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Bioengineering

एक एक्स-रे विशिष्ट दाग विधि और Nanoscopic गणना टॉमोग्राफी का उपयोग कर नरम-टिशू नमूने के 3 डी इमेजिंग

Published: October 24, 2019 doi: 10.3791/60251
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Physics and Munich School of BioEngineering, Technical University of Munich, 2Department of Diagnostic and Interventional Radiology, School of Medicine and Klinikum rechts der Isar, Technical University of Munich
* These authors contributed equally

Summary

एक्स-रे गणना टोमोग्राफी के लिए डिज़ाइन किया गया एक्स-रे विशिष्ट धुंधला विधि का उपयोग करके सूक्ष्म ऊतक संरचनाओं के 3 डी दृश्य के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है।

Abstract

हम एक विशिष्ट एक्स-रे दाग के साथ एक्स-रे माइक्रोसीटी और नैनोसीटी के संयोजन वाली प्रयोगशाला-आधारित विधि प्रदर्शित करते हैं, जो सेल कोशिकाद्रव्य को लक्षित करता है। वर्णित प्रोटोकॉल लागू करने के लिए आसान है, तेजी से और बड़ा नरम ऊतक नमूने के लिए उपयुक्त. प्रस्तुत पद्धति तीन आयामों में महत्वपूर्ण ऊतक संरचनाओं की विशेषता सक्षम बनाता है और एक पूरे माउस गुर्दे पर प्रदर्शन किया है. multiscale दृष्टिकोण पूरे माउस गुर्दे छवि के लिए अनुमति देता है और ब्याज की आगे की मात्रा है, जो नैनोमीटर रेंज में लेकर उच्च संकल्प के साथ प्राप्त कर रहे हैं के चयन का समर्थन करता है. इस प्रकार, इसी हिस्टोलॉजिकल प्रकाश माइक्रोस्कोपी छवियों के रूप में एक समान विस्तार स्तर के साथ नरम ऊतक आकृति विज्ञान पुनरुत्पादित है। ऊतक संरचनाओं के 3 डी विन्यास में गहरी अंतर्दृष्टि हिस्टोलॉजिकल तरीकों के माध्यम से आगे की जांच impeding बिना हासिल कर रहे हैं.

Introduction

नरम ऊतक नमूनों की पूर्ण विशेषता 3 डी ऊतक microstructure के बारे में जानकारी की आवश्यकता है. नरम ऊतक नमूना विश्लेषण के लिए वर्तमान सोने के मानक हिस्टोपैथोलॉजी है. नमूने के ऊतक और सेलुलर आकारिकी का पता ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी 1 का उपयोग करके ब्याज (आरओआई) के चयनित क्षेत्रों के भीतर 2 डी में लगाया जाताहै। इस विधि, तथापि, कई कमियां हैं. नमूने की तैयारी समय लेने वाली, जटिल, विनाशकारी और कलाकृतियों के लिए प्रवण है। उत्पादित सूक्ष्म स्लाइड अनुभागिंग विमान के समानांतर केवल 2 डी जानकारी प्रदान करते हैं। प्रायः हिस्टोलॉजिकल खंडों की संख्या, जिसकी जांच की जाती है , समय की कमी2,3के कारण प्रतिबंधित होती है .

हाल के वर्षों में, 3 डी ऊतक विज्ञान के क्षेत्र में विकसित किया गया है. यहाँ, किसी भी वांछित स्थानिक विमान से आभासी ऊतक स्लाइस सुलभ हैं. यह नमूना भर में संरचनाओं की ट्रैकिंग के लिए अनुमति देता है, जो 3 डी ऊतक वास्तुकला और विभिन्न रोगों के साथ जुड़े संरचनात्मक परिवर्तन की गहरी समझ की ओर जाता है. 3 डी मात्रा डेटा के उत्पादन को प्राप्त करने के लिए विभिन्न तरीकों को विकसित किया गया है। वे सीरियल-सेक्शन आधारित दृष्टिकोणों से लेकर हैं, जो या तो प्रकाश या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी4,5,6,7,8, ब्लॉक-फ़ेस इमेजिंग विधियों, जैसे एपिस्कोपिक 3 डी इमेजिंग का उपयोग करते हैं। या ब्लॉक चेहरा स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी7,8,9. तथापि, उल्लिखित सभी विधियों में या तो अनुभागीकरण शामिल है या नमूने को पूरी तरह से नष्ट कर दिया जाता है, जो आगे की जांच की अनुमति नहीं देता है। प्राप्त संकल्प पारंपरिक ऊतक विज्ञान में वर्णित के रूप में कलाकृतियों के लिए प्रवण किया जा रहा अनुभागिंग प्रक्रिया पर अत्यधिक निर्भर है। इन तरीकों संरेखण कलाकृतियों से भी पीड़ित हैं.

3 डी एक्स-रे इमेजिंग तकनीक जैसे सूक्ष्म और नैनोस्कोपिक गणना टोमोग्राफी (माइक्रोसीटी और नैनोसीटी) ऊतक नमूने के विनाश के बिना 3 डी उच्च-रिज़ॉल्यूशन डेटा उत्पन्न करने की ख्वाहिश है। अब तक, नरम ऊतक के कमजोर एक्स-रे क्षीणन विपरीत और एक प्रयोगशाला वातावरण में उच्च संकल्प करने के लिए सीमित उपयोग सूक्ष्म ऊतक संरचनाओं के 3 डी दृश्य के लिए उनके उपयोग बिगड़ा हुआ है. प्रयोगशाला आधारित, उच्च संकल्प एक्स-रे सीटी की ओर हाल ही में अग्रिम संकल्प के लिए अच्छी तरह से नीचे की अनुमति 1 $m10,11,12,13.

पारंपरिक क्षीणन-आधारित एक्स-रे इमेजिंग में नरम ऊतक में इसके विपरीत की कमी को धुंधला एजेंटों द्वारा मुआवजा दिया जाता है, जो एक्स-रे क्षीणन इसके विपरीत को बढ़ाता है। अन्य इमेजिंग तकनीकों जैसे ओस्मियम टेत्रोक्साइड (ओसो4), आयोडीन पोटेशियम आयोडाइड (आईकेआई) या फॉस्फोटंगस्टिक एसिड (पीटीए) से जाने जाने वाले दागदार एजेंटों का अक्सर14,15,16,17, का उपयोग किया जाता है, 18,19,20,21,22,23,24,25. दाग एजेंट जो (i) विशिष्ट जैविक लक्ष्यीकरण की अनुमति देते हैं, (ii) समरूप और पूर्ण धुंधला, (iii) आसान हैंडलिंग, (iv) प्रसार के छल्ले, (अ) बड़े और घने ऊतक धुंधला, और (vi) जैसे कलाकृतियों को बनाने के बिना ऊतक की तेजी से प्रवेश हिस्टोपैथोलॉजी के साथ पूर्ण संगतता सूक्ष्म ऊतक संरचनाओं के 3 डी दृश्य के लिए उपकरण के रूप में एक्स-रे सीटी स्थापित करने के लिए आवश्यक हैं। इस काम में, हम बताते हैं कि कैसे नरम ऊतक नमूने एक्स-रे सीटी इमेजिंग के लिए तैयार कर रहे हैं एक कोशिका द्रव्य विशेष एक्स-रे eosin पर आधारित दाग है कि26से ऊपर उल्लिखित आवश्यकताओं को पूरा के साथ.

multiscale इमेजिंग दृष्टिकोण एक सिंहावलोकन microCT माप और आगे उच्च संकल्प जांच के लिए ब्याज की मात्रा (VOIs) के चयन के माध्यम से धुंधला गुणवत्ता का आकलन सुनिश्चित करता है. दाग गुणवत्ता का विश्लेषण दाग मानकों पर ध्यान केंद्रित करते हुए किया जाता है जैसे (i) पूर्णता, (ii) प्रसार के छल्ले की उपस्थिति, (पप) इसके विपरीत वृद्धि, (पअ) सीटी कलाकृतियों की उपस्थिति जैसे कि धारियाँ और (अ) एकरूपता। प्रयोगशाला आधारित नैनोसीटी सेटअप, जो ज्यामितीय आवर्धन का उपयोग करता है 100 एनएम तक संकल्प तक पहुंचने के लिए, (उप) -सेल्यूलर स्तर10,27पर नरम ऊतक आकृति विज्ञान की कल्पना करता है। इसी हिस्टोलॉजिकल प्रकाश माइक्रोस्कोपी छवियों के साथ नैनोसीटी स्लाइस का एक तुलनात्मक विश्लेषण 2 डी में एक सूक्ष्म स्तर पर इसी तरह के विस्तार के साथ ऊतक वास्तुकला के प्रजनन की पुष्टि करता है, जिससे ऊतक के हिस्टोपैथोलॉजिकल विशेषता को सक्षम किया जा सकता है नमूना. इस विस्तृत वीडियो प्रोटोकॉल के लिए जागरूकता बढ़ाने के लिए और गैर विनाशकारी 3 डी नरम ऊतक इमेजिंग उपकरण के रूप में इस पद्धति की क्षमता को उजागर करने का इरादा है एक व्यापक वैज्ञानिक समुदाय के लिए ब्याज की जा रही है जैसे कि जीव विज्ञानियों, जीवविज्ञानियों और स्वास्थ्य पेशेवरों.

Protocol

चेतावनी: उपयोग करने से पहले कृपया सभी प्रासंगिक सामग्री सुरक्षा डेटा पत्रक (MSDS) से परामर्श करें. प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले कई रसायन अत्यधिक विषाक्त और कैंसरकारी होते हैं। इंजीनियरिंग नियंत्रण (धूम हुड, ग्लवबॉक्स) और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (सुरक्षा चश्मा, दस्ताने, प्रयोगशाला कोट, पूर्ण लंबाई पैंट, बंद करने के जूते) के उपयोग सहित धुंधला प्रोटोकॉल प्रदर्शन करते समय सभी उपयुक्त सुरक्षा प्रथाओं का उपयोग करें।

पशु इस्तेमाल किया:
पशु आवास Klinikum rechts der Isar, म्यूनिख के तकनीकी विश्वविद्यालय में यूरोपीय संघ के दिशा निर्देशों के अनुसार किया गया 2010/ अंग हटाने Klinikum rechts der Isar, म्यूनिख, जर्मनी (आंतरिक संदर्भ संख्या 4-005-09) की एक आंतरिक पशु संरक्षण समिति से अनुमोदित किया गया था. सभी प्रक्रियाएं संगत दिशानिर्देशों और विनियमों के अनुसार थीं। सभी प्रयोगशालाओं का अच्छी प्रयोगशाला पद्धति के ओईसीडी सिद्धांतों के अनुसार निरीक्षण किया जाता है।

1. Eosin धुंधला प्रोटोकॉल

  1. नरम ऊतक के नमूनों को ठीक करने के लिए, एक 50-एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब को एक स्थिर समाधान के साथ भरें जिसमें 9.5 एमएल 4% (v/v) फॉर्मेल्डिहाइड समाधान (एफए) और 0.5 एमएल हिमनदीय ऐसीटिक एसिड (एए) शामिल हैं।
    नोट: अनुमानित 10% मेथनॉल के साथ स्थिर एक 37% एसिड मुक्त एफए समाधान से ताजा एफए समाधान तैयार करें। दुलबिकको के फॉस्फेट बफर्ड नमकीन (डीपीएस) के साथ एफए समाधान को आगे बढ़ाएं। कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना DPBS चुनें. तनु एफए समाधान अब एक महीने से रखें. अम्लीकरण के दौरान स्थिर विलयन का चह तटस्थ से लगभग 3 में परिवर्तित हो रहा है।
    चेतावनी: क्योंकि एफए तीव्र अंग विषाक्त, संक्षारक और कैंसरकारी है, एक धूआं हुड का उपयोग अनिवार्य है और उचित सुरक्षात्मक व्यक्तिगत उपकरणों का इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
    1. एक 50-एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के लिए ताजा हटा नरम ऊतक नमूना जोड़ें और 24-72h के लिए 50-एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब को फ्रिज में।
      नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है।
    2. 1h के लिए DPBS समाधान के साथ नरम ऊतक नमूना धो लें.
  2. फिक्सकिए गए नरम ऊतक नमूने को दागित करने के लिए (उदाहरण के लिए, एक पूरे माउस गुर्दे), ईओसिन वाई-स्टेनिंग समाधान के 2 एमएल में नरम ऊतक रखें और 24 एच के लिए नमूना इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के दौरान एक चिकनी हिलिंग (सीए 60 आरपीएम) के लिए एक क्षैतिज मिलाते हुए प्लेट पर नमूना रखें प्रक्रिया.
    नोट: eosin Y-स्टेनिंग समाधान आसुत जल में 30% (w/v) की एकाग्रता है। इस तरह से है कि नमूना पूरी तरह से धुंधला समाधान द्वारा कवर किया जाता है और नमूना नमूना कंटेनर के भीतर स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित करने के लिए अनुमति देते हैं में धुंधला समाधान की मात्रा चुनें. ऊष्मायन समय अन्य नमूनों के लिए भिन्न हो सकता है और तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए।
  3. धुंधला करने के बाद, नमूना कंटेनर से नरम ऊतक नमूना सावधानी से हटा दें।
    1. ध्यान से सेलूलोज़ ऊतक कागज के साथ धुंधला एजेंट की अधिकता को हटा दें।
    2. भंडारण और आगे के उपयोग के लिए एक इथेनॉल वाष्प चरण के ऊपर एक शंकु नमूना कंटेनर में नरम ऊतक नमूना प्लेस.
      नोट: शंकु नमूना कंटेनर हमेशा नरम ऊतक नमूना नम रखने के लिए और कलाकृतियों को रोकने के लिए ट्यूब के तल पर 70% (v/v) इथेनॉल की कुछ बूँदें शामिल होना चाहिए।

2. एक्स-रे माइक्रोसीटी इमेजिंग

नोट: एक्स-रे microCT माप एक microCT स्कैनर, जो अवलोकन सीटी माप प्रदान करता है के साथ प्रदर्शन किया गया (देखने के क्षेत्र के भीतर पूरे नमूने छवि करने की क्षमता (FOV)) और उच्च संकल्प सीटी माप के प्रदर्शन (में ध्यान केंद्रित करने की क्षमता ब्याज की एक वांछित मात्रा पर (वीओआई) बहुत ही नमूना के नीचे 1 डिग्री उ.

  1. एक उपयुक्त नमूना धारक के लिए नरम ऊतक नमूना माउंट. एक्स-रे सीटी माप के दौरान जाने से नमूना को रोकने के लिए नमूना धारक पर नमूना की एक तंग फिट सुनिश्चित करें।
    1. दाग माउस गुर्दे के मामले में: दो अपकेंद्रित्र ट्यूबों के साथ एक नमूना धारक तैयार करें, जिससे एक ट्यूब के नीचे काट दिया जाता है। दो अपकेंद्रित्र ट्यूबों को एक साथ दो घटक चिपकने वाला उपयोग करके गोंद। घूर्णन अक्ष के चारों ओर अपकेंद्रित्र ट्यूबों का एक सीधा संरेखण सुनिश्चित करें। चिपकने वाला कठोर करने के लिए प्रतीक्षा करें।
    2. एक बार नमूना धारक उपयोग के लिए तैयार है, बरकरार अपकेंद्रित्र ट्यूब में माउस गुर्दे हस्तांतरण, जो ट्यूब के तल पर 70% (v/v) इथेनॉल की कुछ बूँदें रखती है.
      नोट: नमूना की स्थिरता महत्वपूर्ण है। एक्स-रे सीटी माप के लिए नमूना तैयार करने के लिए समय ले लो। नरम ऊतक नमूना एक्स-रे सीटी माप के दौरान नमूना नम रखने के लिए और संकुचन और अन्य कलाकृतियों से नरम ऊतक नमूना को रोकने के लिए एक इथेनॉल वाष्प चरण पर रखा जाता है। नरम ऊतक नमूना विलायक के साथ संपर्क में नहीं होना चाहिए एक्स-रे सीटी माप के दौरान नमूने के आसपास विलायक के संचय को दूर करने के लिए, जो माप के दौरान नमूना आंदोलन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं या पुनर्निर्माण के दौरान समस्याओं का कारण हो सकता है। यदि नमूना धारक तल पर विलायक को पकड़ने की अनुमति नहीं देता है, तो 70% (v/v) इथेनॉल के साथ गीला एक सेलूलोज़ पेपर नमूना धारक में रखा जा सकता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि विलायक इथेनॉल के कारण संकुचन कलाकृतियों को नहीं देखा गया था।
      नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है।
  2. नमूना के सावधान संरेखण के बाद, सबसे अच्छी छवि गुणवत्ता के लिए अधिग्रहण पैरामीटर चुनें. प्रस्तुत माइक्रोसीटी डेटा के मामले में, 50 केवी की चोटी वोल्टेज पर स्कैन प्राप्त करें, 3.5 W की एक धारा 1601 अनुमानों का उपयोग कर समान रूप से 360 डिग्री से अधिक वितरित.
    नोट: प्राप्ति पैरामीटर अवलोकन सीटी स्कैन के लिए सबसे अच्छी छवि गुणवत्ता के लिए चुना गया था। इस तरह के रूप में 0.39x कैमरा उद्देश्य को देखने के क्षेत्र (FOV) के भीतर पूरे नमूने को कवर करने के लिए चुना गया था. इसके परिणामस्वरूप पिक्सेल का आकार 12 डिग्री सेल्सियस हो गया। प्रक्षेपण प्रति 2 s के जोखिम समय शोर अनुपात के लिए एक अच्छा संकेत प्रदान की. उच्च-रिज़ॉल्यूशन CT स्कैन के लिए ROI की पहचान अवलोकन स्कैन से microCT डेटा का उपयोग करके की गई थी. MicroCT स्कैनर अक्सर एक एकीकृत सॉफ्टवेयर उपकरण है, जो निर्धारित रॉय के सटीक चयन के लिए अनुमति देता है शामिल हैं. उच्च-रिज़ॉल्यूशन वाले सीटी डेटा के लिए, 4x कैमरा उद्देश्य को 3.3$m का प्रभावी पिक्सेल आकार के परिणामस्वरूप चुना गया था. यहाँ, प्रति प्रक्षेपण 15 s के एक जोखिम समय की जरूरत थी.
    नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है।
  3. एक्स-रे सीटी डेटा के अधिग्रहण के बाद, 3 डी मात्रा के पुनर्निर्माण के लिए तदनुसार अनुमानों की प्रक्रिया. प्रस्तुत माइक्रोसीटी डेटा के मामले में: एकीकृत सॉफ्टवेयर के साथ एक्स-रे सीटी डेटा का पुनर्निर्माण।
    नोट: चित्र 1 और चित्र 2 में दिखाए गए microCT डेटा की वॉल्यूम रेंडरिंग किसी दृश्यावलोकन सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके जनरेट किए गए थे।
    नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है।

3. एक्स-रे नैनोसीटी इमेजिंग

नोट: एक्स-रे नैनोसीटी स्कैनर घर में विकसित किया गया है। लेंस मुक्त साधन एक नैनोफोकस एक्स-रे स्रोत और एक एकल फोटॉन गिनती डिटेक्टर से लैस है। 100 एनएम करने के लिए नीचे संकल्प के साथ 3 डी डेटा10उत्पन्न किया जा सकता है। आम तौर पर, एक्स-रे प्रकाशिकी के साथ उन सहित नैनोसीटी सिस्टम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं और वर्णित नैनोसीटी स्कैनर तक सीमित नहीं हैं।

  1. NanoCT नमूना तैयारी
    1. नरम ऊतक नमूने के VOIs तैयार करें. एक स्केलपेल और एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग कर लगभग 0.5 मिमी बढ़त लंबाई के बहुत छोटे टुकड़ों में नरम ऊतक कट. माउस गुर्दे के मामले में: सबसे लंबे समय तक अक्ष के साथ दो हिस्सों में माउस गुर्दे कट. माउस गुर्दे का एक आधा ले लो और गुर्दे प्रांतस्था और गुर्दे मेडुला के रूप में विभिन्न शारीरिक क्षेत्रों तैयार करते हैं।
      नोट: माउस गुर्दे के अन्य आधा हिस्टोपैथोलॉजी के लिए स्थानांतरित किया गया था, जहां नमूना पैराफिन में एम्बेडेड और तदनुसार संसाधित किया गया था के रूप में चित्र 3ग और चित्र ाे में देखा ठेठ हिस्टोलॉजिकल वर्गों उपज .
    2. पहले निर्जलीकरण कदम से पहले छोटे टुकड़े एक नया पेट्री डिश है, जहां वे सभी बाद के चरणों के लिए रहते हैं स्थानांतरण.
    3. मात्रा का उपयोग कर नमूने निर्जलित (सभी v/v) %: 50, 60, 70, 80, 90, 96 और 100 इथेनॉल आसुत पानी के साथ संतुलित. 1 ज प्रत्येक के लिए प्रत्येक निर्जलीकरण चरण निष्पादित करें।
      नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है। छोटे ऊतक के टुकड़ों को रात भर 100% इथेनॉल में रखें।
    4. महत्वपूर्ण बिंदु सूखी (सीपीडी) छोटे ऊतक टुकड़े.
      नोट: सीपीडी के आवेदन विलायक (यहाँ इथेनॉल) सुखाने एजेंट के साथ (यहाँ सीओ2)का आदान प्रदान करके ऊतक नमूना की पूरी निर्जलीकरण सक्षम बनाता है। यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हो गया है कि नमूना नैनोसीटी के नमूना धारकों के लिए रखा जा सकता है, माप के दौरान नहीं बढ़ रहा है और सबसे अच्छा ज्यामितीय आवर्धन के लिए अनुमति देने के लिए एक्स-रे स्रोत के बहुत करीब तैनात किया जा सकता है। नैनोसीटी सेटअप मात्र ज्यामितीय आवर्धन पर आधारित है, आवर्धन कारक के साथ स्रोत-से-प्रतिदर्श दूरी पर स्रोत-से-डिटेक्टर दूरी के रूप में परिभाषित किया जा रहा है। सुखाने की तकनीक सबसे पहले एंडरसन द्वारा इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी28के लिए जैविक नमूनों की 3 डी संरचना को संरक्षित करने के लिए शुरू की गई थी . इस तकनीक का अवलोकन Bray29द्वारा प्रदान किया गया है .
      1. 100% इथेनॉल के साथ वैक्यूम कक्ष प्रीफिल करें। छोटे ऊतक के टुकड़ों को सूक्ष्म-पोरस कैप्सूल में स्थानांतरित करें और इसे सीपीडी के निर्वात कक्ष में रखें। सिस्टम को बंद कर दें।
        नोट: चूंकि उच्च दबाव सीपीडी प्रक्रिया में शामिल है, सीपीडी के सभी भागों को सुनिश्चित करें, विशेष रूप से फिटिंग, बरकरार हैं और सिस्टम ठीक से बंद है।
      2. कक्ष को 6- 8 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें और द्रव ब्व्2से भरें।
      3. जबकि सरगर्मी, 3 मिनट प्रतीक्षा करने के लिए दो घटकों के उचित मिश्रण के लिए अनुमति देते हैं. ध्यान से कक्ष नाली. सुनिश्चित करें कि नमूना धारक अभी भी विलायक के साथ कवर किया जाता है। नमूना के भीतर सीओ2 के साथ इथेनॉल का पूरा प्रतिस्थापन की अनुमति देने के लिए इस चरण को दस बार दोहराएँ।
      4. सीओ2के साथ कक्ष के अंतिम भरने के बाद, सीओ2 (31 डिग्री सेल्सियस और 73.8bar) के महत्वपूर्ण बिंदु पर मशीन गर्मी 30 मिनट के एक समय में गैसीय सीओ2 की बहुत धीमी गति से जारी करने के बाद।
        नोट: गैस की रिहाई बहुत धीरे धीरे किया जाना चाहिए के रूप में अन्यथा गाढ़ा पानी नमूने पर फार्म कर सकते हैं. यह सुनिश्चित करें कि तापमान सीओ2के महत्वपूर्ण बिंदु से नीचे न गिरे। सिस्टम से सभी दबाव जारी किए जाने पर केवल सीपीडी मशीन खोलें.
      5. मशीन से जल्दी से सीपीडी ऊतक टुकड़े निकालें और आगे उपयोग करने से पहले एक desiccator में संग्रहीत एक नया पेट्री डिश में उन्हें रखने के लिए।
        नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है।
  2. एक उपयुक्त नमूना धारक के लिए सीपीडी ऊतक टुकड़े माउंट. सीटी माप के दौरान जाने से नमूना को रोकने के लिए नमूना धारक पर नमूना की एक तंग फिट सुनिश्चित करें। सीपीडी माउस गुर्दे के ऊतकों के टुकड़े के मामले में: एक नमूना धारक को superglue के साथ ऊतक टुकड़े गोंद.
    नोट: सीटी माप के दौरान नमूने के किसी भी अवांछित आंदोलन मात्रा पुनर्निर्माण के दौरान समस्याओं का कारण बन सकता है - विशेष रूप से जब एक डेटा प्राप्त करने के साथ एक डेटा सेट प्राप्त नैनोमीटर voxel आकार.
    नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है।
  3. नमूना के सावधान संरेखण के बाद, सबसे अच्छी छवि गुणवत्ता के लिए अधिग्रहण पैरामीटर चुनें. प्रस्तुत नैनोसीटी डेटा के मामले में: 60 केवी के शिखर वोल्टेज पर अनुमानों का अधिग्रहण करें जिसमें 1599 अनुमान समान रूप से 360 डिग्री से अधिक वितरित किए गए हैं और लगभग 400 एनएम का वोसेल आकार है।
    नोट: 400 एनएम वोसेल आकार में प्राप्त एकल सीटी माप में घूर्णन अक्ष (विपरीत) की दिशा में 75 डिग्री मी का FOV और घूर्णन अक्ष (क्षैतिज) की ओर लम्बी दिशा में लगभग 560 डिग्री है। बड़ी मात्रा की जांच करने के लिए, रोटेशन अक्ष के साथ FOV का एक विस्तार विभिन्न ऊर्ध्वाधर पदों पर कई स्कैन के संयोजन के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, स्थानीय टोमोग्राफी स्कैन एक वैश्विक सीटी स्कैन के FOV द्वारा दिए गए से रोटेशन अक्ष के सीधा एक बड़ा नमूना व्यास के साथ नमूनों को मापने के लिए किया जा सकता है। नैनोसीटी डेटा को प्रति प्रक्षेपण 4 s के जोखिम समय के साथ प्राप्त किया गया था। इस प्रकार प्रति डेटा सेट कुल अधिग्रहण समय लगभग 3.5 एच था।
    नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है।
  4. सीटी डेटा के अधिग्रहण के बाद, 3 डी मात्रा के पुनर्निर्माण के लिए तदनुसार अनुमानों की प्रक्रिया.
    1. प्रस्तुत नैनोसीटी डेटा के मामले में, फ्लैटफील्ड छवियों के साथ अधिग्रहीत अनुमानों को सामान्य करें। एक रिचर्डसन-ल्यूसी deconvolution एल्गोरिथ्म30,31का उपयोग करके अनुमानों के तीखेपन को बढ़ाने . deconvolution कर्नेल के रूप में एक पिक्सेल के एक मानक विचलन के साथ एक बारी-बारी से सममित गाऊसी समारोह का प्रयोग करें।
    2. नरम ऊतक विपरीत बढ़ाने के लिए sharpened छवियों के लिए Paganin के चरण-पुनर्प्राप्ति एल्गोरिथ्म लागू करें। छवि गुणवत्ता32का अनुकूलन करने के लिए एल्गोरिथ्म के मापदंडों सेट करें। एक राज्य के अत्याधुनिक फ़िल्टर्ड बैक प्रोएफ्लेम एल्गोरिथ्म के साथ पूर्वप्रसंस्कृत अनुमानों का पुनर्निर्माण।
      नोट: चित्र 3 संबंधित हिस्टोलॉजिकल खंडों के साथ प्राप्त नैनोसीटी डेटा का मूल्यांकन करता है, जो लगभग 7 डिग्री उ मोटी थी। इसलिए, लगभग 7 डिग्री की एक आभासी मोटाई के साथ 18 आसन्न नैनोसीटी स्लाइस की न्यूनतम तीव्रता प्रक्षेपण स्लाइस प्रासंगिक स्लाइस में प्रत्येक पिक्सेल के लिए न्यूनतम मूल्य की गणना के माध्यम से उत्पन्न किए गए थे। नैनोसीटी डेटा की मात्रा को रेंडर करने के लिए एक दृश्यावलोकन सॉफ्टवेयर का उपयोग किया गया था, जो चित्र 4में प्रदर्शित होता है।

Representative Results

चित्रा 1 धुंधला करने के बाद विपरीत वृद्धि पर प्रकाश डाला कम संकल्प microCT डेटा की सीटी स्लाइस और मात्रा प्रतिपादन से पता चलता है। चित्र ााााने कांड सीटी स्लाइस और संपूर्ण माउस गुर्दे के स्थानीय टोमोग्राफी से प्राप्त उच्च-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोसीटी डेटा की मात्रा प्रतिपादन दिखाया गया है. चित्र 3 संबंधित हिस्टोलॉजिकल अनुभागों की तुलना में नैनोसीटी डेटा के सीटी स्लाइस को दर्शाता है। चित्र ााा्वित से पता चलता है कि सेल्युलर स्तर पर संरचनात्मक विवरणों को उजागर करने वाले नैनोसीटी डेटा का सीटी स्लाइस और वॉल्यूम रेंडरिंग। कम संकल्प microCT माप पूरे अंग के एक सिंहावलोकन के लिए अनुमति देता है और उच्च संकल्प microCT माप के लिए ब्याज की मात्रा (VOIs) की पहचान करने में मदद करता है. इस multiscale दृष्टिकोण के माध्यम से, नैनोसीटी के लिए VOI निर्धारित किया जाता है. नैनोसीटी सेलुलर स्तर पर नरम ऊतक नमूने का एक बहुत विस्तृत दृश्य सक्षम बनाता है। इसी हिस्टोलॉजिकल अनुभाग के साथ तुलनात्मक अध्ययन हिस्टोपैथोलॉजी के साथ पूर्ण संगतता पर प्रकाश डाला गया है। यहाँ, multimodal इमेजिंग दृष्टिकोण दोनों तौर तरीकों के साथ प्राप्त परिणामों की पुष्टि है.

Figure 1
चित्र 1. सीटी स्लाइस और कम संकल्प microCT डेटा की मात्रा प्रतिपादन. (क)ईओसिन-आधारित धुंधला प्रोटोकॉल के अनुप्रयोग के बाद प्राप्त विषम वृद्धि पर प्रकाश डालते हुए, क्रमशः धुंधला करने से पहले और बाद में एक ही माउस गुर्दे की छवियों का अवलोकन करना। दोनों microCT डेटा सेट समान अधिग्रहण पैरामीटर का उपयोग कर प्राप्त किए गए थे। दोनों डेटा सेट में voxel आकार 12 डिग्री उ है। (ख) में प्राप्त इसके विपरीत वृद्धि निम्नलिखित परमाणु संरचनात्मक क्षेत्रों की पहचान में सक्षम बनाता है: कॉर्टेक्स (I), बाहरी मेडुला (II) बाहरी मेडुला (आईआईए) की बाहरी पट्टियों में और अधिक भेद के साथ और बाहरी मेडुला (आईआईबी), आंतरिक मेडुला (तृतीय), पिप्पल (IV) और गुर्दे श्रोणि (वी)। (ग)माइक्रोसीटी डेटा का वॉल्यूम रेंडरिंग जो पूरे माउस गुर्दे के माध्यम से एक आभासी सैगिटल अनुभाग दिखाता है। यह आंकड़ा Busse और M$ller एट अल से संशोधित किया गया है26कृपया यहाँ क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.

Figure 2
चित्र 2. विकसित eosin आधारित धुंधला प्रोटोकॉल के आवेदन के बाद एक ही माउस गुर्दे से व्युत्पन्न उच्च संकल्प microCT डेटा की सीटी टुकड़ा और मात्रा प्रतिपादन. (क)बाएँ कोने में प्रदर्शित उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवि के लिए ROI (नीले बॉक्स) को हाइलाइट करते हुए अवलोकन microCT छवि दिखाता है. निम्नलिखित परमाणु संरचनात्मक क्षेत्रों की पहचान की जाती है: कॉर्टेक्स (I), बाहरी मेडुला (द्वितीय) बाहरी मेडुला (आईआईए) की बाहरी पट्टियों और बाहरी मेडुला (आईआईबी), आंतरिक मेडुला (III), लघु कैलिक्स (IV) और जहाजों (वी और VI) में और अधिक अंतर के साथ। (ख)3ण्3 डिग्री उ के वोसेल आकार के साथ प्राप्त उच्च-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोसीटी डेटा के ब्याज प्रतिपादन की मात्रा। मेडुला क्षेत्र और पूरे गुर्दे की एक स्थानीय टोमोग्राफी से व्युत्पन्न एक पोत के माध्यम से एक आभासी खंड दिखाया गया है। यह आंकड़ा Busse और M$ller एट अल26से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. विकसित eosin आधारित धुंधला प्रोटोकॉल के आवेदन के बाद एक ही माउस गुर्दे से व्युत्पन्न हिस्टोलॉजिकल वर्गों (ग, डी) की तुलना में नैनोसीटी डेटा के सीटी स्लाइस (क, ख)। (ं)दाग लगाने, विच्छेदन और सीपीडी के बाद उसी माउस गुर्दे के नमूने की नैनोसीटी छवि चित्र 1 और चित्र 2में देखी गई क्षेत्र (आईआईबी) की विस्तृत संरचनाओं को दर्शाती है। ये Henle के पाश की मोटी आरोही अंगों के रूप में जाना जाता है। (ख)न्यूनतम तीव्रता प्रक्षेपण टुकड़ा लगभग 7 डिग्री सेल्सियस की एक आभासी टुकड़ा मोटाई के साथ (एक) में दिखाया गया है, जो सेल नाभिक के स्पष्ट दृश्य के लिए अनुमति देता है में दिखाया गया है एक ही नैनोसीटी डेटा सेट से व्युत्पन्न। (ग)प्रतिनिधि हिस्टोलॉजिकल अनुभाग जिसमें सेल नाभिक और ब्रश बॉर्डर के स्पष्ट दृश्य के साथ हेनले के लूप के मोटे आरोही अंगों को प्रदर्शित किया जाता है। हिस्टोलॉजिकल अनुभाग में 7 डिग्री मीटर की अनुमानित मोटाई है और लागू ईओसिन-आधारित दाग और एक पैराफिन ब्लॉक में एम्बेड करने के बाद एक ही माउस गुर्दे के नमूने से प्राप्त किया गया था। (घ)प्रतिनिधि हिस्टोलॉजिकल अनुभाग जिसमें प्रतिस्थाओं के साथ हेमेटॉक्सिलिन को बैंगनी रंग में सेल नाभिक पर प्रकाश डाला गया है। 7 डिग्री उ की अनुमानित मोटाई के साथ (ग) में दिखाए गए अनुभाग के निकट हिस्टोलॉजिकल अनुभाग तैयार करना. यह आंकड़ा Busse और M$ller एट अल से संशोधित किया गया है26कृपया यहाँ क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.

Figure 4
चित्र 4. नैनोसीटी डेटा का सीटी स्लाइस और वॉल्यूम रेंडरिंग. (क)उसी माउस गुर्दे के नमूने की नैनोसीटी छवि, जो हेनले के लूप के मोटे आरोही अंगों के रूप में जानी जाने वाली संरचनाओं को दर्शाती है। यह आंकड़ा 1 में देखा क्षेत्र (IIb) का एक विस्तृत दृश्य है और लगभग 400 एनएम के एक voxel आकार के साथ गुर्दे के एक छोटे से टुकड़े से प्राप्त चित्र2. नमूने की तैयारी में दाग लगाना, विच्छेदन और सीपीडी (ख) हेनले के छोरों के मोटे आरोही अंगों की 3 डी संरचना को विज़ुअलाइज़ करने वाले नैनोसीटी डेटा की मात्रा प्रतिपादन शामिल है। यह आंकड़ा Busse और M$ller एट अल से संशोधित किया गया है26कृपया यहाँ क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.

Discussion

वर्तमान में, eosin सेल कोशिकाद्रव्य लेबल करने के लिए मानक हिस्टोलॉजिकल प्रोटोकॉल के रूप में प्रयोग किया जाता है। दागएजेंट को 0.1% (w/v) के रूप में लागू किया जाता है, जो कोमल ऊतक के सूक्ष्म स्लाइसों के लिए जलीय समाधान (आमतौर पर 2-10 डिग्री मी की मोटाई के साथ काटा जाता है)33. इस मानकीकृत हिस्टोलॉजिकल प्रोटोकॉल के आवेदन 3 डी ऊतक के नमूने के लिए इस तरह के एक पूरे माउस गुर्दे के रूप में एक क्षीणन इसके विपरीत बढ़ाया सीटी छवि में परिणाम नहीं है. एक तरफ, यह आम तौर पर प्रयोगशाला आधारित microCT प्रणालियों के एक्स-रे ऊर्जा के लिए नरम ऊतक के कम आंतरिक क्षीणन गुणों के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है. आमतौर पर, नरम ऊतक मुख्य रूप से कार्बन, हाइड्रोजन, ऑक्सीजन और नाइट्रोजन34से बना है, और इसलिए, इसके विपरीत वृद्धि में परिणाम नहीं है. दूसरी ओर, धुंधला करने के लिए इस्तेमाल किया eosin की कम एकाग्रता सीमित कारक था. यद्यपि एक ईओसिन अणु में चार ब्रोमाइड परमाणु (उच्च परमाणु संख्या तत्व ब्रोमीन के साथ र् 3534) होते हैं, फिर भी एक्स-रे सीटी इमेजिंग के लिए आवश्यक संवेदनशीलता स्तर पूरे नहीं हुए।

कम क्षीणता विपरीत की इस चुनौती पर काबू पाने के लिए, eosin के कई सांद्रता की जांच की गई. एक सीमा यहाँ पानी में eosin की अधिकतम घुलनशीलता है, जो एक जलीय समाधान में 30% (w/v) है. नरम ऊतक के भीतर सबसे अच्छा क्षीणन विपरीत वृद्धि उच्चतम eosin एकाग्रता, जो Lambert-बीयर कानून के अनुसार की उम्मीद थी के साथ मनाया गया था. इसलिए, अंतिम धुंधला प्रोटोकॉल उच्चतम एकाग्रता के साथ किया गया था.

सवाल कैसे आगे इसके विपरीत वृद्धि में सुधार करने के लिए धुंधला प्रक्रिया के लिए एक आणविक स्तर पर बेहतर नरम ऊतक तैयार करने के लिए पीएच समायोजन द्वारा उत्तर दिया गया था. यहाँ, निर्धारण के दौरान या धुंधला करने से पहले नरम ऊतक नमूने का अम्लीकरण महत्वपूर्ण पाया गया. यह भी हांगकांग एट अल35द्वारा दिखाया गया था. एसिड द्वारा सेल साइटोप्लाज्म के भीतर धुंधला एजेंट के उच्च संचय बेहतर आयनिक बातचीत के माध्यम से प्राप्त किया गया था, जो सेल साइटोप्लाज्म के भीतर मौजूद प्रोटीन और पेप्टाइड्स के एमिनो एसिड साइड चेन के प्रोटोन का परिणाम था। एक गैर-सगाहुआ नरम ऊतक नमूने की तुलना में इसके विपरीत वृद्धि को हाइलाइट करने वाला एक प्रतिनिधि परिणाम चित्र 1a,bमें दिखाया गया है। यहाँ, एक पूरे माउस गुर्दे का एक संरचनात्मक अवलोकन प्रांतस्था, मेडुला, पपीला और गुर्दे श्रोणि जैसे महत्वपूर्ण शारीरिक क्षेत्रों visualizing हासिल किया गया था.

प्रस्तुत धुंधला प्रोटोकॉल लागू करने के लिए सरल है और केवल तीन कदम शामिल हैं. आवश्यक अभिकर्मकों को आसानी से पहुँचा जा सकता है. 24 घंटे के समग्र धुंधला समय एक पूरे अंग धुंधला के लिए तेजी से है, जो नरम ऊतक नमूने के 3 डी दृश्य सक्षम बनाता है (चित्र 1ग, चित्र 2ख और चित्रा 4ख) पर एक प्रयोगशाला वातावरण में सेलुलर स्तर के लिए नीचे कई तराजू. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि समग्र धुंधला समय और धुंधला समाधान की मात्रा की जरूरत नमूने की प्रकृति के आधार पर कुछ रूपांतरों का अनुरोध हो सकता है. फिर भी, eosin आधारित धुंधला प्रोटोकॉल पूरे अंग धुंधला है, जो तब पूरे अंगों के उच्च संकल्प microCT इमेजिंग सक्षम बनाता है के लिए उपयुक्त है. विलायक इथेनॉल, जो microCT माप के दौरान नमूना नम रखने के लिए इस्तेमाल किया गया था के कारण हटना कलाकृतियों, नहीं देखा गया. अतिरिक्त तैयारी कदम नैनोसीटी इमेजिंग के लिए आवश्यक हैं, जो मूल नमूने से प्राप्त छोटे ऊतक टुकड़ों की जांच के लिए अनुमति देता है। भविष्य के हिस्टोपैथोलॉजिकल अनुप्रयोगों के संबंध में, अवलोकन स्कैन परिवर्तित शारीरिक क्षेत्रों और संरचनाओं में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा, जो ROIsके निर्धारण के लिए अनुमति देते हैं जैसा कि चित्र 2एमें दिखाया गया है। इनका अध्ययन माइक्रोसीटी द्वारा 3डी में किया जा सकता है (चित्र 1ग और चित्र 2ख) या नैनोसीटी ( चित्र4ख) और 2डी में ऊतक विज्ञान के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है ( चित्र3) .

प्रोटोकॉल की एक और ताकत एच एंड ई धुंधला प्रक्रिया के संबंध में हिस्टोपैथोलॉजी के साथ पूर्ण संगतता में देखा जाता है। थोक नमूनों के लिए eosin आधारित धुंधला प्रक्रिया के आवेदन आगे हिस्टोलॉजिकल जांच में बाधा नहीं है (चित्र 3),भले ही लागू eosin एकाग्रता हिस्टोलॉजिकल धुंधला समाधान की तुलना में बहुत अधिक है. लगभग 400 दउ की आभासी मोटाई के साथ नैनोसीटी स्लाइस (चित्र 3क) पहले से ही हिस्टोलॉजिकल सेक्शन(चित्र 3ग)से बहुत अच्छी तरह तुलना करता है , जो संगत नरम ऊतक नमूने से प्राप्त किया गया था। 7-10 डिग्री के साथ एक हिस्टोलॉजिकल अनुभाग की अनुमानित मोटाई को ध्यान में रखते हुए, नैनोसीटी डेटा के न्यूनतम तीव्रता प्रक्षेपण स्लाइस की पीढ़ी (चित्र 3ख),जो लगभग 7 डिग्री मी की आभासी मोटाई के अनुरूप है, एक के लिए अनुमति देता है हिस्टोलॉजिकल अनुभाग के साथ बेहतर तुलना (चित्र 3ग) यहाँ, कोशिका नाभिक स्पष्ट रूप से गैर क्षीणन क्षेत्र के रूप में प्रकट कर रहे हैं के रूप में eosin विशेष रूप से दाग प्रोटीन और पेप्टाइड्स सेल कोशिका द्रव्य33में.

मानक हिस्टोलॉजिकल तरीकों के साथ आगे काउंटर धुंधला के आवेदन संभव है, भले ही मानक हिस्टोलॉजिकल धुंधला प्रक्रिया की तुलना में धुंधला के आदेश उलट गया था. सीटी के लिए विकसित eosin आधारित धुंधला प्रोटोकॉल के साथ पहले शुरू, hematoxylin के साथ उन eosin आधारित हिस्टोलॉजिकल वर्गों के काउंटर धुंधला द्वारा पीछा, पूर्ण संगतता के लिए अनुमति देता है और एक उच्च गुणवत्ता वाले दाग में परिणाम की उम्मीद फार्म प्रदर्शित उपस्थिति की. मेयर के खट्टे हेमेटॉक्सिलिन के साथ सेल नाभिक-विशिष्ट दाग को हिस्टोलॉजिकल अनुभाग पर लगाया गया था जिसमें कोशिका नाभिक को बैंगनी में हाइलाइट किया गया था (चित्र 3घ)। हिस्टोलॉजिकल काउंटर धुंधला के आवेदन वर्तमान में एच दाग तक ही सीमित है. अन्य मानक हिस्टोलॉजिकल काउंटर stainings जैसे आवधिक एसिड Schiff आधार, लोचिका वैन Gieson या गोमोरी चांदी के रूप में अच्छी तरह से इम्यूनोहिस्टोलॉजिकल तकनीकों के साथ संगतता के रूप में मूल्यांकन किया जाना है परीक्षण करने की जरूरत है.

eosin आधारित धुंधला प्रोटोकॉल के लिए अनुमति देता है (i) सेल कोशिका द्रव्य-विशिष्ट लक्ष्यीकरण, (ii) समरूप और पूर्ण धुंधला, (iii) आसान कार्यान्वयन, (iv) इस तरह के प्रसार के छल्ले के रूप में कलाकृतियों बनाने के बिना ऊतक के तेजी से प्रवेश, (v) के दाग बड़े और घने नरम ऊतक नमूने, और (vi) एच एंड ई दाग के संबंध में हिस्टोपैथोलॉजी के साथ पूर्ण संगतता. इन आवश्यकताओं को सेलुलर स्तर के नीचे नरम ऊतक के उच्च संकल्प एक्स-रे सीटी दृश्य की अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण हैं। हाल ही में विकसित नैनोसीटी उपकरणों के साथ संयोजन में12,36,37, आभासी हिस्टोलॉजिकल स्लाइस की विनाशकारी पीढ़ी जो पारंपरिक हिस्टोलॉजिकल डेटा के विपरीत और संकल्प में तुलनीय हैं संभव प्रदान की जाती है. इस संयुक्त दृष्टिकोण सूक्ष्म ऊतक संरचनाओं के 3 डी दृश्य के लिए एक मूल्यवान उपकरण के रूप में एक्स-रे सीटी की स्थापना में सक्षम हो जाएगा।

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम हिस्टोलॉजिकल चर्चा और Excillum एबी, स्वीडन में अत्यंत उपयोगी टीम के लिए डॉ एनकेन Drecoll धन्यवाद। हम उन्नत फोटोनिक्स (एमएपी) और DFG Gottfried Wilhelm Leibniz कार्यक्रम के लिए उत्कृष्टता म्यूनिख केंद्र के DFG क्लस्टर के माध्यम से वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं. इसके अलावा, इस अनुसंधान परियोजना को यूरोपीय संघ क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से मैरी स्कोडोस्का-क्यूरी अनुदान समझौते के तहत धन प्राप्त हुआ है। H2020-MSCA-IF-2015-703745-CONSALT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50-ml centrifuge tube by Falcon VWR 734-0453
Formaldehyde solution, 37% Carl Roth CP10.2 acid-free, stabilized with ~10% MeOH
Glacial acetic acid Alfa Aesar 36289.AP
Eosin Y disodium salt Sigma-Aldrich E4382 certified by Biological Stain Commission
Phosphate Buffered Saline (PBS) Merck L1825 Dulbecco's formualtion, w/o calcium and magnesium
Sample Tubes by Nalgene Carl Roth ATK5.1
Rocking Shaker ST5 CAT 60281-0000
Cellulose tissue paper VWR 115-0600
Forceps, by USBECK Laborgeräte VWR 232-0096
Microcentrifuge tubes by Eppendorf VWR 211-2120 safe-lock, 2.0 ml
Ethanol absolute by Baker Analyzed VWR 80252500
Disposable safety scalpel by Aesculap VWR  AESCBA210
Petri dish by Sterilin VWR 391-2019
Plastic pasteur pipette Carl Roth EA68.1 graduated, 1 ml
Desiccator by Duran VWR SCOT247826954
Silicone grease by Bayer Sigma-Aldrich 85404 high-vacuum
Carbon dioxide cylinder with standpipe Linde 3700113 10 kg, short
micro-porous treatment capsule PLANO GmbH 4614 pore size 78 µm (B)
Bal-Tec CPD 030 Bal-Tec AG CO2 as drying agent
Stemi 2000-C stereomicroscope with KL 1500 LCD Zeiss this stereomicroscope has been updated(1)
Zeiss Xradia Versa 500 Zeiss this microCT scanner has been updated(2)
Avizo Fire 8.1 Thermo Fisher Scientific
PILATUS detector as part of the nanoCT scanner Dectris single-photon counting detector(4,5); there are commercially availble nanoCT systems available (6,7)
nanofocus X-ray source as part of the nanoCT scanner Excillum high-flux nanofocus X-ray transmission tube(3); there are commercially availble nanoCT systems available(6,7)
(1) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS stereomicroscopes https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/Stereomikroskope/1006> (September 06, 2019).
(2) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS Xradia 510 Versa https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/zeiss-xradia-510-versa.html> (April 10, 2019).
(3) Nachtrab, F. et al. Development of a Timepix based detector for the NanoXCT project. Journal of Instrumentation 10 (11), C11009, (2015).
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(6) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS Xradia 810 Ultra https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/xradia-810-ultra.html> (April 9 2019).
(7) Company, G. E. GE product information: Phoenix nanotom m, https://www.gemeasurement.com/sites/gemc.dev/files/geit-31344en_nanotom_m_0517.pdf> (April 10, 2019).

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