Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Celltypspecifika gen uttrycks profilering i mus levern

Published: September 17, 2019 doi: 10.3791/60242

Summary

Att översätta ribosom affinitetsrening (fälla) möjliggör snabb och effektiv isolering av celltypspecifika översätta mRNA. Här visar vi en metod som kombinerar hydrodynamisk svans-ven injektion i en musmodell av lever återinsättning och fälla för att undersöka uttrycks profilen för återinplantering hepatocyter.

Abstract

Lever återinsättning efter skada är ett viktigt inslag i däggdjur som förhindrar omedelbar organsvikt och död efter exponering av miljögifter. En djupare förståelse av de förändringar i genuttryck som uppstår under återinsättning kan bidra till att identifiera terapeutiska mål för att främja återställande av leverfunktionen vid fastställandet av skador. Icke desto mindre, metoder för att isolera specifikt återinplantering hepatocyter hämmas av en brist på cell markörer, begränsade cell nummer, och bräcklighet av dessa celler. Utvecklingen av att översätta ribosomteknik för affinitetsrening (trap) tillsammans med Fah-/-mus- modellen för att recapitulera återinsättning vid fastställandet av leverskada medger profilering av genuttryck för återinplantering Hepatocyter. Med TRAP, celltyp-specifika översätta mRNA är snabbt och effektivt isolerade. Vi utvecklade en metod som utnyttjar FÄLLAN med affinitetsbaserad isolering av översätta mRNA från hepatocyter som selektivt uttrycker den gröna fluorescerande protein (GFP)-märkta ribosomal protein (RP), GFP: RPL10A. TRAP kringgår den långa tidsperiod som krävs för fluorescensaktiverad cell sortering som kan förändra gen uttrycks profilen. Dessutom, eftersom endast de återinplantering hepatocyter uttrycka GFP: RPL10A fusionsprotein, den isolerade mRNA saknar förorening från omgivande skadade hepatocyter och andra celltyper i levern. Den affinitetsrenade mRNA är av hög kvalitet och medger nedströms PCR-eller högflödesekvensbaserad analys av genuttryck.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Som den viktigaste metaboliska organ hos ryggradsdjur, levern är ansvarig för glukos homeostas, serumprotein syntes, Gall syra sekretion, och xenobiotiska metabolism och avgiftning. Levern besitter en extraordinär förmåga att regenerera den skadade parenkymet vid exponering för toxiner för att förhindra omedelbar leversvikt1. Emellertid, misslyckande regenerering kan inträffa i inställningen av paracetamol eller alkohol överkonsumtion, vilket kan leda till akut leversvikt2. Dessutom, kronisk leverskada orsakad av Viral hepatit infektion, fet leversjukdom, och steatohepatit kan orsaka leverfibros, cirros, och Hepatocellulär cancer3. Den enda tillgängliga kurativ behandling för slutstadiet leversjukdom är transplantation men begränsas av organbrist, förhindra effektiv behandling för alla patienter4. En bättre förståelse av återhämtningsprocessen efter toxisk leverskada är därför avgörande för utvecklingen av behandlingar för att stimulera förnyelse tillräcklig för att rädda funktion i sjuka organ.

Den mest allmänt tillämpade modellsystem för studiet av lever förnyelse är partiell hepatektomi hos gnagare, där en stor del av levern är resected att stimulera snabb hepatocyte expansion5. Emellertid, partiell hepatektomi inte recapitulate hepatocyte expansion efter toxisk leverskada på grund av bristen på immun cell infiltration och hepatocyte cell nekros ofta observerats i fastställandet av akut leverskada hos människor6. Ett mer lämpligt system för att modellera denna form av orgel förnyelse är Fah-/- mus, som saknar funktionell fumarylacetoacetat hydrolas (Fah) krävs för korrekt tyrosin metabolism och utvecklar allvarliga leverskador som leder till döden7. Dessa möss kan upprätthållas i ett hälsosamt tillstånd på obestämd tid genom behandling med drogen nitisinon i dricksvattnet. Alternativt kan Fah uttryck återställas genom transgenens leverans till en delmängd av hepatocyter, som kommer att expandera för att återbefolka levern vid nitisinon avlägsnande8.

För att profilera gen uttrycks förändringar av återinplantering hepatocyter, ett verktyg för att specifikt isolera replikerande hepatocyter i Fah-/- mus utan kontaminering från angränsande skadade hepatocyter och andra celltyper krävs. Tyvärr, fluorescens-Assisted cell sortering (FACS) av hepatocyter är svårt eftersom (1) bräcklighet återinplantering hepatocyter leder till dålig återhämtning efter levern perfusion, (2) replikerande hepatocyter är mycket varierande i storlek, vilket gör isolering av en ren population av FACS svårt, och (3) förfarandet tid från levern perfusion till RNA isolering är större än 2 h, därav genuttrycksprofiler kan genomgå betydande konstgjorda förändringar innan proverna förvärvas9.

Alternativt, uttrycket av Epitope-märkta ribosomer specifikt i återinplantering hepatocyter möjliggör en snabb isolering av aktivt översätta mRNA bunden av ribosomer med hjälp av affinitetsrening omedelbart efter organskörd, med bulk lever vävnad Lysates. Här beskriver vi ett protokoll för att utföra översätter-ribosome affinitetsrening (trap)10 följt av hög genomströmning RNA-sekvensering (trap-SEQ), att specifikt isolera och profilera mRNA i återinplantering hepatocyter i Fah-/- mus9. Coexpression av grönt fluorescerande protein-märkta ribosomalt protein (GFP: RPL10A) med FAH kan affinitetsrening av översätta mRNA bunden av polysomer som innehåller GFP: RPL10A. Denna metod undviker alla cell dissociation steg, såsom lever perfusion att isolera bräckliga återinplantering hepatocyter. Istället, det använder lys av hela orgel vävnad och antikroppar för att snabbt extrahera RNA specifikt från målcellerna. Slutligen, isolering av riklig, hög kvalitet mRNA via TRAP-SEQ möjliggör nedströms applikationer såsom sekvenserings analys för att profilera den dynamiska förändringen av genuttryck under återbefolkningsprocessen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alla metoder som involverar användning av möss är förenliga med de riktlinjer som tillhandahålls av IACUC av Penn Office of Animal Welfare vid University of Pennsylvania.

1. beredning av reagens

  1. Kungliga Automobilklubben
    1. För att göra 500 μl av 0,1 g/ml cykloheximid, suspendera 50 mg Kungliga Automobilklubben i 500 μl metanol.
      Försiktighet: Cykloheximid är extremt giftigt för miljön och kan orsaka medfödd missbildning. Allt avfall och buffertar som innehåller cykloheximid bör samlas in för korrekt bortskaffande.
      Anmärkning: Cykloheximid kan förvaras vid 4 ° c i upp till 1 dag. Cycloheximide hämmar översättningen.
  2. Ditiothreitol (DTT)
    1. För att göra 1 mL 1 M DTT, suspendera 0,15 g DTT pulver i RNase-fritt vatten.
      Försiktighet: DTT kan orsaka irritation på hud, ögon och andningsvägar.
      Anmärkning: DTT är ett rengöringsmedel. DTT kan förvaras vid-20 ° c. Det rekommenderas att lagra 1 M DTT i engångs-portioner av 50 μL.
  3. Deoxycholate (DOC)
    1. För att göra 10% DOC, suspendera 1 g DOC i ett 50 mL koniskt rör och tillsätt RNase-fritt vatten upp till 10 mL. Skaka kraftigt tills pulvret är upplöst.
      Anmärkning: 10% DOC-lösningen är svagt gul och kan förvaras i rumstemperatur (RT) i upp till 1 år. DOC används för nukleär Lys.
  4. GFP-antikroppar
    1. Aliquot GFP-antikroppar vid användning för första gången. Snap frysa alikvoter och förvara vid-80 ° c.
      Anmärkning: Det rekommenderas att lagra 50 μg GFP-antikroppar i engångs-portioner.
  5. B biotinylerat protein L
    1. Omsuspendera biotinylerat protein L i 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att göra den slutliga koncentrationen 1 μg/μL.
      Anmärkning: Återsuspenderad lösning kan förvaras vid-20 ° c i upp till 6 månader.

2. förberedelse av buffert

  1. Bovint serum albumin (BSA) buffert
    1. För att göra 50 mL 3% BSA-buffert, tillsätt 1,5 g IgG-och proteasfritt BSA-pulver till 40 mL PBS följt av Vortex. När BSA är upplöst, tillsätt PBS till en slutlig volym av 50 mL.
      Anmärkning: BSA-bufferten kan förvaras vid 4 ° c i upp till sex månader.
  2. Dissekera buffert
    1. För att göra 50 mL dissektion buffertlager, kombinera 5 mL 10X Hank ' s balanserade saltlösning (HBSS), 125 μL av 1 M 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic syra (HEPES), 1 750 μL av 1 M glukos, och 200 μL av 1 M NaHCO3. Tillsätt RNase-fritt vatten till en slutlig volym av 50 mL.
      Anmärkning: Dissekbuffertlagret kan förvaras vid 4 ° c i upp till sex månader.
    2. Omedelbart före användning, tillsätt 100 μg/mL 0,1 g/mL cykloheximid och håll på isen.
  3. Hög salthalt buffert
    1. För att göra 50 mL av högsalt buffertlager, tillsätt 1 mL 1 M HEPES, 8,75 mL 2 M KCl, 500 μL av 1 M MgCl2, och 500 μL av 100% nonylfenyl polyetylenglykol (tabell över material) till RNase-fritt vatten.
      Anmärkning: Buffertlagret med hög salt kan förvaras vid 4 ° c i upp till sex månader.
    2. Tillsätt omedelbart före användning 0,5 μL/mL 1 M DTT och 1 μL/mL 0,1 g/mL cykloheximid. Håll den färska höga saltbufferten på isen.
  4. Låg salthalt buffert
    1. För att göra 50 mL av låg salthalt buffertlager, tillsätt 1 mL 1 M HEPES, 3,75 mL 2 M KCl, 500 μL av 1 M MgCl2, och 500 μL av 100% nonylfenyl polyetylenglykol till 44,25 ml av RNase-fritt vatten.
      Anmärkning: Buffertlagret med låg salthalt kan förvaras vid 4 ° c i upp till sex månader.
    2. Tillsätt 0,5 μL/mL 1 M DTT och 1 μL/mL 0,1 g/mL cykloheximid före användning. Håll den färska låg salthalt buffert på is.
  5. Vävnads lyseringsbuffert
    1. För att göra 50 mL av vävnad lysis buffertlagret, kombinera 1 mL av 1 M HEPES, 3,75 mL 2 M KCl, och 500 μL av 1 M MgCl2. Tillsätt RNase-fritt vatten till en final på 50 mL.
      Anmärkning: Dissekbuffertlagret kan förvaras vid 4 ° c i upp till sex månader.
    2. Tillsätt 1 tablett/10 mL EDTA-fri proteashämmare, 1 μL/mL 0,1 g/mL cykloheximid, 10 μL/mL av RNase-hämmare varje omedelbart före användning. Håll färsk vävnad lysis buffert på is.

3. konjugering av antikroppar mot magnetiska pärlor

  1. Antikroppar
    1. Beräkna mängden GFP-antikroppar som krävs för alla prover och Förbered dig för ett extra prov.
      Anmärkning: För varje prov krävs 50 μg av varje GFP-antikropp.
    2. Tina GFP-antikroppar på is och snurra med maximal hastighet (> 13000 x g) i 10 min vid 4 ° c och överför supernatanter till ett nytt microcentrifugerör.
      Anmärkning: Förberedelsesteget för antikroppar kan utföras före pärlpreparering och de upptinade antikropparna kan förvaras på is. Alternativt kan denna del utföras under inkubering av magnetisk pärla och en protein L.
  2. Omsuspendera magnetiska pärlor
    1. Omsuspendera magnetiska pärlor (tabell över material) genom skonsam pipettering.
    2. För varje prov, Använd 150 μL magnetisk pärla. Beräkna volymen av magnetisk pärla som krävs för alla prover och förbereda en extra. Överför de återsuspenderade magnetiska pärlorna till ett 1,5 mL eller 2 mL microcentrifugerör. Om det krävs mer än 1 mL för ett experiment ska du dela upp det totala beloppet i samma volymer.
    3. Samla pärlor på ett magnetiskt stativ för > 1 min och ta bort supernatanten. Ta bort microcentrifugeröret från magnet stativet och tillsätt 1 mL PBS följt av pipettering upp och ner för att tvätta pärlorna. Samla pärlor på ett magnetiskt stativ för > 1 min och ta bort PBS.
  3. Beredning av protein L-belagda pärlor
    1. För varje prov, Använd 60 μL biotinylerat protein L. Om protein L tidigare återsuspenderas och förvaras vid-20 ° c, Tina protein L på is. Om protein L återsuspenderas före användning, ta det belopp som krävs för alla prover och förbereda en extra.
    2. Tillsätt den beräknade volymen av biotinylerat protein L till de återsuspenderade och tvättade magnetiska pärlorna. Tillsätt 1x PBS för att göra den slutliga volymen 1 mL om du använder ett 1,5 mL microcentrifugerör eller 1,5 mL om du använder ett 2 mL microcentrifugerör. Inkubera magnetiska pärlor med en protein L för 35 min vid RT på en slang rotator.
      Anmärkning: Antikroppar kan förberedas i detta steg medan pärlorna inkuberas med biotinylerat protein L.
    3. Samla protein L-belagda pärlor på ett magnetiskt stativ för > 1 min och ta bort supernatanten. Avlägsna microcentrifugeröret från magnet stativet och tillsätt 1 mL 3% BSA-buffert följt av skonsam pipettering i minst 5 gånger för att tvätta de proteinhaltiga L-belagda pärlorna.
    4. Samla belagda pärlor på ett magnetiskt stativ för > 1 min och ta bort supernatanten. Upprepa tvätt stegen med 3% BSA för ytterligare 4 gånger (totalt 5 gånger).
  4. Antikroppsbindning
    1. Tillsätt den beräknade mängden GFP-antikroppar i de proteinl-belagda pärlorna och inkubera i 1 h vid 4 ° c på en rör rotator.
      Anmärkning: Efter antikropps inkubering, var särskilt försiktig så att inte Vortex affinitetsmatrisen.
    2. Under inkubering, Förbered låg salthalt buffert genom att beräkna den totala volymen som krävs för alla prover och tillsätt 0,5 μL/mL av 1 M DTT och 1 μL/mL av 0,1 g/mL cykloheximid till låg salt buffertlager före användning.
      Anmärkning: 3 ml lågsaltbuffert för tvättning av varje tub med GFP-konjugerade pärlor och 200 μl/prov för resuspension av de GFP-konjugerade pärlorna krävs. Färsk låg salthalt buffert kan hållas på is för ett par timmar.
    3. Samla affinitetsmatrisen på ett magnetiskt stativ för > 1 min och ta bort supernatanten. Tillsätt 1 mL lågsaltbuffert och Pipettera försiktigt upp och ner för att tvätta affinitetmatrisen. Samla affinitetsmatrisen på ett magnetiskt stativ för > 1 min och ta bort låg salt buffert. Upprepa tvätt stegen med låg salthalt buffert för ytterligare 2 gånger (totalt 3 gånger).
    4. Omsuspendera pärlorna i låg salthalt buffert så att varje prov har 200 μL av affinitetsmatrisen.
      Anmärkning: Affinitetsmatrisen kan lagras i 0,02% NaN3 vid 4 ° c i upp till 2 veckor. Affinitetsmatrisen ska snabbt tvättas i låg salthalt 3 gånger och återsuspenderas försiktigt på en rörrotator vid 4 ° c i minst 10 minuter om affinitetsmatrisen bereds inom 1 vecka eller över natten om affinitetinmatrisen lagras i över 1 vecka. Protokollet kan pausas efter det här steget.
      Försiktighet: Natriumazid är ytterst giftigt för miljön. Kontakt med syror producerar giftig gas. Allt avfall bör samlas in för korrekt bortskaffande.

4. levervävnads Lys

  1. Buffert förberedelse och utrustning setup
    1. Beräkna antalet mikrocentrifugrör som krävs, etikett och kyla på is.
      Anmärkning: Vanligtvis, sju 1,5 mL microcentrifug rör krävs för varje prov: 1 för den återstående dissekerade levern, 4 för 4 mL av homogeniserade leverlysat, och 2 för överföring av supernatants.
    2. Förbered ny dissekbuffert genom att beräkna den totala volymen som krävs för alla prover och tillsätt 1 μL/mL 0,1 g/mL cykloheximid. Placera den färska dissektionbufferten på is för att hålla kylan under experimentet.
      Anmärkning: För varje prov krävs 10 mL dissekbuffertbuffert.
    3. Förbered ny lysis buffert genom att beräkna den totala volymen som krävs för alla prover och tillsätt 1 tablett/10 mL EDTA-fri proteashämmare, 1 μL/mL av 0,1 g/mL cykloheximid, och 10 μL/mL av RNase hämmare vardera. Håll lyseringsbufferten på isen under hela experimentet.
      Anmärkning: För varje prov krävs 4 mL lyseringsbuffert.
    4. Ställ in vävnadslipmaskinen (tabell över material) så att polytetrafluoreten (PTFE)-glasrör kan placeras på is under homogenisering av lever bitar. Sätt 4 mL kalllysbuffert i PTFE-glasrören.
  2. Repopulating levern homogenisering
    1. Euthanize en 8 − 12-veckors-gammal Fah-/- mus injiceras med fällan vektor och återbefolkas för 1 − 4 veckor med anestesi och livmoderhalscancer dislokation enligt godkända försöksdjur riktlinjer.
    2. Placera musen på en dissektion ombord och spraya buken med 70% etanol. Tält huden och bukhinnan låg i buken med hjälp av tång och använda sax för att göra en tvärgående snitt. Fortsätt att skära med saxen för att göra en bred U-formad peritonealdialys flik, med omsorg för att inte skära inälvor. Vänd den peritoneala luckan över bröstbenet för att exponera levern.
    3. Ta försiktigt bort levern med fin sax och pinps och snabbt placera vävnaden i kallt dissektion buffert för att skölja. För att homogenisera frysta vävnader, snabbt flytta önskad mängd av levervävnad till PTFE-glasrör med kallt lysis buffert utan upptinning vävnaden.
      Anmärkning: Den dissekerade vävnaden kan frysas och lagras vid-80 ° c efter det tvättas med dissekera buffert. Protokollet kan pausas efter det här steget.
    4. Väg levern på en petriskål och isolera 200 − 500 mg av levern bitar och flytta in i PTFE-glasrör. Placera resterande levervävnad i en pre-kyld mikrocentrifug röret och blixt frysa.
    5. Homogenisera proverna i en motordriven homogenisator börjar vid 300 rpm att separera hepatocyter från levern struktur för minst 5 stroke. Sänk glasröret varje gång men var noga med att inte låta mortelstöt stiga över lösningen för att förhindra luftning som kan orsaka protein denaturering.
    6. Höj hastigheten till 900 RPM för att fullständigt homogenisera levern vävnader för minst 12 full stroke.
    7. Överför lysatet till de märkta och förkylda rören, med högst 1 mL lysat per 1,5 mL mikrocentrifugrör. Om 4 mL lyseringsbuffert används, håll 1 tub och blixt frysa de återstående 3 rören.
      Anmärkning: Lysaterna kan hållas på is i upp till 1 h medan de dissekerar nästa djur och förbereder färska celllysat. Den homogeniserade levern kan vara blixt fryst efter lysis steg och lagras vid-80 ° c. Det kan finnas en 50% minskning av isolerat RNA om frysta celllysat används. Protokollet kan pausas efter det här steget.
  3. Nukleär Lys
    1. Centrifugera leverlysat vid 2 000 x g vid 4 ° c i 10 min och överför supernatanten till ett nytt, förkyld mikrocentrifugrör på isen.
    2. Tillsätt 1/9 av supernatanten volymen 10% nonylfenyl polyetylenglykol att göra den slutliga koncentrationen 1% nonylfenyl polyetylenglykol och blanda genom att försiktigt Invertera mikrocentrifug rören.
    3. Snabbt snurra mikrocentrifugrör och tillsätt 1/9 av provet volym 10% DOC att göra den slutliga koncentrationen 1% DOC och blanda genom att försiktigt vända mikrocentrifug rören. Snabbt snurra mikrocentrifug rören och inkubera på isen i 5 min.
    4. Centrifugera den nukleära lysat vid 20 000 x g vid 4 ° c i 10 min och överföra supernatanten till en ny, förkyld microcentrifug röret på is.
      Anmärkning: Den mitokondomutarmade supernatanten kan placeras på is i ett par timmar medan resterande prover samlas in.

5. immunoprecipitation

  1. För varje tub, ta ut 1% av den totala volymen av supernatanten som en pre-immunoprecipitation kontroll för att jämföra mål berikning efter inkubering med affinitetsmatrisen. Placera kontrollerna före immunoprecipitation på en rörrotator vid 4 ° c över natten, på samma sätt som de immunopreciterade proverna bearbetas.
  2. Tillsätt 200 μL affinitetsmatris till varje prov. Var extra noga med att Omsuspendera pärlorna genom att försiktigt Pipettera innan du lägger till affinitetsmatrisen i varje prov. Inkubera lysaterna med affinitetsmatrisen vid 4 ° c över natten med skonsam blandning på en rör rotator.
    Anmärkning: Protokollet kan pausas upp till en dag efter det här steget.

6. RNA-isolering

  1. Buffert förberedelse och utrustning setup
    1. Placera magnet rack vid 4 ° c i minst 30 min till pre-Chill och hålla rack på isen hela experimentet.
    2. Beräkna det antal mikrocentrifugrör som krävs och förkyla på is eller vid 4 ° c.
      Anmärkning: Vanligtvis kräver varje prov 1 microcentrifug tub för det slutliga renade RNA.
    3. Snabbt snurra rören från steg 5,2 och samla pärlor genom att placera på magnet rack i minst 1 min. samla in eller Kassera supernatanten i ytterligare mikrocentrifugrör.
      Anmärkning: Den insamlade supernatanten som innehåller obunden fraktion kan frysas och lagras vid-80 ° c för att jämföras med den bundna fraktionen för avskrift berikning efter rening. Protokollet kan pausas efter det här steget.
    4. Förbered hög salthalt buffert genom att tillsätta 0,5 μL/mL 1 M DTT och 1 μL/mL 0,1 g/mL cykloheximid till hög salt buffertlager.
      Anmärkning: För varje prov krävs 5 mL högsaltbuffert.
  2. RNA-isolering
    1. Tillsätt 1 mL färsk högsaltbuffert till varje tub följt av mild pipettering i minst 5 gånger utan att införa bubblor.
      Anmärkning: Otillräcklig tvättning kan introducera bakgrunder av obundna utskrifter medan införandet av bubblor kan påskynda RNA-nedbrytning.
    2. Samla pärlor på ett magnetiskt stativ för > 1 min och ta bort supernatanten. Upprepa tvätt stegen med hög salthalt buffert för ytterligare 4 gånger (totalt 5 gånger).
    3. Ta bort kvarvarande högsaltbuffert och ta bort mikrocentrifugrör från magnet stativet och placera den i RT i 5 minuter för att värma upp.
    4. Omsuspendera pärlorna i 100 μL lyseringsbuffert (medföljer RNA-isolerings satsen) med β-merkaptoetanol.
      Anmärkning: Alla RNA isolering och rening kit som innehåller denatureringsmedlet guanidin tiocyanat kan användas som en lysis buffert för att frigöra bundet RNA från affinitetsmatrisen. RNA-extraktion bör bearbetas vid RT eftersom guanidin tiocyanat kan kristallisera vid låga temperaturer.
    5. Vortex pärlor och buffert för minst 5 s vid högsta hastighet, snabbt snurra för att samla in bufferten på sidan av mikrocentrifug röret och inkubera pärlorna med bufferten vid RT för 10 min att frigöra pärla-bundet RNA i lysis buffert.
    6. Samla pärlor på ett magnetiskt stativ för > 1 min och samla supernatanten att fortsätta omedelbart till RNA sanering enligt RNA rening protokollet som anges i satsen (tabell över material).
      Anmärkning: Supernatanten som innehåller det eluerade RNA i lyseringsbufferten kan också förvaras vid-80 ° c i upp till 1 månad före rensning genom uppvärmning till RT vid upptinning.
    7. För att uppnå maximal kvalitet på det isolerade RNA, utför alla valfria steg inklusive DNase matsmältning och alla RNA elutionssteg. Värm upp elutionsbufferten som tillhandahålls av RNA-isoleringssats eller RNase-fritt vatten till 60 ° c för maximal RNA-återhämtning.
      Anmärkning: Det isolerade RNA kan förvaras vid-20 ° c i upp till 1 månad eller-80 ° c under flera år. Protokollet kan pausas efter det här steget.

7. valfri RNA-kvalitetsanalys (rekommenderas)

  1. Utvärdera RNA-kvalitet med hjälp av en bioanalyzer11 och kvantitet med en spektrofotometer12 för att avgöra om upprepa den immunoprecipitation processen krävs för att få gott och högkvalitativt RNA.
    Anmärkning: Den optimala RNA-kvaliteten för sekvensering av höga dataflöden bör följa protokoll som specificeras av biblioteks berednings satser och sekvenseringsplattformar.

8. nedströmsprogram

Anmärkning: Totalt RNA som isolerats med TRAP-protokollet kan användas i ett antal standardtillämpningar nedströms, inklusive RNA-SEQ (TRAP-SEQ). Standard omvänd Transkription och kvantitativa PCR-protokoll kan också användas efter FÄLLAN.

  1. För TRAP-SEQ, utför RNA-SEQ biblioteks beredning enligt standardmetoder13.
  2. För RNA-SEQ, Förbered cDNA sekvenserings bibliotek med kommersiella RNA-SEQ-Kits med oligo d (T)-baserad berikning av polyadenylerade poly (A)-utskrifter. Alternativt, om den totala RNA-kvalitet är lägre än rekommenderat för poly (A) berikning, använda rRNA utarmning moduler. Men förvänta dig att se mer rRNA justering efter sekvensering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Att profilera genuttryck i återinplantering hepatocyter av Fah-/- mus, GFP: Rpl10a fusion och Fah transgener samlevereras inom en transposon-innehållande plasmid8 (trap Vector) till lever av hydrodynamisk injektion (figur 1A). Avlägsnandet av nitisinon inducerar en toxisk leverskada som skapar ett urvals tryck för hepatocyter stabilt uttrycker Fah att återbefolka den skadade parenkymet9. Immunofluorescensfärgning bekräftar Co-uttrycket av Fah och GFP: RPL10A fusionsprotein i återinplantering hepatocyter efter två veckors återinsättning av levern (figur 1B).

I följande representativa experiment utfördes trap-SEQ med hjälp av quiescent och återinplantering mus hepatocyter. För det första, att få GFP-märkta ribosomer från quiescent hepatocyter, transgena rosaLSL-GFP-L10A möss injicerades med AAV8-TBG-CRE 7 dagar före offret att inducera GFP: RPL10A uttryck i alla hepatocyter14. Vi bearbetade också ett leverprov som samlats in från en vild typ mus som en negativ kontroll för att säkerställa isolering av översätta mRNA var specifik, vilket innebär att RNA endast kunde extraheras från möss som uttrycker GFP: RPL10A. Koncentrationen av isolerat RNA korrelerade med antalet celler som uttrycker fusionsproteinet, med det quiescent provet som producerar den högsta avkastningen eftersom alla hepatocyter Express GFP: RPL10A efter AAV8-TBG-CRE injektion (figur 2a). Omvänt var knappt något RNA detekterbart i Wild Type kontroller som inte hade GFP: RPL10A Transgene, indikerar FÄLLAN förfarandet är mycket specifik och har en låg bakgrund. När FÄLLAN användes på levervävnad som genomgick återinsättning med GFP: RPL10A-transduced hepatocyter, riklig, hög kvalitet RNA erhölls (figur 2B). Däremot upptäcktes ingen RNA-spårning via bioanalyzer för det negativa kontrollprovet.

Nedströms gen uttrycks analys kan utföras via omvänd Transkription och kvantitativ PCR eller RNA-SEQ på TRAP-isolerat RNA. Gsta1 kodar glutation S-transferas som spelar en viktig roll för metabolismen av glutation, den huvudsakliga avgiftande peptid för att skydda levern mot oxidativ stress skada15. Gsta1 uttryck induceras av över 10-faldig i återinplantering hepatocyter jämfört med quiescent hepatocyter, medan ingen tröskel cykel (CT) värde upptäcktes med trap-isolerade RNA från Wild typ musen på grund av avsaknaden av input RNA (figur 3 A). Observera att RNA-kvalitet i hög grad kan påverka gen uttrycks analysen. När det gäller RNA-SEQ-experiment bör bedömning av RNA-kvalitet utföras enligt rekommendationerna från biblioteks beredningssatsen och sekvenserings plattformen (figur 3B). En bioanalysator används ofta för att bestämma RNA-integritetsnumret (RIN), med ett högt RIN som korrelerade med en högre frekvens av mRNA-anpassningar till genomet (figur 3B, vänster), medan en lägre Rin leder till en högre frekvens av ribosomal läsningar, vilket indikerar mRNA-nedbrytning (figur 3B, höger). Figur 3 C, D visar att trap-SEQ kan identifiera differential genuttryck i quiescent och återinplantering hepatocyter. Till exempel, ALB uttrycket hämmas och AFP uttryck är uppreglerad under levern repopulation, vilket återspeglar att de replikerande hepatocyterna anta en mindre differentierad tillstånd att hämma lever metaboliska funktioner under återinsättning9,16.

Figure 1
Figur 1: införande av fälla med Fah-/- profilera genuttryck förändring av återinplantering hepatocyter. (A) schematiskt att uttrycka GFP: RPL10A fusionsprotein med Fah i den sovande skönheten transposon systemet följt av injektion i Fah-/- mus. Gröna hexagoner indikerar återinplantering hepatocyter med stabilt uttryck av Fah och GFP: RPL10A, medan svarta hexagoner representerar skadade, döende hepatocyter. B) representativ immunofluorescensfärgning visar coexpression av GFP-märkt ribosomalt protein L10A (grön) och Fah (röd) i återinplantering hepatocyter. Scale bar = 50 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Trap tillåter cell typspecifik isolering av högkvalitativt RNA. (A) avkastningen av RNA är positivt korrelerad med antalet hepatocyter som uttrycker GFP: RPL10A. Den låga avkastningen av RNA från en vild typ mus visar specificiteten av FÄLLAN från källor utan uttrycket av GFP: RPL10A. B) bioanalysator spår av totalt RNA som isolerats från återinplantering lever uttrycker GFP: RPL10A och från vilda typ lever visar den specifika fällan. Totalt RNA isolerat från vild typ levervävnad saknar GFP: RPL10A transgenens visar att minimalt RNA har samlats in, medan transgenens-uttrycker vävnad ger gott högkvalitativt RNA. Observera att ribosomala RNA toppar finns efter lyckad fälla10. FU, fluorescensenhet. RIN, RNA-integritetummer. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Trap-ISOLERAT RNA kan användas för nedströms gen uttrycks analys. (A) representativ omvänd Transkription och kvantitativa PCR-resultat av Gsta1 i quiescent och återinplantering hepatocyter. Inget CT-värde upptäcktes med RNA isolerat från vilda typ djur. B) Anpassningsanalys av isolerat RNA efter sekvensering med högt dataflöde, vilket visar vikten av att fastställa RNA-integritet efter isolering. Hög kvalitet RNA resulterar i en högre andel av mRNA läsningar (grön), medan låg kvalitet RNA leder till en mycket högre andel av ribosom läser (röd), eftersom de flesta mRNA är degraderad. RIN, RNA-integritetummer. (C,D) Integrative Genomics Viewer (IGV) spår av RNA-SEQ läsningar av mRNA affiniteten-renas från quiescent och återinplantering hepatocyter vid (C) ALB och (D) AFP loci. Observera att 3 ' läsa bias är typiskt för en poly (A) selektion pipeline. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

TRAP-SEQ är en teknik för celltypspecifik isolering av översättning av mRNA via Epitope-märkta ribosomer och utgör ett alternativ till FACS metoder, eftersom det kringgår begränsningar såsom tids krav för FACS9. Istället, fälla tillåter snabb och effektiv isolering av RNA direkt från bulk vävnader, hjälper till att undvika eventuella förändringar i genuttryck. Trap-SEQ är särskilt väl lämpad för användning i återinplantering Fah-/- mus lever, som hepatocyte expansion efter avlägsnande av nitisinon är cell autonom och möjliggör genuttryck profilering av subgruppen av hepatocyter med integrerad transgener. FÄLLAN vektor kan också uttryckas med gen-aktiverande eller-Silencing molekyler17, inklusive cDNA, kort-HÅRNÅL RNA, och guide RNA, att studera effekterna på globala genuttryck för aktivering eller hämning av en specifik gen. Alternativt ger rosaLSL-GFP-L10A transgena mus möjlighet att profilera genuttryck i vilken cell som helst med CRE driver aktivitet. Eftersom GFP: RPL10A kan uttryckas specifikt i alla celler som uttrycker CRE, roll andra celltyper i levern under leverskada och återinsättning kan studeras. Till exempel, korsar CK19-CRE mus med fällan transgena mus kan användas för att uttrycka GFP: RPL10A i cholangiocyter följt av trap-SEQ att studera förändringen av genuttryck i biliär epitel under återinsättning processen.

För att säkerställa korrekt profilering av genuttryck, är det viktigt att förbereda alla buffertar och affinitetsmatrisen före vävnads dissektion. Alla steg bör utföras på is med kylbuffertar om inte annat anges för att säkerställa polysome stabilisering10 och förhindra RNA-nedbrytning. Alla buffertar bör förberedas med RNase-fria reagenser och TRAP-SEQ-protokollet bör utföras i en RNase-fri miljö för att förhindra RNA-nedbrytning och låg avkastning av immunoprecipitated RNA. Affinitetsmatrisen kan beredas upp till 2 veckor före användning med skonsam resuspension på en slang rotator över natten. Särskild försiktighet bör iakttas för att inte kraftigt skaka matrisen för att förhindra störningar av antikropp-konjugerade, protein L-belagda magnetiska pärlor. Metoderna för att förbereda affinitetsmatrisen innefattar konjugering av magnetiska pärlor till biotinylerat protein L följt av inkubering med anti-GFP-antikroppar. Men kommersiellt tillgängliga protein A/G magnetiska pärlor kan ersättas; om det används hoppar du över det initiala konjugeringssteget och fortsätter direkt till antikropps bindningen. Dessutom, alternativa epitop taggar är förmodligen genomförbart med ovanstående protokoll med lämplig modifiering.

Det finns olika punkter där RNA-isoleringen och reningssteget kan pausas (se protokoll ovan). Men när leverprover har skördats, fortsätter till immunoprecipitation rekommenderas, eftersom avkastningen av isolerade RNA kan sjunka med ~ 50% med frysning i detta steg10. Vävnader bör snabbt sköljas med dissektion buffert som innehåller Kungliga Automobilklubben att hämma mRNA översättning. Otillräcklig vävnads Lys kan också bidra till låg RNA-avkastning. Det är viktigt att homogenisera vävnader på is tills ingen vävnad bitar är synliga med motorn Homogenisatorer samtidigt säkerställa minimal luftning10. Dessutom är tillräcklig tvättning med hög salt buffert avgörande för att säkerställa avlägsnande av icke-specifik bindning av ribosomala proteiner till affinitetsmatrisen. Inklusive en vild typ negativ kontroll hjälper till att bedöma specificiteten hos immunoprecipitation och effektiviteten i tvätt stegen. Dessutom, med hjälp av en kommersiell RNA rening kit som inkluderar RNase-fri DNase behandling kommer att öka RNA renhet.

Dessutom rekommenderas att kontrollera uttrycket och överflöd av GFP: RPL10A fusionsprotein och bedöma mängden vävnad som krävs för att erhålla gott RNA för nedströms analys. Vävnads sektioner eller celllysat kan användas för Immuno-baserade detektionsmetoder för att validera uttrycket av GFP: RPL10A. Mängden RNA som isoleras kan variera beroende på: (1) antalet celler som uttrycker GFP: RPL10A, (2) uttrycksnivån för transgenen, och (3) storleken och ploidi av de celler som uttrycker transgenen. Ett pilotexperiment med hälften och dubbelt så mycket som den rekommenderade mängden vävnad kan vara användbart vid bestämning av den optimala insatsen lysat för TRAP-SEQ. I våra händer, vi kunde få ~ 150 ng av RNA med så lite som 1-2% av hepatocyter uttrycker GFP: RPL10A från 200 mg av återinplantering Fah-/- lever, representerar ~ 2 x 105 polyploida hepatocyter med transgenens Expression9.

Den TRAP-SEQ metod isolerar ribosom-bunden mRNA att profilera en cells översätta mRNA pool. Den resulterande sekvenseringen lyder därför motsvara "translatome" snarare än transkriptome. Observera att översätta ribosom fotavtryck inte kommer att samlas in, eftersom FÄLLAN utförs på infödda snarare än tvärbunden komplex. Om fotavtryck analyser önskas, ovanstående protokoll bör ändras med relevant tvärbindning följt av immunoprecipitation (CLIP) metoder18. En annan begränsning av FÄLLAN är kravet på ett tillräckligt antal celler som uttrycker GFP: RPL10A fusionsprotein. För experiment där celltypen av intresse är liten kan det krävas att man kombinerar flera biologiska prover för att isolera tillräckligt med RNA för att möjliggöra RNA-SEQ19. Dessutom kräver TRAP-SEQ förekomst av GFP: RPL10A i celltypen av intresse. Detta kan innebära en utmaning om det inte finns något specifikt leveranssystem för cellerna eller om en specifik promotor för celltyp att köra CRE-uttryck inte är tillgänglig.

Den senaste utvecklingen av Single-cell RNA-SEQ (scRNA-SEQ) teknik har möjliggjort direkt sekvensering följt av i silico identifiering av olika celltyper, möjliggör sekvensering utan sortering för specifika celltyper av intressen20 ,21,22. Men scRNA-SEQ kräver fortfarande dissociation av celler från orgeln. När det gäller Fah-/- återinsättning modell, lever perfusion och hepatocyte isolering är extremt svårt och ineffektiv på grund av bräcklighet både skadade och replikera hepatocyter. I själva verket har vi ännu inte kunnat isolera tillräckligt hepatocyter från Fah-/- möss som genomgår återinsättning efter hydrodynamisk injektion av Fah plasmider. Dessutom, i den tid det tar att bearbeta vävnader, kan gen uttrycks nivåer förändras. Protokoll för lever perfusion ta upp till 30 min av varm ischa tid. Framtida metoder för att optimera levern perfusion att minska bearbetningstiden och öka isoleringen effektivitet kan möjliggöra scrna-SEQ integration till Fah-/- musmodell system och eventuellt andra skador och återinsättning modeller. Detta skulle också möjliggöra studiet av alla lever cells typer.

Sammanfattningsvis, integrationen av trap-SEQ med Fah-/- Mouse tillåter specifik isolering och genuttryck profilering av replikerande hepatocyter att identifiera terapeutiska mål som kan främja lever repopulation. Denna metod kan implementeras för att studera andra celltyper i levern och andra organsystem för sjukdomsspecifik identifiering av gen uttrycks förändringar för att identifiera potentiella läkemedelsmål eller biomarkörer. En liknande teknik kan användas för att samla kärnor från återinplantering hepatocyter med hjälp av affinitetsrening, och sedan utföra en epigenetisk analys av dessa specifika celler16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av följande bidrag: F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (AMZ), K08-DK106478 (KJW), och P30-DK050306 (pilot Grant till KJW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated DWK Life Sciences (Wheaton) 358007
Absolutely RNA Miniprep Kit Agilent 400800
Anti-GFP antibodies Memorial Sloan-Kettering Antibody & Bioresource Core GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7
Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free Jackson ImmunoResearch 001-000-162
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836170001
Cycloheximide Millipore Sigma C7698
Deoxycholic acid, DOC Millipore Sigma D2510
D-Glucose, Dextrose Fisher Scientific D16
DL-Dithiothreitol Millipore Sigma D9779
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 Thermo Fisher Scientific 65602
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Fisher Scientific FB0875712
HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red Thermo Fisher Scientific 14065-056
HEPES, 1 M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific Thermo Fisher Scientific AAJ16924AE
Magnesium chloride, MgCl2  Millipore Sigma M8266
Methanol Fisher Scientific A452
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific VV-83061-00
NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module New England BioLabs E7490S
NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina New England BioLabs E7530S
Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630 Millipore Sigma I8896
Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated Ambion AM9932
Overhead Stirrer DWK Life Sciences (Wheaton) 903475
PBS Buffer (10x), pH 7.4 Ambion AM9625
Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated Thermo Fisher Scientific 29997
Potassium chloride, KCl Millipore Sigma P4504
RNA 6000 Pico Kit & Reagents Agilent 5067-1513
RNaseZap RNase Decontamination Solution Invitrogen AM9780
RNasin Ribonuclease Inhibitors Promega N2515
Sodium azide, NaN3 Millipore Sigma S2002
Sodium bicarbonate, NaHCO3 Millipore Sigma S6297
SUPERase·In RNase Inhibitor Invitrogen AM2694

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, (10), 836-847 (2004).
  2. Lee, W. M. Etiologies of acute liver failure. Seminars in Liver Disease. 28, (2), 142-152 (2008).
  3. Sanyal, A. J., Yoon, S. K., Lencioni, R. The etiology of hepatocellular carcinoma and consequences for treatment. The Oncologist. 15 Suppl 4, 14-22 (2010).
  4. Jadlowiec, C. C., Taner, T. Liver transplantation: Current status and challenges. World Journal of Gastroenterology. 22, (18), 4438-4445 (2016).
  5. Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. Liver regeneration. Science. 276, (5309), 60-66 (1997).
  6. Michalopoulos, G. K. Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas. The American Journal of Pathology. 176, (1), 2-13 (2010).
  7. Grompe, M., et al. Loss of fumarylacetoacetate hydrolase is responsible for the neonatal hepatic dysfunction phenotype of lethal albino mice. Genes & Development. 7, (12A), 2298-2307 (1993).
  8. Wangensteen, K. J., et al. A facile method for somatic, lifelong manipulation of multiple genes in the mouse liver. Hepatology. 47, (5), 1714-1724 (2008).
  9. Wang, A. W., et al. TRAP-seq identifies cystine/glutamate antiporter as a driver of recovery from liver injury. The Journal of Clinical Investigation. 128, (6), 2297-2309 (2018).
  10. Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9, (6), 1282-1291 (2014).
  11. Agilent Technologies. Agilent RNA 6000 Pico: User Manual. Retrieved from https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90046_RNA600Pico_KG_EN.pdf (2016).
  12. NEBNext. NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina: User Manual. Retrieved from https://international.neb.com/-/media/nebus/files/manuals/manuale7530.pdf (2018).
  13. NanoDrop. 2000/2000c Spectrophotomerter: User Manual. Retrieved from https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CAD/manuals/NanoDrop-2000-User-Manual-EN.pdf (2009).
  14. Liu, J., et al. Cell-specific translational profiling in acute kidney injury. The Journal of Clinical Investigation. 124, (3), 1242-1254 (2014).
  15. Lu, S. C. Regulation of glutathione synthesis. Molecular Aspects of Medicine. 30, (1-2), 42-59 (2009).
  16. Wang, A. W., et al. The dynamic chromatin architecture of the regenerating liver. bioRxiv. (2019).
  17. Zahm, A. M., et al. A high-content in vivo screen to identify microRNA epistasis in the repopulating mouse liver. bioRxiv. (2019).
  18. Stork, C., Zheng, S. Genome-Wide Profiling of RNA-Protein Interactions Using CLIP-Seq. Methods in Molecular Biology. 1421, 137-151 (2016).
  19. Zhao, X., et al. Glutathione antioxidant pathway activity and reserve determine toxicity and specificity of the biliary toxin biliatresone in zebrafish. Hepatology. 64, (3), 894-907 (2016).
  20. Halpern, K. B., et al. Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver. Nature. 542, (7641), 352-356 (2017).
  21. Camp, J. G., et al. Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency. Nature. 546, (7659), 533-538 (2017).
  22. Wang, Y. J., Kaestner, K. H. Single-Cell RNA-Seq of the Pancreatic Islets--a Promise Not yet Fulfilled? Cell Metabolism. 29, (3), 539-544 (2019).
Celltypspecifika gen uttrycks profilering i mus levern
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, A. W., Zahm, A. M., Wangensteen, K. J. Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver. J. Vis. Exp. (151), e60242, doi:10.3791/60242 (2019).More

Wang, A. W., Zahm, A. M., Wangensteen, K. J. Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver. J. Vis. Exp. (151), e60242, doi:10.3791/60242 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter