Summary
En protokol til 3D-visualisering af mikroskopiske vævsstrukturer ved hjælp af en X-ray specifik farvnings metode designet til røntgen-computertomografi præsenteres.
Abstract
Vi demonstrerer en laboratoriebaseret metode, der kombinerer røntgen Mikroct og nanoCT med en specifik røntgen plet, som er rettet mod cellens cytoplasma. Den beskrevne protokol er nem at anvende, hurtig og velegnet til større bløddels prøver. Den præsenterede metodologi muliggør karakterisering af vigtige vævsstrukturer i tre dimensioner og påvises på en hel muse nyre. Multi Scale tilgang giver mulighed for at billede hele muse nyre og støtter udvælgelsen af yderligere mængder af interesse, som er erhvervet med højere opløsninger spænder ind i nanometer rækkevidde. Derved gengives bløddels morfologi med et tilsvarende detaljeringsniveau som de tilsvarende histologiske lysmikroskopi billeder. Dybere indsigt i 3D-konfigurationen af vævsstrukturer opnås uden at hæmme yderligere undersøgelser gennem histologiske metoder.
Introduction
Fuld karakterisering af bløddels prøver kræver oplysninger om 3D-vævs mikrostrukturen. Den nuværende guld standard for analyse af bløddels prøver er histopatologi. Den vævs-og cellulære morfologi af præparatet udforskes i 2D inden for udvalgte områder af interesse (ROIs) ved hjælp af Optisk mikroskopi1. Denne metode har dog flere ulemper. Forberedelsen af prøven er tidskrævende, kompliceret, destruktiv og tilbøjelig til artefakter. De producerede mikroskopiske dias giver kun 2D-oplysninger parallelt med skære planet. Ofte er antallet af histologiske sektioner, som undersøges, begrænset på grund af tidsbegrænsninger2,3.
I de seneste år har området 3D histologi udviklet sig. Her er virtuelle vævs skiver fra ethvert ønsket rumplan tilgængelige. Dette giver mulighed for sporing af strukturer i hele prøven, hvilket fører til en dybere forståelse af 3D-vævs arkitekturen og strukturelle ændringer i forbindelse med forskellige patologier. Forskellige metoder er blevet udviklet for at opnå generering af 3D-volumen data. De spænder fra serielle-sektion baserede tilgange, som bruger enten lys eller elektronmikroskopi4,5,6,7,8, til blok-Face billeddannelse metoder, såsom episcopic 3D imaging eller blok-Face scanning elektronmikroskopi7,8,9. Alle de nævnte metoder omfatter imidlertid enten opdeling eller destruktion af prøven fuldstændigt, hvilket ikke giver mulighed for yderligere undersøgelser. Den opnåede opløsning er meget afhængig af, at skæreprocessen er tilbøjelig til artefakter som beskrevet i konventionel histologi. Disse metoder lider også fra tilpasning artefakter.
3D X-ray Imaging teknikker såsom mikroskopisk og nanoskopisk computertomografi (microCT og nanoCT) stræber efter at generere 3D høj opløsning data uden ødelæggelse af vævsprøven. Indtil videre har den svage røntgen dæmpning kontrast af blødt væv og den begrænsede adgang til høje opløsninger i et laboratorium miljø forringet deres anvendelse til 3D-visualisering af mikroskopiske vævsstrukturer. Nylige fremskridt i retning af laboratoriebaseret, høj opløsning X-ray CT giver mulighed for opløsninger langt under 1 μm10,11,12,13.
Den manglende kontrast i blødt væv i konventionel dæmpnings baseret røntgenbillede kompenseres af farvnings midler, som forstærker kontrasten mellem røntgen dæmpningen. Farvnings midler, der kendes fra andre billedbehandlings teknikker såsom osmium dinitrogentetraoxid (OsO4), jod-kaliumiodid (Iki) eller phosphotungstinsyre (PTA), anvendes ofte14,15,16,17, 18,19,20,21,22,23,24,25. Farvnings midler, der giver mulighed for (i) specifik biologisk målretning, (II) homogen og fuldstændig farvning, (III) nem håndtering, (IV) hurtig indtrængning af vævet uden at skabe artefakter såsom diffusions ringe, (v) stor og tæt vævs farvning, og (vi) fuld kompatibilitet med histopatologi er nødvendig for at etablere X-ray CT som værktøj til 3D-visualisering af mikroskopiske vævsstrukturer. I dette arbejde viser vi, hvordan bløddels prøver forberedes til røntgen CT-scanning med en cytoplasma-specifik røntgen plet baseret på eosin, der opfylder kravene anført ovenfor26.
Multi Scale Imaging-tilgangen sikrer vurdering af farvningskvalitet gennem en oversigt Mikroct måling og udvælgelse af mængder af interesse (VOIs) for yderligere undersøgelser med høj opløsning. Farvning kvalitet analyseres med fokus på farvning parametre såsom (i) fuldstændighed, (II) udseende af diffusions ringe, (III) kontrastforbedring, (IV) fremkomsten af CT artefakter såsom striber og (v) homogenitet. Den laboratoriebaserede nanoct-opsætning, som bruger geometrisk forstørrelse til at nå opløsninger ned til 100 nm, visualiserer bløddels morfologi på (sub)-cellulært niveau10,27. En komparativ analyse af Nanolt skiver med tilsvarende histologiske lys mikroskopi billeder bekræfter reproduktion af væv arkitektur med lignende detaljer på et mikroskopisk niveau i 2D, muliggør histopatologiske karakterisering af vævet Prøve. Denne detaljerede video protokol er beregnet til at øge bevidstheden og til at fremhæve potentialet i denne metode som ikke-destruktiv 3D Soft-tissue Imaging værktøj er af interesse for et bredt videnskabeligt samfund som zoologer, biologer og sundhed Fagfolk.
Protocol
Forsigtig: Se alle relevante sikkerhedsdatablade (MSD'ER) før brug. Flere af de kemikalier, der anvendes i protokollen er akut giftige og kræftfremkaldende. Brug venligst alle relevante sikkerhedsmetoder, når du udfører farvnings protokollen, herunder brug af teknisk kontrol (røg Hood, glovebox) og personlige værnemidler (sikkerhedsbriller, handsker, Lab frakke, fuld længde bukser, lukkede tå sko).
Anvendte dyr:
Dyre boliger blev udført på Klinikum Rechts der Isar, Münchens tekniske universitet i overensstemmelse med den Europæiske Unions retningslinjer 2010/63. Organ fjernelse blev godkendt af et internt dyrebeskyttelses udvalg for Klinikum Rechts der Isar, München, Tyskland (internt referencenummer 4-005-09). Alle procedurer var i overensstemmelse med relevante retningslinjer og forskrifter. Alle laboratorier inspiceres i overensstemmelse med OECD'S principper for god laboratoriepraksis.
1. eosin-farvnings protokol
- Til fastgørelse af bløddels prøver fyldes et 50 mL centrifugeglas med en fiktionativ opløsning, der indeholder 9,5 mL 4% (v/v) formaldehyd opløsning (FA) og 0,5 mL iseddike (AA).
Bemærk: klargør FA-opløsningen frisk fra en 37% syre fri FA-opløsning stabiliseret med ca. 10% methanol. FA-opløsningen fortyndes yderligere med Dulbecco's fosfat bufferet saltvand (DPBS). Vælg DPBS uden calcium og magnesium. Den fortyndede FA-opløsning skal opbevares i højst en måned. Under forsuring ændres pH-værdien i den fikse rende opløsning fra neutral til ca. 3.
Forsigtig: da FA er akut organ toksisk, ætsende og kræftfremkaldende, brug af en røg hætte er obligatorisk og passende beskyttende personlige udstyr skal anvendes.- Tilsæt den frisk fjernede bløddels prøve til et 50 mL centrifugeglas, og nedkøle 50-mL centrifuge røret i 24-72h.
Bemærk: protokollen kan sættes på pause her. - Bløddels prøven vaskes med DPBS-opløsning i 1 time.
- Tilsæt den frisk fjernede bløddels prøve til et 50 mL centrifugeglas, og nedkøle 50-mL centrifuge røret i 24-72h.
- For at plette den fikseret bløddels prøve (f. eks. en hel muse nyre) skal blød vævet placeres i 2 mL eosin Y-farvningsopløsning, og prøven inkuberes i 24 timer. Opbevar prøven på en vandret ryste plade for en glat Rocking (ca. 60 rpm) under inkubatationen Proces.
Bemærk: eosin Y-Farvningsopløsningen har en koncentration på 30% (w/v) i destilleret vand. Vælg volumen af Farvningsopløsningen på en sådan måde, at prøven er helt dækket af Farvningsopløsningen, og lad prøven bevæge sig frit i prøvebeholderen. Inkubationstiden kan variere for andre prøver og skal justeres i overensstemmelse hermed. - Efter farvning fjernes bløddels prøven forsigtigt fra prøvebeholderen.
- Fjern forsigtigt overskydende farvningsmiddel med cellulose vævs papir.
- Bløddels prøven placeres i en konisk prøvebeholder over en ethanoldamp fase til opbevaring og videre anvendelse.
Bemærk: den koniske prøvebeholder skal altid indeholde et par dråber 70% (v/v) ethanol i bunden af røret for at holde bløddels prøven fugtig og forhindre artefakter.
2. røntgen Mikroct-billedbehandling
Bemærk: røntgen Mikroct målinger blev udført med en microCT scanner, som giver oversigt CT målinger (evnen til at billedet hele prøven inden for synsfeltet (FOV)) og udførelsen af høj opløsning CT målinger (evnen til at fokusere i på en ønsket mængde af interesse (VOI) af den samme prøve) ned til 1 μm.
- Bløddels prøven monteres på en passende prøveholder. Sørg for, at prøven sidder tæt på prøveholderen for at forhindre, at prøven bevæger sig under røntgen CT-målingerne.
- I tilfælde af den farvede muse nyre: Forbered en prøveholder med to centrifugeglas, hvorved bunden af et rør er afskåret. Lim de to centrifugeglas sammen ved hjælp af to-komponent klæbemiddel. Sørg for en lige justering af centrifuge rørene omkring rotationsaksen. Vent på, at klæbemidlet hærde.
- Når prøveholderen er klar til brug, skal du overføre muse nyrerne til det intakte centrifugeglas, som indeholder et par dråber 70% (v/v) ethanol i bunden af røret.
Bemærk: prøvens stabilitet er afgørende. Tag dig tid til at forberede prøven til røntgen CT-målinger. Bløddels prøven holdes over en ethanoldamp fase for at holde prøven fugtig under røntgen CT-målingerne og forhindre bløddels prøven i at krympe og andre artefakter. Bløddels prøven bør ikke være i kontakt med opløsningsmidlet for at undgå akkumulering af opløsningsmidlet omkring prøven under røntgen CT-måling, hvilket kan føre til prøve bevægelse under målingen eller kan forårsage problemer under genopbygningen. Hvis prøveholderen ikke har mulighed for at holde opløsningsmiddel i bunden, kan der anbringes et cellulose papir fugtet med 70% (v/v) ethanol i prøveholderen. Det skal bemærkes, at svind artefakter på grund af solvent ethanol ikke blev observeret.
Bemærk: protokollen kan sættes på pause her.
- Efter omhyggelig justering af prøven, Vælg anskaffelses parametre for bedste billedkvalitet. I tilfælde af de præsenterede microCT data, erhverve scanningen ved en spids spænding på 50 kV, en strøm af 3,5 W ved hjælp af 1601 projektioner ligeligt fordelt over 360 °.
Bemærk: anskaffelses parametrene for oversigten CT-scanning blev valgt for den bedste billedkvalitet. Som sådan blev det 0,39 x kamera mål valgt til at dække hele prøven inden for synsfeltet (FOV). Dette resulterede i en effektiv pixelstørrelse på 12 μm. Eksponeringstiden på 2 s pr. projektion gav et godt signal til støjforhold. AFKASTET for CT-scanningen med høj opløsning blev identificeret ved hjælp af Mikroct-dataene fra oversigts scanningen. MicroCT scannere inkorporerer ofte et integreret software værktøj, som giver mulighed for præcis udvælgelse af den fastsatte ROI. For CT-data med høj opløsning blev 4X-kamera målet valgt, hvilket resulterede i en effektiv pixelstørrelse på 3,3 μm. Her var der behov for en eksponeringstid på 15 s pr. projektion.
Bemærk: protokollen kan sættes på pause her. - Efter erhvervelse af X-ray CT data, proces fremskrivninger i overensstemmelse hermed til genopbygning af 3D-volumen. I tilfælde af de præsenterede microCT data: rekonstruere X-ray CT data med den integrerede software.
Bemærk: volumen gengivelser af Mikroct-data vist i figur 1 og figur 2 blev genereret ved hjælp af en visualiseringssoftware.
Bemærk: protokollen kan sættes på pause her.
3. X-ray nanoCT Imaging
Bemærk: X-ray nanoCT scanneren er udviklet inhouse. Linsen Free instrument er udstyret med en nanofocus X-ray kilde og en enkelt-foton tælle detektor. 3D-data med opløsninger ned til 100 nm kan genereres10. Generelt, nanoCT systemer, herunder dem med X-ray optik er kommercielt tilgængelige og ikke begrænset til den beskrevne nanoCT scanner.
- Nanolt prøveforberedelse
- Forbered VOIs af bløddels prøven. Skær det bløde væv i meget små stykker på ca. 0,5 mm kantlængde ved hjælp af en skalpel og et stereomicroskop. I tilfælde af mus nyre: skær muse nyrerne i to halvdele langs den længste akse. Tag den ene halvdel af muse nyrerne og forberede forskellige anatomiske regioner såsom renal cortex og renal medulla.
Bemærk: den anden halve af muse nyrerne blev overført til histopatologi, hvor prøven var indlejret i paraffin og forarbejdet i overensstemmelse hermed for at give de typiske histologiske sektioner, som det ses i figur 3c og figur 3d . - Overfør de små stykker før det første dehydrering trin til en ny Petri skål, hvor de forbliver for alle efterfølgende trin.
- Dehydrat prøverne ved hjælp af koncentrationer (alle v/v) i%: 50, 60, 70, 80, 90, 96 og 100 ethanol afbalanceret med destilleret vand. Udfør hvert dehydrering trin for 1 h hver.
Bemærk: protokollen kan sættes på pause her. Opbevar de små Vævsstykker i 100% ethanol natten over. - Kritisk punkt tørt (CPD) de små væv stykker.
Bemærk: anvendelsen af CPD muliggør fuldstændig dehydrering af vævsprøven ved at udskifte opløsningsmidlet (her ethanol) med tørremidlet (her CO2). Dette har været nødvendigt for at sikre, at prøven kan monteres på prøve indehaverne af Nanoldet, ikke bevæger sig under målingen og kan placeres meget tæt på røntgen kilden for at give mulighed for den bedste geometriske forstørrelse. NanoCT opsætningen er baseret på en simpel geometrisk forstørrelse, hvor forstørrelsesfaktoren defineres som afstanden mellem kilde og detektor i forhold til afstanden mellem kilde og stik. Tørrings teknikken blev først introduceret af Anderson for at bevare 3D-strukturen af biologiske prøver til elektronmikroskopi28. En oversigt over teknikken leveres af Bray29.- Forfyld vakuumkammeret med 100% ethanol. Overfør de små Vævsstykker til en mikro-porøs kapsel og Placer den i vakuumkammeret i CPD. Luk systemet.
Bemærk: da højt tryk er involveret i CPD-processen, sikre, at alle dele af CPD, især fittings, er intakt, og systemet er korrekt lukket. - Afkøl kammeret til 6-8 °C og fyldes op med Liquid CO2.
- Under omrøring skal du vente 3 min for at give mulighed for korrekt blanding af de to komponenter. Dræne kammeret forsigtigt. Sørg for, at prøveholderen stadig er dækket med solvens. Gentag dette trin ti gange for at tillade fuldstændig udskiftning af ethanol med CO2 i prøven.
- Efter den endelige fyldning af kammeret med CO2opvarmes maskinen til det kritiske punkt i co2 (31 °c og 73.8 bar) efterfulgt af meget langsom frigivelse af gasformige Co2 over en tid på 30 min.
Bemærk: frigivelsen af gassen bør foretages meget langsomt, da der ellers kan dannes kondenseret vand på prøven. Sørg for, at temperaturen ikke falder til under det kritiske punkt i CO2. Åbn kun CPD-maskinen, når alt trykket er frigivet fra systemet. - Fjern hurtigt CPD-vævs delene fra maskinen, og opbevar dem i en ny Petri skål, der er lagret i en ekssikkator, inden yderligere brug.
Bemærk: protokollen kan sættes på pause her.
- Forfyld vakuumkammeret med 100% ethanol. Overfør de små Vævsstykker til en mikro-porøs kapsel og Placer den i vakuumkammeret i CPD. Luk systemet.
- Forbered VOIs af bløddels prøven. Skær det bløde væv i meget små stykker på ca. 0,5 mm kantlængde ved hjælp af en skalpel og et stereomicroskop. I tilfælde af mus nyre: skær muse nyrerne i to halvdele langs den længste akse. Tag den ene halvdel af muse nyrerne og forberede forskellige anatomiske regioner såsom renal cortex og renal medulla.
- Monter CPD-vævs stykkerne på en passende prøveholder. Sørg for, at prøven sidder tæt på prøveholderen for at forhindre, at prøven bevæger sig under CT-målingerne. I tilfælde af CPD Mouse nyre Vævsstykker: lim vævet stykker med superlim til en prøveholder.
Bemærk: enhver uønsket bevægelse af prøven under CT målinger kan forårsage problemer under volumen genopbygning-især når erhverve et datasæt med nanometer voxel størrelse.
Bemærk: protokollen kan sættes på pause her. - Efter omhyggelig justering af prøven, Vælg anskaffelses parametre for bedste billedkvalitet. I tilfælde af de præsenterede nanoCT data: erhverve fremskrivninger på en spids spænding på 60 kV med 1599 fremskrivninger ligeligt fordelt over 360 ° og en voxel størrelse på ca. 400 nm.
Bemærk: en enkelt CT-måling opnået ved 400 nm voxel-størrelse har en FOV på 75 μm i retning af rotationsaksen (lodret) og ca. 560 μm i retningen vinkelret på rotationsaksen (vandret). For at undersøge større volumener kan en forlængelse af FOV langs rotationsaksen opnås ved at kombinere flere scanninger på forskellige lodrette positioner. Derudover kan lokale tomografi scanninger udføres for at måleprøver med en større prøve diameter vinkelret på rotationsaksen end givet af FOV af en global CT-scanning. NanoCT-dataene blev erhvervet med en eksponeringstid på 4 s pr. projektion. Som sådan var den samlede anskaffelses periode pr. datasæt ca. 3,5 h.
Bemærk: protokollen kan sættes på pause her. - Efter erhvervelse af CT-data, proces fremskrivninger i overensstemmelse hermed til genopbygning af 3D-volumen.
- I tilfælde af de præsenterede nanoCT data, normalisere de erhvervede projektioner med flatfield billeder. Forøg skarpheden af fremskrivningerne ved hjælp af en Richardson-Lucy devolution algoritme30,31. Brug en rotations symmetrisk Gaussisk funktion med en standardafvigelse på én pixel som dekoncentrerings kerne.
- Anvende Paganin fase-hentning algoritme til skærpet billeder for at øge blødt væv kontrast. Angiv parametrene for algoritmen for at optimere billedkvaliteten32. Rekonstruere de forbehandlede projektioner med en state-of-the-art filtreret backprojection algoritme.
Bemærk: figur 3 evaluerer de opnåede nanoldata med tilsvarende histologiske sektioner, som var ca. 7 μm tykke. Derfor blev der genereret mindste intensitets projektion skiver af 18 tilstødende nanoCT skiver med en virtuel tykkelse på ca. 7 μm ved hjælp af beregning af minimumsværdien for hver pixel i de relevante skiver. En visualisering software blev brugt til at gengive mængden af nanoCT data, som vises i figur 4.
Representative Results
Figur 1 viser CT-skiver og volumen gengivelse af mikroct-data med lav opløsning, som fremhæver kontrastforbedring efter farvning. Figur 2 viser CT skiver og volumen gengivelse af højopløsnings mikroct data afledt af en lokal tomografi af hele mus nyre. Figur 3 viser CT-skiver af nanoldata i forhold til de tilsvarende histologiske sektioner. Figur 4 viser CT skive og volumen gengivelse af nanoct data fremhæve strukturelle detaljer på cellulært niveau. Mikroct-målingen med lav opløsning giver mulighed for et overblik over hele organet og hjælper med at identificere interesse mængder (VOIs) for Mikroct-målingen med høj opløsning. Ved hjælp af denne multi skala-metode bestemmes VOI for Nanololt. NanoCT giver en meget detaljeret visning af bløddels prøven på cellulært niveau. Den sammenlignende undersøgelse med den tilsvarende histologiske sektion fremhæver fuld kompatibilitet med histopatologi. Her bekræfter den multimodale billedbehandlings metode de opnåede resultater med begge modaliteter.
Figur 1. CT-skiver og volumen gengivelse af Mikroct-data med lav opløsning. (a, b) oversigt billeder af samme mus nyre før og efter farvning henholdsvis, fremhæve kontrastforbedring opnået efter anvendelse af den eosin-baserede farvnings protokol. Begge Mikroct-datasæt blev anskaffet ved hjælp af identiske anskaffelses parametre. Voxel-størrelsen i begge datasæt er 12 μm. Den kontrastforbedring, som opnås ib), gør det muligt at identificere følgende anatomiske struktur områder: Cortex (I), ydre MEDULLA (II) med yderligere sondring i ydre striber af ydre medulla (IIA) og indvendige striber af ydre medulla (IIb), indre medulla (III), papilla (IV) og renal bækken (V). (c) mængde gengivelse af mikroct-data, der viser en virtuel sagittale-sektion gennem hele muse nyrerne. Dette tal er blevet ændret fra Busse og Müller et al.26venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. CT-skive og volumen gengivelse af Mikroct-data med høj opløsning afledt af samme muse nyre efter anvendelse af den udviklede eosin-baserede farvnings protokol. (a) det venstre hjørne viser det oversigt-microct-billede, der fremhæver ROI (Blue Box) for det viste billede i høj opløsning. Følgende anatomiske struktur regioner er identificerbare: Cortex (I), ydre medulla (II) med yderligere sondring i ydre striber af ydre medulla (IIa) og indvendige striber af ydre medulla (IIb), indre medulla (III), mindre Calyx (IV) og fartøjer (V og VI). b) mængden af rente gengivelse af mikroct-data med høj opløsning, der er erhvervet med en voxel-størrelse på 3,3 μm. Medulla-regionen og et virtuelt afsnit gennem et fartøj, der er afledt af en lokal tomografi af hele nyrerne, vises. Dette tal er blevet modificeret fra Busse og Müller et al.26. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. CT skiver af nanoCT data (a, b) i forhold til de histologiske sektioner (c, d) afledt af den samme mus nyre efter anvendelse af den udviklede eosin-baserede farvnings protokol. (a) nanoct-billedet af den samme muse nyre prøve efter farvning, dissekere og CPD viser detaljerede strukturer i region (IIb), der ses i figur 1 og figur 2. Disse er kendt som tykke stigende lemmer af løkken af Henle. (b) minimums intensitet projektion skive afledt af samme nanoct datasæt vist i (a) med en virtuel skive tykkelse på ca. 7 μm, som giver mulighed for klar visualisering af cellekerner. c) repræsentativ histologisk sektion med tykke opstigende lemmer af Henle-løkken med tydelig visualisering af cellekerner og pensel kant. Den histologiske del har en omtrentlig tykkelse på 7 μm og blev fremstillet af den samme mus nyre prøve efter den anvendte eosin-baserede farvning og indlejring i en paraffin blok. (d) repræsentativ histologisk sektion med anvendelse af Counter Stain hematoxylinlegemer fremhæver cellekerner i lilla. Klargøring af den histologiske sektion tæt på det afsnit, der er vist i (c) med en omtrentlig tykkelse på 7 μm. Dette tal er blevet ændret fra Busse og Müller et al.26venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. CT skive og volumen gengivelse af nanoCT data. (a) nanoct billede af samme mus nyre prøve viser strukturerne kendt som tykke stigende lemmer af løkken af Henle. Dette er en detaljeret visning af region (IIb) ses i figur 1 og figur 2 erhvervet fra et lille stykke af nyrerne med en voxel størrelse på ca. 400 nm. Forberedelsen af prøven omfattede farvning, dissekering og CPD. (b) volumen gengivelse af nanoct datavisualisering af 3D-strukturen af tykke stigende lemmer af løkkerne i Henle. Dette tal er blevet ændret fra Busse og Müller et al.26venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
I øjeblikket, eosin anvendes som standard histologisk protokol til etiketten cellecytoplasmaet. Farvnings midlet påføres som en vandig opløsning på 0,1% (w/v) til mikroskopiske skiver af blødt væv (almindeligvis skåret med en tykkelse på 2-10 μm)33. Anvendelsen af denne standardiserede histologiske protokol til 3D vævsprøver såsom en hel mus nyre ikke resulterer i en dæmpning kontrast forbedret CT billede. På den ene side kan dette tilskrives de lave iboende dæmpningsegenskaber af blødt væv for typisk anvendte røntgen energier af laboratoriebaserede Mikroct-systemer. Normalt er blødt væv sammensat af hovedsageligt kulstof, brint, ilt og nitrogen34, og derfor ikke resulterer i kontrastforbedring. På den anden side var den lave koncentration af eosin, der anvendes til farvning, den begrænsende faktor. Selvom et eosin-molekyle har fire bromid-atomer (højt atomtal element bromin med Z = 3534), blev de følsomhedsniveauer, der kræves for røntgen CT-scanning, ikke opfyldt.
For at overvinde denne udfordring med lav dæmpnings kontrast blev flere koncentrationer af eosin undersøgt. En begrænsning er her den maksimale Opløselighed af eosin i vand, som er 30% (w/v) i en vandig opløsning. Bedste dæmpning kontrastforbedring inden for blødt væv blev observeret med den højeste eosin koncentration, som blev forventet i henhold til Lambert-Beer lov. Derfor blev den endelige farvnings protokol udført med den højeste koncentration.
Spørgsmålet om, hvordan man forbereder det bløde væv optimalt på et Molekylær niveau for farvnings proceduren for yderligere at forbedre kontrasten ekstraudstyr blev besvaret af pH justering. Her konstateredes det, at forsuring af bløddels prøven under fiksering eller før farvning blev fundet afgørende. Dette blev også vist af Hong et al.35. Den højere ophobning af farvningsmiddel i cellen cytoplasma af syren blev opnået gennem forbedrede Ioniske interaktioner, som var et resultat af protonation af aminosyre sidekæder af proteiner og peptider til stede i cellen cytoplasma. I figur 1a, bvises et repræsentativt resultat, der fremhæver kontrast forøgelsen sammenlignet med en ufarvet bløddels prøve. Her blev en strukturel oversigt over en hel mus nyre visualisering afgørende anatomiske regioner såsom cortex, medulla, papilla og renal bækken opnået.
Den præsenterede farvnings protokol er enkel at anvende og indeholder kun tre trin. De nødvendige reagenser er let tilgængelige. Den samlede farvnings periode på 24 timer er hurtig for en hel-organ farvning, som muliggør 3D-visualisering af bløddels prøver (figur 1c, figur 2b og figur 4b) i et laboratoriemiljø på flere skalaer ned til cellulært niveau. Det skal bemærkes, at den samlede farvnings tidspunkt og-volumen for den nødvendige farvningsopløsning kan anmode om visse tilpasninger afhængigt af prøvens art. Ikke desto mindre er den eosin-baserede farvning protokol egnet til hele organ farvning, som derefter muliggør højopløsnings Mikroct billeddannelse af hele organer. Svind artefakter på grund af den opløsningsmiddel ethanol, som blev brugt til at holde prøven fugtig under Mikroct målinger, blev ikke observeret. Yderligere forberedelse skridt er nødvendige for nanoCT Imaging, som giver mulighed for undersøgelse af mindre væv stykker hentet fra den oprindelige prøve. Med hensyn til fremtidige histopatologiske anvendelser vil oversigten scanninger give værdifuld indsigt i ændrede anatomiske regioner og strukturer, som giver mulighed for bestemmelse af ROIs som vist i figur 2a. Disse kan undersøges i 3D ved hjælp af microCT (figur 1c og figur 2b) eller nanoct (figur 4b) og evalueret i 2D med histologi (figur 3).
En anden styrke i protokollen ses i fuld overensstemmelse med histopatologi med hensyn til H & E farvnings proceduren. Anvendelsen af den eosin-baserede farvnings procedure på bulkprøver hæmmer ikke yderligere histologiske undersøgelser (figur 3), selv om den anvendte eosin-koncentration er meget højere sammenlignet med den histologiske farvningsopløsning. Nanoct skive med en virtuel tykkelse på ca. 400 nm (figur 3a) sammenligner allerede meget godt med den histologiske del (figur 3c), som blev afledt af den tilsvarende bløddels prøve. I betragtning af den omtrentlige tykkelse af en histologisk sektion med 7-10 μm giver genereringen af mindste intensitets projektion udsnit af nanoCT data (figur 3b), som svarer til en virtuel tykkelse på ca. 7 μm, mulighed for en bedre sammenligning med det histologiske afsnit (figur 3c). Her er cellekerner tydeligt afsløret som ikke-dæmpnings område, da eosin specifikt pletter proteiner og peptider i cellen cytoplasmaet33.
Det er muligt at anvende yderligere kontra farvning med standard histologiske metoder, selv om rækkefølgen af farvning i forhold til den normale histologiske farvnings procedure blev vendt. Starter først med den udviklede eosin-baserede farvnings protokol for CT, efterfulgt af Counter farvning af de eosin-baserede histologiske sektioner med hematoxylin, giver mulighed for fuld kompatibilitet og resulterer i en høj kvalitet farvning viser den forventede form af udseende. Cellekerner-specifik farvning med mayer's sure hematoxylinlegemer blev anvendt til den histologiske sektion, der fremhæver cellekerner i lilla (figur 3d). Anvendelsen af histologisk Counter farvning er i øjeblikket begrænset til H-pletten. Andre standard histologiske modstande såsom periodisk syre Schiff base, Elastica van Gieson eller Gomori Silver skal evalueres samt kompatibiliteten med immun histologiske teknikker skal testes.
Den eosin-baserede farvnings protokol giver mulighed for (i) celle cytoplasma-specifik målretning, (II) homogen og fuldstændig farvning, (III) nem gennemførelse, (IV) hurtig penetration af vævet uden at skabe artefakter såsom diffusions ringe, (v) farvning af store og tætte bløddels prøver og (vi) fuld kompatibilitet med histopatologi med hensyn til H & E pletten. Disse krav er vigtige for at give høj opløsning X-ray CT visualisering af blødt væv ned til cellulært niveau. I kombination med de nyligt udviklede nanoct enheder12,36,37, ikke-destruktiv generering af virtuelle histologiske skiver, der er sammenlignelige i kontrast og opløsning til konventionelle histologiske data er gjort muligt. Denne kombinerede tilgang vil gøre det muligt at etablere X-ray CT som et værdifuldt værktøj til 3D-visualisering af mikroskopiske vævsstrukturer.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. enken Drecoll for histologiske diskussioner og det yderst hjælpsomme team hos Excillum AB, Sverige. Vi anerkender økonomisk støtte gennem DFG Cluster of Excellence München Center for Advanced Photonics (kort) og DFG Gottfried Wilhelm Leibniz program. Dette forskningsprojekt har desuden modtaget støtte fra eu's Horizon 2020-forsknings-og innovationsprogram under Marie Skłodowska-Curie-tilskudsaftale nr. HORISONT 2020-MSCA-IF-2015-703745-CONSALT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50-ml centrifuge tube by Falcon | VWR | 734-0453 | |
| Formaldehyde solution, 37% | Carl Roth | CP10.2 | acid-free, stabilized with ~10% MeOH |
| Glacial acetic acid | Alfa Aesar | 36289.AP | |
| Eosin Y disodium salt | Sigma-Aldrich | E4382 | certified by Biological Stain Commission |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | L1825 | Dulbecco's formualtion, w/o calcium and magnesium |
| Sample Tubes by Nalgene | Carl Roth | ATK5.1 | |
| Rocking Shaker ST5 | CAT | 60281-0000 | |
| Cellulose tissue paper | VWR | 115-0600 | |
| Forceps, by USBECK Laborgeräte | VWR | 232-0096 | |
| Microcentrifuge tubes by Eppendorf | VWR | 211-2120 | safe-lock, 2.0 ml |
| Ethanol absolute by Baker Analyzed | VWR | 80252500 | |
| Disposable safety scalpel by Aesculap | VWR | AESCBA210 | |
| Petri dish by Sterilin | VWR | 391-2019 | |
| Plastic pasteur pipette | Carl Roth | EA68.1 | graduated, 1 ml |
| Desiccator by Duran | VWR | SCOT247826954 | |
| Silicone grease by Bayer | Sigma-Aldrich | 85404 | high-vacuum |
| Carbon dioxide cylinder with standpipe | Linde | 3700113 | 10 kg, short |
| micro-porous treatment capsule | PLANO GmbH | 4614 | pore size 78 µm (B) |
| Bal-Tec CPD 030 | Bal-Tec AG | CO2 as drying agent | |
| Stemi 2000-C stereomicroscope with KL 1500 LCD | Zeiss | this stereomicroscope has been updated(1) | |
| Zeiss Xradia Versa 500 | Zeiss | this microCT scanner has been updated(2) | |
| Avizo Fire 8.1 | Thermo Fisher Scientific | ||
| PILATUS detector as part of the nanoCT scanner | Dectris | single-photon counting detector(4,5); there are commercially availble nanoCT systems available (6,7) | |
| nanofocus X-ray source as part of the nanoCT scanner | Excillum | high-flux nanofocus X-ray transmission tube(3); there are commercially availble nanoCT systems available(6,7) | |
| (1) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS stereomicroscopes https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/Stereomikroskope/1006> (September 06, 2019). | |||
| (2) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS Xradia 510 Versa https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/zeiss-xradia-510-versa.html> (April 10, 2019). | |||
| (3) Nachtrab, F. et al. Development of a Timepix based detector for the NanoXCT project. Journal of Instrumentation 10 (11), C11009, (2015). | |||
| (4) Kraft, P. et al. Performance of single-photon-counting PILATUS detector modules. Journal of Synchrotron Radiation 16 (3), 368-375, (2009). | |||
| (5) Kraft, P. et al. Characterization and calibration of PILATUS detectors. IEEE Transactions on Nuclear Science 56 (3), 758-764, (2009). | |||
| (6) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS Xradia 810 Ultra https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/xradia-810-ultra.html> (April 9 2019). | |||
| (7) Company, G. E. GE product information: Phoenix nanotom m, https://www.gemeasurement.com/sites/gemc.dev/files/geit-31344en_nanotom_m_0517.pdf> (April 10, 2019). |
References
- Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. Theory and Practice of Histological Techniques. 7th edn. , Churchill Livingstone Elsevier. (2013).
- Chatterjee, S. Artefacts in histopathology. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 18 (4), 111-116 (2014).
- McInnes, E. Artefacts in histopathology. Comparative Clinical Pathology. 13 (3), 100-108 (2005).
- Andreasen, A., Drewes, A., Assentoft, J., Larsen, N. Computer-assisted alignment of standard serial sections without use of artificial land-marks. A practical approach to the utilization of incomplete information in 3-d reconstruction of the hippocampal region. Journal of Neuroscience Methods. 45 (3), 199-207 (1992).
- Braverman, M. S., Braverman, I. M. Three-dimensional reconstructions of objects from serial sections using a microcomputer graphics system. Journal of Investigative Dermatology. 86 (3), 290-294 (1986).
- Denk, W., Hortsmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).
- Mohun, T. J., Weninger, J. W. Imaging heart development using high-resolution episcopic microscopy. Current Opinion in Genetics and Development. 21, 573-578 (2011).
- Weninger, J. W., Meng, S., Streicher, J., Müller, G. B. A new episcopic method for rapid 3-d reconstruction: applications in anatomy and embryology. Anatomy and Embryology. 197 (5), 341-348 (1998).
- Odgaard, A., Andersen, K., Melsen, F., Gundersen, H. J. G. A Direct Method for Fast 3-Dimensional Serial Reconstruction. Journal of Microscopy. 159, 335-342 (1990).
- Müller, M., et al. Myoanatomy of the velevt worm leg revealed by labratory-based nanofocus X-ray source tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12378-12383 (2017).
- Salomon, M., Hanke, R., Krüger, P., Uhlmann, N., Voland, V. Realization of a computed tomography setup to achieve resolutions below 1 µm. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A. 591, 50-53 (2008).
- Tkachuk, A., et al. X-ray computed tomography in Zernike phase contrast mode at 8 keV with 50-nm resolution using Cu rotating anode X-ray source. Zeitschrift für Kristallographie. 222, 650-655 (2007).
- Withers, P. J. X-ray nanotomography. Materials Today. 10, 26-34 (2007).
- Jahn, H., et al. Evaluation of contrasting techniques for X-ray imaging of velvet worms (Onychophora). Journal of Microscopy. 270 (3), 343-358 (2018).
- Martins de S. e Silva, J., et al. Three-dimensional non-destructive soft-tissue visualization with X-ray staining micro-tomography. Scientific Reports. 5, 14088 (2015).
- Metscher, B. D. MicroCT for Developmental Biology: A Versatile Tool for High-Contrast 3D Imaging at Histological Resolutions. Developmental Dynamics. 238, 632-640 (2009).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
- Mitzutani, R., et al. X-Ray Microtomographic Imaging of Three-Dimensional Structure of Soft Tissues. Tissue Engineering Part C: Methods. 14 (4), 359-363 (2008).
- Pauwels, E., Loo, D. v, Cornillie, P., Brabant, L., Hoorebeke, L. v An exploratory study of contrast agents for soft tissue visualization by means of high resolution X-ray computed tomography imaging. Journal of Microscopy. 250, 21-31 (2013).
- Degenhardt, K., Wright, A. C., Horng, D., Padmanabhan, A., Epstein, J. A. Rapid 3D phenotyping of cardiovascular development in mouse embryos by micro-CT with iodine staining. Circulation: Cardiovascular Imaging. 3 (3), 314-322 (2010).
- Dullin, C., et al. μCT of ex-vivo stained mouse hearts and embryos enables a precise match between 3D virtual histology, classical histology and immunochemistry. PLOS ONE. 12 (2), 0170597 (2017).
- Jeffrey, N. S., Stephenson, R. S., Gallagher, J. A., Cox, P. Micro-computed tomography with iodine staining resolves the arrangement of muscle fibres. Journal of Biomechanics. 44, 189-192 (2011).
- Johnson, J. T., et al. Virtual Histology of Transgenic Mouse Embryos for High-Throughput Phenotyping. PLOS Genetics. 2, 61 (2006).
- Leszczyński, B., et al. Visualization and Quantitative 3D Analysis of Intraocular Melanoma and Its Vascularization in a Hamster Eye. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 332 (2018).
- Mizutani, R., Suzuki, Y. X-ray microtomography in biology. Mircon. 43, 104-115 (2012).
- Busse, M., et al. Three-dimensional virtual histology enabled through cytoplasm-specific X-ray stain for microscopic and nanoscopic computed tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2293-2298 (2018).
- Müller, M., et al. Non-destructive high-resolution 3D virtual histology enabled through a cell nucleus-specific stain for X-ray computed tomography. Scientific Reports. 8, 17855 (2018).
- Anderson, T. F. Techniques for the preservation of three-dimensional structure in preparing specimens for the electron microscope. Transactions of the New York Academy of Sciences. 13 (4), Series II 130-134 (1951).
- Bray, D. Supercritical Fluid Methods and Protocols. Methods in Biotechnology. Williams, J. R., Clifford, A. A. 13, Humana Press. 235-243 (2000).
- Lucy, L. B. An iterative technique for the rectification of observed distributions. The Astronomical Journal. 79, 745-765 (1974).
- Richardson, W. H. Bayesian-Based Iterative Method of Image Restoration. The Journal of the Optical Society of America. 62 (1), 55-59 (1972).
- Paganin, F., Mayo, S. C., Gureyev, T. E., Miller, P. R., Wilkins, S. W. Simultaneous phase and amplitude extraction from a single defocused image of a homogeneous object. Journal of Microscopy. 206, 33-40 (2002).
- Riedelsheimer, B., Büchl-Zimmermann, S. Mikroskopische Technik. Mulisch, M., Welsch, U. , Spektrum-Verlag GmbH. Berlin Heidelberg. Ch. 10 193-194 (2015).
- Hubbell, J. H., Seltzer, S. M. Tables of Xray mass attenuation coefficients and mass energy-absorption coefficients from 1 keV to 92 keV and 48 additional substances of dosimetric interest, Table 3. National Institute of Standards and Technology. , (1995).
- Hong, H. Y., Yoo, G. S., Choi, J. K. An Eosin Y Method for Protein Determination in Solution. Analytical Letters. 32 (12), 2427-2442 (1999).
- Dierick, M., et al. Recent Micro-CT Scanner Developments at UGCT. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B. 324, 35-40 (2014).
- Kastner, J., Plank, B., Heinzl, C. Advanced X computed tomography methods: High resolution CT, quantitative CT, 4DCT and phase contrast CT. Proceedings of Digital Industrial Radiology and Computed Tomography. , 120-132 (2015).
