstadiet leversjukdom är transplantation men begränsas av organbrist, förhindra effektiv behandling för alla patienter4. En bättre förståelse av återhämtningsprocessen efter toxisk leverskada är därför avgörande för utvecklingen av behandlingar för att stimulera förnyelse tillräcklig för att rädda funktion i sjuka organ.
Den mest allmänt tillämpade modellsystem för studiet av lever förnyelse är partiell hepatektomi hos gnagare, där en stor del av levern är resected att stimulera snabb hepatocyte expansion5. Emellertid, partiell hepatektomi inte recapitulate hepatocyte expansion efter toxisk leverskada på grund av bristen på immun cell infiltration och hepatocyte cell nekros ofta observerats i fastställandet av akut leverskada hos människor6. Ett mer lämpligt system för att modellera denna form av orgel förnyelse är Fah-/- mus, som saknar funktionell fumarylacetoacetat hydrolas (Fah) krävs för korrekt tyrosin metabolism och utvecklar allvarliga leverskador som leder till döden7. Dessa möss kan upprätthållas i ett hälsosamt tillstånd på obestämd tid genom behandling med drogen nitisinon i dricksvattnet. Alternativt kan Fah uttryck återställas genom transgenens leverans till en delmängd av hepatocyter, som kommer att expandera för att återbefolka levern vid nitisinon avlägsnande8.
För att profilera gen uttrycks förändringar av återinplantering hepatocyter, ett verktyg för att specifikt isolera replikerande hepatocyter i Fah-/- mus utan kontaminering från angränsande skadade hepatocyter och andra celltyper krävs. Tyvärr, fluorescens-Assisted cell sortering (FACS) av hepatocyter är svårt eftersom (1) bräcklighet återinplantering hepatocyter leder till dålig återhämtning efter levern perfusion, (2) replikerande hepatocyter är mycket varierande i storlek, vilket gör isolering av en ren population av FACS svårt, och (3) förfarandet tid från levern perfusion till RNA isolering är större än 2 h, därav genuttrycksprofiler kan genomgå betydande konstgjorda förändringar innan proverna förvärvas9.
Alternativt, uttrycket av Epitope-märkta ribosomer specifikt i återinplantering hepatocyter möjliggör en snabb isolering av aktivt översätta mRNA bunden av ribosomer med hjälp av affinitetsrening omedelbart efter organskörd, med bulk lever vävnad Lysates. Här beskriver vi ett protokoll för att utföra översätter-ribosome affinitetsrening (trap)10 följt av hög genomströmning RNA-sekvensering (trap-SEQ), att specifikt isolera och profilera mRNA i återinplantering hepatocyter i Fah-/- mus9. Coexpression av grönt fluorescerande protein-märkta ribosomalt protein (GFP: RPL10A) med FAH kan affinitetsrening av översätta mRNA bunden av polysomer som innehåller GFP: RPL10A. Denna metod undviker alla cell dissociation steg, såsom lever perfusion att isolera bräckliga återinplantering hepatocyter. Istället, det använder lys av hela orgel vävnad och antikroppar för att snabbt extrahera RNA specifikt från målcellerna. Slutligen, isolering av riklig, hög kvalitet mRNA via TRAP-SEQ möjliggör nedströms applikationer såsom sekvenserings analys för att profilera den dynamiska förändringen av genuttryck under återbefolkningsprocessen.
Protocol
Representative Results
Discussion
TRAP-SEQ är en teknik för celltypspecifik isolering av översättning av mRNA via Epitope-märkta ribosomer och utgör ett alternativ till FACS metoder, eftersom det kringgår begränsningar såsom tids krav för FACS9. Istället, fälla tillåter snabb och effektiv isolering av RNA direkt från bulk vävnader, hjälper till att undvika eventuella förändringar i genuttryck. Trap-SEQ är särskilt väl lämpad för användning i återinplantering Fah-/- mus lever, som hepat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av följande bidrag: F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (AMZ), K08-DK106478 (KJW), och P30-DK050306 (pilot Grant till KJW).
Materials
| 10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated | DWK Life Sciences (Wheaton) | 358007 | |
| Absolutely RNA Miniprep Kit | Agilent | 400800 | |
| Anti-GFP antibodies | Memorial Sloan-Kettering Antibody & Bioresource Core | GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7 | |
| Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Cycloheximide | Millipore Sigma | C7698 | |
| Deoxycholic acid, DOC | Millipore Sigma | D2510 | |
| D-Glucose, Dextrose | Fisher Scientific | D16 | |
| DL-Dithiothreitol | Millipore Sigma | D9779 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Thermo Fisher Scientific | 65602 | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| HEPES, 1M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific | Thermo Fisher Scientific | AAJ16924AE | |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Millipore Sigma | M8266 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | VV-83061-00 | |
| NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module | New England BioLabs | E7490S | |
| NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7530S | |
| Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630 | Millipore Sigma | I8896 | |
| Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated | Ambion | AM9932 | |
| Overhead Stirrer | DWK Life Sciences (Wheaton) | 903475 | |
| PBS Buffer (10x), pH 7.4 | Ambion | AM9625 | |
| Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated | Thermo Fisher Scientific | 29997 | |
| Potassium chloride, KCl | Millipore Sigma | P4504 | |
| RNA 6000 Pico Kit & Reagents | Agilent | 5067-1513 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitors | Promega | N2515 | |
| Sodium azide, NaN3 | Millipore Sigma | S2002 | |
| Sodium bicarbonate, NaHCO3 | Millipore Sigma | S6297 | |
| SUPERase·In RNase Inhibitor | Invitrogen | AM2694 | |
References
- Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).
- Lee, W. M. Etiologies of acute liver failure. Seminars in Liver Disease. 28 (2), 142-152 (2008).
- Sanyal, A. J., Yoon, S. K., Lencioni, R. The etiology of hepatocellular carcinoma and consequences for treatment. The Oncologist. 15 Suppl 4, 14-22 (2010).
- Jadlowiec, C. C., Taner, T. Liver transplantation: Current status and challenges. World Journal of Gastroenterology. 22 (18), 4438-4445 (2016).
- Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. Liver regeneration. Science. 276 (5309), 60-66 (1997).
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas. The American Journal of Pathology. 176 (1), 2-13 (2010).
- Grompe, M., et al. Loss of fumarylacetoacetate hydrolase is responsible for the neonatal hepatic dysfunction phenotype of lethal albino mice. Genes & Development. 7 (12A), 2298-2307 (1993).
- Wangensteen, K. J., et al. A facile method for somatic, lifelong manipulation of multiple genes in the mouse liver. Hepatology. 47 (5), 1714-1724 (2008).
- Wang, A. W., et al. TRAP-seq identifies cystine/glutamate antiporter as a driver of recovery from liver injury. The Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2297-2309 (2018).
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).
- Agilent Technologies. . Agilent RNA 6000 Pico: User Manual. , (2016).
- NEBNext. . NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina: User Manual. , (2018).
- NanoDrop. . 2000/2000c Spectrophotomerter: User Manual. , (2009).
- Liu, J., et al. Cell-specific translational profiling in acute kidney injury. The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1242-1254 (2014).
- Lu, S. C. Regulation of glutathione synthesis. Molecular Aspects of Medicine. 30 (1-2), 42-59 (2009).
- Wang, A. W., et al. The dynamic chromatin architecture of the regenerating liver. bioRxiv. , (2019).
- Zahm, A. M., et al. A high-content in vivo screen to identify microRNA epistasis in the repopulating mouse liver. bioRxiv. , (2019).
- Stork, C., Zheng, S. Genome-Wide Profiling of RNA-Protein Interactions Using CLIP-Seq. Methods in Molecular Biology. 1421, 137-151 (2016).
- Zhao, X., et al. Glutathione antioxidant pathway activity and reserve determine toxicity and specificity of the biliary toxin biliatresone in zebrafish. Hepatology. 64 (3), 894-907 (2016).
- Halpern, K. B., et al. Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver. Nature. 542 (7641), 352-356 (2017).
- Camp, J. G., et al. Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency. Nature. 546 (7659), 533-538 (2017).
- Wang, Y. J., Kaestner, K. H. Single-Cell RNA-Seq of the Pancreatic Islets–a Promise Not yet Fulfilled?. Cell Metabolism. 29 (3), 539-544 (2019).
