Summary
En protokoll for 3D-visualisering av mikroskopiske vev strukturer ved hjelp av en røntgen spesifikk Fargemetode beregnet for X-ray beregnet tomografi presenteres.
Abstract
Vi viser en laboratorie BAS ert metode som kombinerer røntgen microCT og nanoCT med en spesifikk røntgen flekk, som er rettet mot celle cytoplasma. Den beskrevne protokollen er enkel å bruke, rask og egnet for større bløt vevsprøver. Den presenterte metodikk muliggjør karakterisering av avgjørende vev strukturer i tre dimensjoner og er demonstrert på en hel mus nyre. Den multiscale tilnærmingen gjør det mulig å bilde hele musen nyre og støtter valg av ytterligere volumer av interesse, som er ervervet med høyere oppløsninger som spenner inn i nanometer området. Derved gjengis Soft-vev morfologi med et lignende detaljnivå som tilsvarende histologiske lys mikroskopi bilder. Dypere innsikt i 3D-konfigurasjonen av vev strukturer oppnås uten å hindre videre undersøkelser gjennom histologiske metoder.
Introduction
Full karakterisering av bløt vevsprøver krever informasjon om 3D-vevet mikrostruktur. Den nåværende gullstandarden for prøve analyser av bløtvev er histopatologi. Vevet og cellulær morfologi av prøven utforskes i 2D i utvalgte områder av interesse (ROIs) ved hjelp av optiske mikroskopi1. Denne metoden har imidlertid flere ulemper. Utarbeidelsen av prøven er tidkrevende, komplisert, ødeleggende og utsatt for artefakter. De produserte mikroskopiske lysbildene gir bare 2D-informasjon parallelt med skjære planet. Ofte antall histologiske seksjoner, som er undersøkt, er begrenset på grunn av tidsbegrensninger2,3.
I de senere årene har området 3D-histologi utviklet seg. Her er virtuelle vev skiver fra alle ønsket romlig flyet tilgjengelig. Dette gjør det mulig for sporing av strukturer i hele prøven, noe som fører til en dypere forståelse av 3D vev arkitektur og strukturelle endringer knyttet til ulike patologi. Ulike metoder er utviklet for å oppnå generering av 3D-volumdata. De spenner fra seriell-delen basert tilnærminger, som bruker enten lys eller elektron mikroskopi4,5,6,7,8, til blokk-ansikt Imaging metoder, for eksempel episkopiske 3D Imaging eller blokk-Face skanning Electron mikroskopi7,8,9. Alle de nevnte metoder, men innebære enten skjæring eller ødelegge prøven helt, som ikke tillater for videre undersøkelser. Den oppnådde oppløsningen er svært avhengig av at skjære prosessen er utsatt for artefakter som beskrevet i konvensjonell histologi. Disse metodene lider også av innretting gjenstander.
3D X-ray Imaging teknikker som mikroskopiske og nanoscopic beregnet tomografi (microCT og nanoCT) Aspire å generere 3D høyoppløselig data uten ødeleggelse av vevsprøven. Så langt har den svake røntgen dempings kontrasten i bløtvev og den begrensede tilgangen til høye oppløsninger i et laboratoriemiljø svekket bruken for 3D-visualisering av mikroskopiske vevs strukturer. Nylige fremskritt mot laboratoriet-basert, høy oppløsning X-ray CT tillate oppløsninger godt under 1 μm10,11,12,13.
Mangelen på kontrast i bløtvev i konvensjonell demping-basert røntgenbilde er kompensert av farging agenter, som forbedrer X-ray demping kontrast. Farging agenter kjent fra andre Imaging teknikker som Osmium tetroxide (OsO4), jod kalium iodide (IKI) eller phosphotungstic acid (PTA) er ofte brukt14,15,16,17, 18,19,20,21,22,23,24,25. Fargestoffer som tillater (i) spesifikk biologisk målretting, (II) homogen og fullstendig farging, (III) enkel håndtering, (IV) rask inntrengning av vevet uten å skape gjenstander som diffusjon ringer, (v) store og tette vevs flekker, og (vi) full kompatibilitet med histopatologi er nødvendig for å etablere røntgen CT som verktøy for 3D-visualisering av mikroskopiske vev strukturer. I dette arbeidet viser vi hvordan Soft-vevsprøver er forberedt for røntgen CT Imaging med en cytoplasma-spesifikk X-ray flekk basert på eosin som oppfyller kravene nevnt ovenfor26.
Multiscale Imaging tilnærming sikrer vurdering av fargekvalitet gjennom en oversikt microCT måling og valg av volumer av interesse (VOIs) for videre høyoppløselige undersøkelser. Fargekvaliteten analyseres med fokus på farge parametre som (i) fullstendighet, (II) utseende på diffusjon ringer, (III) kontrastforbedring, (IV) utseende av CT-artefakter som streker og (v) homogenitet. Laboratoriet-basert nanoCT oppsett, som bruker geometrisk forstørrelse å nå oppløsninger ned til 100 NM, visualiserer Soft-vev morfologi på (sub)-Cellular Level10,27. En komparativ analyse av nanoCT skiver med tilsvarende histologiske lys mikroskopi bilder bekrefter reproduksjon av vev arkitektur med lignende detaljer på et mikroskopisk nivå i 2D, slik at histopathological karakterisering av vevet Eksempel. Denne detaljerte videoen protokollen er ment å øke bevisstheten og å fremheve potensialet i denne metodikken som ikke-destruktiv 3D Soft-vev Imaging verktøyet er av interesse for et bredt vitenskapelig samfunn som zoologer, biologer og helse Fagfolk.
Protocol
Forsiktig: ta kontakt med alle relevante sikkerhetsdatablad (muskel-og skjelettlidelser) før bruk. Flere av kjemikaliene som brukes i protokollen er akutt giftig og kreftfremkallende. Bruk all hensiktsmessig sikkerhetspraksis når du utfører farge protokollen, inkludert bruk av tekniske kontroller (avtrekks hette, glovebox) og personlig verneutstyr (vernebriller, hansker, laboratoriefrakk, full lengde bukser, lukket tå sko).
Brukte dyr:
Animal boliger ble utført ved Klinikum Rechts der Isar, Technical University of Munich i samsvar med EUs retningslinjer 2010/63. Orgel fjerning ble godkjent fra et internt Dyrevern komité av Klinikum Rechts der Isar, München, Tyskland (intern referansenummer 4-005-09). Alle prosedyrer var i samsvar med relevante retningslinjer og forskrifter. Alle laboratorier inspiseres for samsvar med OECD-prinsippene for god laboratoriepraksis.
1. Eosin fargeprotokoll
- For å fixate bløt vevsprøver, fyller du et 50-mL sentrifugerør med en bindemiddel oppløsning som inneholder 9,5 mL 4% (v/v) formaldehyd-oppløsning (FA) og 0,5 mL av bre eddiksyre (AA).
Merk: Forbered FA-løsningen fersk fra en 37% syre fri FA-løsning stabilisert med omtrentlig 10% metanol. Fortynne FA-løsningen videre med Dulbecco ' s fosfat bufret saltvann (DPBS). Velg DPBS uten kalsium og magnesium. Behold den fortynnede FA-løsningen ikke lenger enn en måned. Under forsuring er pH-verdien i den bindemiddel oppløsningen i endring fra nøytral til ca. 3.
FORSIKTIG: fordi FA er akutt organ giftig, etsende og kreftfremkallende, er bruk av en avtrekksvifte obligatorisk og hensiktsmessig verneutstyr må brukes.- Tilsett den nylig fjernede bløt vevsprøven til en 50-mL sentrifuge slange og kjøle 50-mL sentrifuge slangen for 24-72h.
Merk: protokollen kan stanses midlertidig her. - Vask bløt vevsprøven med DPBS-løsning for 1h.
- Tilsett den nylig fjernede bløt vevsprøven til en 50-mL sentrifuge slange og kjøle 50-mL sentrifuge slangen for 24-72h.
- For å farge den fiksert bløtvev prøven (f. eks, en hel mus nyre), plasser bløtvevet i 2 mL eosin Y-farging løsning og ruge prøven for 24 h. Oppbevar prøven på en horisontal riste plate for en jevn rocking (ca. 60 o/min) under inkubasjons Prosessen.
Merk: den eosin Y-farging-oppløsningen har en konsentrasjon på 30% (w/v) i destillert vann. Velg volum for farge løsningen på en slik måte at prøven er fullstendig dekket av farge løsningen, og la prøven bevege seg fritt i prøvebeholderen. Inkubasjonstiden kan variere for andre prøver og må justeres tilsvarende. - Etter farging, Fjern bløt vevsprøven nøye fra prøvebeholderen.
- Forsiktig fjerne overflødig av farging agent med cellulose silkepapir.
- Plasser den myke vevsprøven i en konisk prøve beholder over en etanol damp fase for oppbevaring og videre bruk.
Merk: Den koniske prøvebeholderen må alltid inneholde noen dråper 70% (v/v) etanol i bunnen av røret for å holde bløt vevsprøven fuktig og forhindre artefakter.
2. X-ray microCT Imaging
Merk: X-ray microCT-målingene ble utført med en microCT-skanner, som gir oversikt over CT-målinger (evnen til å avbilde hele prøven innenfor synsfeltet (FOV)) og ytelsen til CT-målinger med høy oppløsning (evnen til å fokusere på på en ønsket volum av interesse (VOI) av den samme prøven) ned til 1 μm.
- Monter den myke vevsprøven til en passende prøve holder. Sørg for at prøven sitter godt fast på prøveholderen, slik at prøven ikke beveger seg under røntgen CT-målingene.
- I tilfelle av farget mus nyre: Forbered en prøve holderen med to sentrifugerør, hvorved bunnen av en tube er avskåret. Lim de to sentrifuger rørene sammen ved hjelp av to-komponent lim. Sørg for en rett justering av sentrifuge rørene rundt rotasjons aksen. Vent til limet å stivne.
- Når prøve holderen er klar til bruk, overføre musen nyre i intakt sentrifuger tube, som holder noen dråper 70% (v/v) etanol i bunnen av røret.
Merk: stabiliteten i prøven er avgjørende. Ta deg tid til å forberede prøven for X-ray CT målinger. Den myke vev prøven holdes over en etanol damp fase for å holde prøven fuktig under X-ray CT målinger og hindre bløtvev prøven fra krymping og andre gjenstander. Den bløt vevsprøven bør ikke være i kontakt med løsningsmidlet for å obviate opphopning av løsningsmidlet rundt prøven under røntgen CT-måling, noe som kan føre til prøve bevegelse under målingen eller kan forårsake problemer under gjenoppbygging. Hvis prøveholderen ikke tillater å holde løsemiddel i bunnen, kan et cellulose papir fuktet med 70% (v/v) etanol plasseres i prøve holderen. Det bør bemerkes at krymping gjenstander på grunn av løsemiddel etanol ikke ble observert.
Merk: protokollen kan stanses midlertidig her.
- Etter nøye justering av prøven, velger du anskaffelses parametre for best bildekvalitet. I tilfelle av de presenterte microCT data, erverve skanningen på en topp spenning på 50 kV, en strøm av 3,5 W bruker 1601 anslag jevnt fordelt over 360 °.
Merk: anskaffelses parametrene for oversikten CT-skanning ble valgt for best bildekvalitet. Som sådan 0.39 x kameraet målet ble valgt til å dekke hele prøven innenfor synsfeltet (FOV). Dette resulterte i en effektiv pikselstørrelse på 12 μm. Eksponeringstiden på 2 s per projeksjon ga et godt signal til støyforhold. AVKASTNINGEN for CT-skanningen med høy oppløsning ble identifisert ved hjelp av microCT-dataene fra oversikts skanningen. MicroCT skannere ofte innlemme en integrert Programvareverktøyet, som gjør det mulig for nøyaktig valg av bestemt avkastning. For CT-data med høy oppløsning ble 4X-kameraets målsetting valgt, noe som resulterte i en effektiv pikselstørrelse på 3,3 μm. Her var det behov for en eksponeringstid på 15 s per projeksjon.
Merk: protokollen kan stanses midlertidig her. - Etter oppkjøpet av X-ray CT data, behandle anslagene tilsvarende for rekonstruksjon av 3D-volum. I tilfelle av de presenterte microCT data: rekonstruere røntgen CT data med den integrerte programvaren.
Merk: volum gjengivelser av microCT-dataene vist i figur 1 og figur 2 ble generert ved hjelp av en visualiserings programvare.
Merk: protokollen kan stanses midlertidig her.
3. X-ray nanoCT Imaging
Merk: X-ray nanoCT-skanneren er utviklet internt. Linsen ledig instrument er utstyrt med med en nanofocus X-rokke kilde og en enkelt-Foton opptellingen merker. 3D-data med oppløsninger ned til 100 NM kan genereres10. Vanligvis, nanoCT systemer inkluderer dem med X-rokke optisk er kommersielt anvendelig og ikke begrenset å det beskrevet nanoCT skanner.
- NanoCT prøveforberedelse
- Forbered VOIs av bløt vevsprøven. Skjær bløtvevet i svært små biter på ca 0,5 mm kant lengde ved hjelp av en skalpell og en stereomikroskopet. I tilfelle av musen nyre: Skjær musen nyre i to halvdeler langs den lengste aksen. Ta halvparten av musen nyre og forberede ulike anatomiske områder som nyre cortex og renal forlengede.
Merk: den andre halvere av musen nyre ble overført til histopatologi, der prøven ble innebygd i parafin og behandlet i henhold til å gi de typiske histologiske seksjoner som sett i Figur 3c og Figur 3d . - Overfør de små bitene før den første dehydrering skritt til en ny Petri parabol, hvor de forblir for alle etterfølgende trinn.
- Tørke prøvene ved hjelp av konsentrasjoner (alle v/v) i%: 50, 60, 70, 80, 90, 96 og 100 etanol balansert med destillert vann. Utfør hvert dehydrering trinn for 1 time hver.
Merk: protokollen kan stanses midlertidig her. Hold de små vevs bitene i 100% etanol over natten. - Kritisk punkt tørr (CPD) de små vev stykker.
Merk: anvendelsen av CPD muliggjør fullstendig dehydrering av vevsprøven ved å utveksle løsemiddel (her etanol) med tørking agent (her CO2). Dette har vært nødvendig for å sikre at prøven kan monteres til utvalgets innehavere av nanoCT, ikke beveger seg under målingen og kan plasseres svært nær røntgen kilden for å muliggjøre best geometrisk forstørrelse. Den nanoCT oppsett er basert på mer geometrisk forstørrelse, med forstørrelsesfaktor defineres som kilde-til-detektor avstand over kilde-til-sample avstand. Tørke teknikken ble først introdusert av Anderson for å bevare 3D-strukturen av biologiske prøver for elektron mikroskopi28. En oversikt over teknikken er gitt av Bray29.- Forhåndsutfylle vakuumkammeret med 100% etanol. Overfør de små vevs bitene inn i en mikro-porøs kapsel og plasser den i vakuumkammeret i CPD. Lukk systemet.
Merk: siden høyt trykk er involvert i CPD prosessen, sikre alle deler av CPD, spesielt beslag, er intakt og systemet er riktig lukket. - Avkjøl kammeret til 6-8 ° c og fyll opp med flytende CO2.
- Under omrøring, vent 3 min for å tillate riktig blanding av de to komponentene. Tøm kammeret forsiktig. Sørg for at prøve holderen fortsatt er dekket med løsemiddel. Gjenta dette trinnet ti ganger for å tillate fullstendig utskifting av etanol med CO2 i prøven.
- Etter den endelige fylling av kammeret med CO2, varme maskinen til det kritiske PUNKTET i co2 (31 ° c og 73.8 bar) etterfulgt av svært langsom utgivelse av gass co2 over en tid på 30 min.
Merk: utgivelsen av gassen bør foretas svært langsomt som ellers kondensere vann kan danne på prøven. Sørg for at temperaturen ikke faller under det kritiske punktet for CO2. Bare åpne CPD-maskinen når alt trykket er frigitt fra systemet. - Fjerne CPD vev brikkene raskt fra maskinen og holde dem i en ny Petri parabolen lagret i en desikator før videre bruk.
Merk: protokollen kan stanses midlertidig her.
- Forhåndsutfylle vakuumkammeret med 100% etanol. Overfør de små vevs bitene inn i en mikro-porøs kapsel og plasser den i vakuumkammeret i CPD. Lukk systemet.
- Forbered VOIs av bløt vevsprøven. Skjær bløtvevet i svært små biter på ca 0,5 mm kant lengde ved hjelp av en skalpell og en stereomikroskopet. I tilfelle av musen nyre: Skjær musen nyre i to halvdeler langs den lengste aksen. Ta halvparten av musen nyre og forberede ulike anatomiske områder som nyre cortex og renal forlengede.
- Monter CPD vev brikker til en passende prøve holderen. Sørg for at prøven sitter godt fast på prøveholderen, slik at prøven ikke beveger seg under CT-målingene. I tilfelle av CPD musen nyre vev brikker: lim vevet stykker med superlim til en prøve holderen.
Merk: enhver uønsket bevegelse av prøven under CT-målinger kan føre til problemer under volum rekonstruksjon-spesielt når anskaffe et datasett med nanometer Voxel størrelse.
Merk: protokollen kan stanses midlertidig her. - Etter nøye justering av prøven, velger du anskaffelses parametre for best bildekvalitet. I tilfelle av de presenterte nanoCT data: Skaff anslag på en topp spenning på 60 kV med 1599 anslag jevnt fordelt over 360 ° og en Voxel størrelse på ca 400 nm.
Merk: en enkelt CT-måling ervervet ved 400 nm Voxel størrelse har en FOV på 75 μm i retning av rotasjon aksen (vertikal) og ca 560 μm i retning vinkelrett på rotasjon aksen (horisontal). For å undersøke større volumer kan en utvidelse av FOV langs rotasjons aksen oppnås ved å kombinere flere skanninger med forskjellige vertikale posisjoner. I tillegg kan lokale tomografi skanninger utføres for å måle prøver med en større prøve diameter vinkelrett på rotasjons aksen enn gitt av FOV til en global CT-skanning. NanoCT-dataene ble anskaffet med eksponeringstid på 4 s per projeksjon. Som sådan den totale anskaffelses tiden per datasett var ca 3,5 h.
Merk: protokollen kan stanses midlertidig her. - Etter oppkjøpet av CT-data, behandle anslagene tilsvarende for rekonstruksjon av 3D-volum.
- I tilfelle av de presenterte nanoCT data, normalisere de oppnådde anslagene med flatfield bilder. Forbedre skarpheten av anslagene ved hjelp av en Richardson-Lucy deconvolution algoritme30,31. Bruk en rotasjons symmetrisk Gaussian-funksjon med et standardavvik på én piksel som deconvolution kjerne.
- Påfør Paganin ' s fase-henting algoritme til skjerpet bilder for å øke bløt-vev kontrast. Angi parametrene for algoritmen for å optimalisere bildekvaliteten32. Rekonstruere preprocessed projeksjoner med en State-of-the-art filtrert backprojection algoritme.
Merk: Figur 3 evaluerer de oppnådde nanoCT-dataene med tilsvarende histologiske seksjoner, som var ca. 7 μm tykke. Derfor, minimum intensitet projeksjon skiver av 18 tilstøtende nanoCT skiver med en virtuell tykkelse på ca 7 μm ble generert ved hjelp av beregning av minimumsverdien for hver piksel i de aktuelle sektorene. En visualisering programvare ble brukt til å gjengi volumet av nanoCT data, som vises i Figur 4.
Representative Results
Figur 1 viser CT skiver og volum gjengivelse av lav oppløsning microCT data utheving kontrast ekstrautstyr etter farging. Figur 2 viser CT skiver og volum gjengivelse av høyoppløselige microCT data avledet fra en lokal tomografi av hele musen nyre. Figur 3 viser CT skiver av nanoCT data i forhold til de tilsvarende histologiske seksjoner. Figur 4 viser CT Slice og volum gjengivelse av nanoCT data utheving strukturelle detaljer på cellenivå. MicroCT-målingen med lav oppløsning gir en oversikt over hele orgelet og bidrar til å identifisere volum av interesse (VOIs) for høyoppløselige microCT-målinger. Gjennom denne multiscale tilnærmingen er VOI for nanoCT bestemt. NanoCT muliggjør en svært detaljert visning av den myke vevsprøven på cellenivå. Den komparative studien med tilsvarende histologiske delen fremhever full kompatibilitet med histopatologi. Her er multimodal Imaging tilnærming bekrefter resultatene oppnådd med begge modaliteter.
Figur 1. CT-sektorer og volum gjengivelse av microCT-data med lav oppløsning. (a, b) oversikt bilder av samme mus nyre før og etter farging, henholdsvis, utheving kontrasten forsterkning innhentet etter påføring av eosin-baserte farging protokollen. Både microCT datasett ble anskaffet ved hjelp av identiske anskaffelses parametere. Voxel størrelse i begge datasettene er 12 μm. Kontrast forbedringen som oppnås i (b) muliggjør identifisering av følgende anatomiske strukturelle regioner: cortex (I), ytre FORLENGEDE (II) med ytterligere utmerkelse i ytre striper av ytre forlengede (IIA) og indre striper av ytre forlengede (IIB), indre forlengede (III), papilla (IV) og nyrebekken (V). (c) Volume gjengivelse av microCT data som viser en virtuell sagittal delen gjennom hele musen nyre. Dette tallet er blitt modifisert fra busse og Müller et al.26Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. CT Slice og volum gjengivelse av høyoppløselige microCT data avledet fra samme mus nyre etter påføring av utviklet eosin-baserte farging protokollen. (a) venstre hjørne viser oversikt MICROCT bilde utheving avkastningen (blå boks) for den viste Høyoppløselig bilde. Følgende anatomiske strukturelle regioner er identifiserbare: cortex (I), ytre forlengede (II) med ytterligere forskjell i ytre striper av ytre forlengede (IIa) og indre striper av ytre forlengede (IIb), indre forlengede (III), mindre Calyx (IV) og fartøy (V og VI). (b) volum av interesse gjengivelse av høyoppløselige microCT data ervervet med en Voxel størrelse på 3,3 μm. Den forlengede regionen og en virtuell del gjennom et fartøy avledet fra en lokal tomografi av hele nyrene er vist. Dette tallet er blitt modifisert fra busse og Müller et al.26. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. CT skiver av nanoCT data (a, b) i forhold til histologiske seksjoner (c, d) avledet fra samme mus nyre etter påføring av utviklet eosin-baserte farging protokollen. (a) nanoCT bilde av samme mus nyre prøve etter farging, dissekere og CPD viser detaljerte strukturer av regionen (IIB) sett i figur 1 og figur 2. Disse er kjent som tykke stigende lemmer av loopen av Henles. (b) minimal intensitet projeksjon skive avledet fra samme nanoCT datasett vist i (a) med en virtuell skive tykkelse på ca 7 μm, noe som gjør det mulig for klar visualisering av cellekjerner. (c) representative histologiske delen viser tykke stigende lemmer av loopen av henles med klar visualisering av cellekjerner og pensel grensen. Den histologiske delen har en omtrentlig tykkelse på 7 μm og ble Hentet fra samme mus nyre prøve etter anvendt eosin farging og innebygging i en parafin blokk. (d) representative histologiske seksjon med anvendelse av Counter stain hematoksylin fremheve cellekjerner i lilla. Utarbeidelse av histologiske delen nær den delen som vises i (c) med omtrentlig tykkelse på 7 μm. Dette tallet er blitt modifisert fra busse og Müller et al.26Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. CT Slice og volum gjengivelse av nanoCT data. (a) nanoCT bilde av samme mus nyre prøven viser strukturer kjent som tykke stigende lemmer av loopen av henles. Dette er en detaljert visning av regionen (IIb) sett i figur 1 og figur 2 ervervet fra en liten del av nyrene med en voxel størrelse på ca 400 nm. Utarbeidelse av prøven involvert farging, dissekere og CPD. (b) volum gjengivelse av nanoCT data visualisere 3D strukturen av tykke stigende lemmer av løkkene i henles. Dette tallet er blitt modifisert fra busse og Müller et al.26Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Foreløpig er eosin brukt som standard histologiske protokoll for å merke cellen cytoplasma. Den farging agent påføres som en 0,1% (w/v) vandig løsning på mikroskopiske skiver av bløtvev (vanligvis kuttet med en tykkelse på 2-10 μm)33. Anvendelsen av denne standardiserte histologiske protokollen til 3D vevsprøver som en hel mus nyre resulterer ikke i en demping kontrast forbedret CT bilde. På den ene siden, kan dette tilskrives den lave iboende demping egenskaper bløtvev for vanligvis brukt X-ray energier av laboratorie-baserte microCT systemer. Vanligvis er bløtvev sammensatt av hovedsakelig karbon, hydrogen, oksygen og nitrogen34, og derfor ikke resulterer i kontrast ekstrautstyr. På den annen side, den lave konsentrasjonen av eosin brukes til farging var begrensende faktor. Selv om en eosin molekyl har fire bromide atomer (høy Atom tall element brom med Z = 3534), følsomhet nivåer som kreves for røntgen CT Imaging ble ikke oppfylt.
For å overkomme denne utfordringen med lav dempings kontrast, ble det undersøkt flere konsentrasjoner av eosin. En begrensning er her den maksimale løselighet av eosin i vann, som er 30% (w/v) i en vandig løsning. Beste demping kontrast forsterkning innenfor bløtvevet ble observert med den høyeste eosin konsentrasjon, som var forventet i henhold til Lambert-Beer Law. Derfor ble den endelige farge protokollen utført med den høyeste konsentrasjonen.
Spørsmålet hvordan å forberede bløtvevet optimalt på et molekylnivå for farging prosedyren for å ytterligere forbedre kontrasten ekstrautstyr ble besvart av pH-justering. Her ble forsuring av prøven under fiksering eller før farging funnet å være avgjørende. Dette ble også vist av Hong et al.35. Jo høyere opphopning av farging agent i cellen cytoplasma av syre ble oppnådd gjennom forbedret ioniske interaksjoner, som var et resultat av protonation av aminosyre side kjeder av proteiner og peptider til stede i cellen cytoplasma. Et representativt resultat som fremhever kontrast forbedringen i forhold til et unstained eksempel, vises i figur 1a, b. Her, en strukturell oversikt over en hel mus nyre visualisere avgjørende anatomiske områder som cortex, forlengede, papilla og nyre bekkenet ble oppnådd.
Den presenterte farging protokollen er enkel å bruke og inneholder bare tre trinn. De nødvendige reagensene er lett tilgjengelige. Den generelle farging tid på 24 timer er rask for en hel-orgel farging, som muliggjør 3D-visualisering av Soft-vevsprøver (figur 1c, figur 2b og Figur 4b) i et laboratorium miljø på flere vekter ned til cellenivå. Det bør bemerkes at den generelle farging tid og volum av farging løsningen trengs kan be om noen tilpasninger avhengig av arten av prøven. Likevel er den eosin farge protokollen egnet for farging av hele orgel, som deretter muliggjør microCT avbildning av hele organer med høy oppløsning. Krymping gjenstander på grunn av løsemiddel etanol, som ble brukt til å holde prøven fuktig under microCT målinger, ble ikke observert. Ytterligere forberedelser trinn er nødvendig for nanoCT Imaging, som gjør det mulig for etterforskningen av mindre vev brikker Hentet fra den opprinnelige prøven. Med hensyn til fremtidige histopathological applikasjoner, vil oversikts skanninger gi verdifull innsikt i endrede anatomiske områder og strukturer, som tillater fastsettelse av ROIs som demonstrert i figur 2a. De kan bli studert i 3D av microCT (figur 1c og figur 2b) eller nanoCT (Figur 4b) og evaluert i 2D med histologi (Figur 3).
En annen styrke av protokollen er sett i full kompatibilitet med histopatologi med hensyn til H & E farge prosedyre. Anvendelsen av det eosin-basert farging fremgangsmåte å bulk eksemplar er ikke hindre fremme histologiske undersøkelser (skikkelsen 3), selv om det anvendt eosin konsentrasjonen er mange høyere sammenlignet med det histologiske flekk løsning. Den nanoCT skive med en virtuell tykkelse på ca 400 nm (Figur 3a) sammenligner allerede veldig godt med histologiske delen (Figur 3c), som var avledet fra den tilsvarende bløtvev prøven. Med tanke på den omtrentlige tykkelsen på en histologiske seksjon med 7-10 μm, vil genereringen av minste intensitet projeksjon skiver av nanoCT data (Figur 3b), som tilsvarer en virtuell tykkelse på ca 7 μm, gir en bedre sammenligning med histologiske delen (Figur 3c). Her er celle kjernene tydelig avslørt som ikke-demping området som eosin spesielt flekker proteiner og peptider i cellen cytoplasma33.
Anvendelsen av ytterligere motvirke farging med standard histologiske metoder er mulig, selv om rekkefølgen på farging i forhold til standard histologiske farging prosedyren ble reversert. Starter først med den utviklede eosin fargeprotokoll for CT, etterfulgt av Counter farging av de eosin-baserte histologiske seksjoner med hematoksylin, gir full kompatibilitet og resulterer i en høy kvalitet flekker som viser den forventede form av utseende. Cellekjerner-spesifikk farging med Mayer ' s Sure hematoksylin ble brukt til histologiske delen fremhever cellekjerner i lilla (Figur 3d). Anvendelsen av histologiske telleren farging er for tiden begrenset til H-stain. Andre standard histologiske mot farging som periodisk syre Schiff ' s base, gummitre van Gieson eller Gomori sølv må evalueres så vel som kompatibiliteten med immunohistological teknikker må testes.
Den eosin farge protokollen tillater (i) celle cytoplasma-spesifikk målretting, (II) homogen og fullstendig farging, (III) enkel implementering, (IV) rask inntrengning av vevet uten å skape gjenstander som diffusjon ringer, (v) farging av store og tette bløt vevsprøver og (vi) full kompatibilitet med histopatologi med hensyn til H & E-flekken. Disse kravene er viktig å tillate høy oppløsning X-ray CT visualisering av bløtvev ned til cellenivå. I kombinasjon med de nylig utviklede nanoCT enheter12,36,37, ikke-destruktiv generering av virtuelle histologiske skiver som er sammenlignbare i kontrast og oppløsning til konvensjonelle histologiske data gjengis mulig. Denne kombinerte tilnærmingen vil muliggjøre etablering av røntgen CT som et verdifullt verktøy for 3D-visualisering av mikroskopiske vev strukturer.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. enken Drecoll for histologiske diskusjoner og ekstremt hjelpsomme team ved Excillum AB, Sverige. Vi erkjenner finansiell støtte gjennom DFG Cluster of Excellence Munich Center for Advanced fotonikk (MAP) og DFG Gottfried Wilhelm Leibniz program. Videre har dette forskningsprosjektet fått støtte fra EU ' s Union Horizon 2020 forsknings-og innovasjonsprogram under Marie Skłodowska-Curie Grant Agreement no. H2020-MSCA-IF-2015-703745-CONSALT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50-ml centrifuge tube by Falcon | VWR | 734-0453 | |
| Formaldehyde solution, 37% | Carl Roth | CP10.2 | acid-free, stabilized with ~10% MeOH |
| Glacial acetic acid | Alfa Aesar | 36289.AP | |
| Eosin Y disodium salt | Sigma-Aldrich | E4382 | certified by Biological Stain Commission |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | L1825 | Dulbecco's formualtion, w/o calcium and magnesium |
| Sample Tubes by Nalgene | Carl Roth | ATK5.1 | |
| Rocking Shaker ST5 | CAT | 60281-0000 | |
| Cellulose tissue paper | VWR | 115-0600 | |
| Forceps, by USBECK Laborgeräte | VWR | 232-0096 | |
| Microcentrifuge tubes by Eppendorf | VWR | 211-2120 | safe-lock, 2.0 ml |
| Ethanol absolute by Baker Analyzed | VWR | 80252500 | |
| Disposable safety scalpel by Aesculap | VWR | AESCBA210 | |
| Petri dish by Sterilin | VWR | 391-2019 | |
| Plastic pasteur pipette | Carl Roth | EA68.1 | graduated, 1 ml |
| Desiccator by Duran | VWR | SCOT247826954 | |
| Silicone grease by Bayer | Sigma-Aldrich | 85404 | high-vacuum |
| Carbon dioxide cylinder with standpipe | Linde | 3700113 | 10 kg, short |
| micro-porous treatment capsule | PLANO GmbH | 4614 | pore size 78 µm (B) |
| Bal-Tec CPD 030 | Bal-Tec AG | CO2 as drying agent | |
| Stemi 2000-C stereomicroscope with KL 1500 LCD | Zeiss | this stereomicroscope has been updated(1) | |
| Zeiss Xradia Versa 500 | Zeiss | this microCT scanner has been updated(2) | |
| Avizo Fire 8.1 | Thermo Fisher Scientific | ||
| PILATUS detector as part of the nanoCT scanner | Dectris | single-photon counting detector(4,5); there are commercially availble nanoCT systems available (6,7) | |
| nanofocus X-ray source as part of the nanoCT scanner | Excillum | high-flux nanofocus X-ray transmission tube(3); there are commercially availble nanoCT systems available(6,7) | |
| (1) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS stereomicroscopes https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/Stereomikroskope/1006> (September 06, 2019). | |||
| (2) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS Xradia 510 Versa https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/zeiss-xradia-510-versa.html> (April 10, 2019). | |||
| (3) Nachtrab, F. et al. Development of a Timepix based detector for the NanoXCT project. Journal of Instrumentation 10 (11), C11009, (2015). | |||
| (4) Kraft, P. et al. Performance of single-photon-counting PILATUS detector modules. Journal of Synchrotron Radiation 16 (3), 368-375, (2009). | |||
| (5) Kraft, P. et al. Characterization and calibration of PILATUS detectors. IEEE Transactions on Nuclear Science 56 (3), 758-764, (2009). | |||
| (6) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS Xradia 810 Ultra https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/xradia-810-ultra.html> (April 9 2019). | |||
| (7) Company, G. E. GE product information: Phoenix nanotom m, https://www.gemeasurement.com/sites/gemc.dev/files/geit-31344en_nanotom_m_0517.pdf> (April 10, 2019). |
References
- Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. Theory and Practice of Histological Techniques. 7th edn. , Churchill Livingstone Elsevier. (2013).
- Chatterjee, S. Artefacts in histopathology. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 18 (4), 111-116 (2014).
- McInnes, E. Artefacts in histopathology. Comparative Clinical Pathology. 13 (3), 100-108 (2005).
- Andreasen, A., Drewes, A., Assentoft, J., Larsen, N. Computer-assisted alignment of standard serial sections without use of artificial land-marks. A practical approach to the utilization of incomplete information in 3-d reconstruction of the hippocampal region. Journal of Neuroscience Methods. 45 (3), 199-207 (1992).
- Braverman, M. S., Braverman, I. M. Three-dimensional reconstructions of objects from serial sections using a microcomputer graphics system. Journal of Investigative Dermatology. 86 (3), 290-294 (1986).
- Denk, W., Hortsmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).
- Mohun, T. J., Weninger, J. W. Imaging heart development using high-resolution episcopic microscopy. Current Opinion in Genetics and Development. 21, 573-578 (2011).
- Weninger, J. W., Meng, S., Streicher, J., Müller, G. B. A new episcopic method for rapid 3-d reconstruction: applications in anatomy and embryology. Anatomy and Embryology. 197 (5), 341-348 (1998).
- Odgaard, A., Andersen, K., Melsen, F., Gundersen, H. J. G. A Direct Method for Fast 3-Dimensional Serial Reconstruction. Journal of Microscopy. 159, 335-342 (1990).
- Müller, M., et al. Myoanatomy of the velevt worm leg revealed by labratory-based nanofocus X-ray source tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12378-12383 (2017).
- Salomon, M., Hanke, R., Krüger, P., Uhlmann, N., Voland, V. Realization of a computed tomography setup to achieve resolutions below 1 µm. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A. 591, 50-53 (2008).
- Tkachuk, A., et al. X-ray computed tomography in Zernike phase contrast mode at 8 keV with 50-nm resolution using Cu rotating anode X-ray source. Zeitschrift für Kristallographie. 222, 650-655 (2007).
- Withers, P. J. X-ray nanotomography. Materials Today. 10, 26-34 (2007).
- Jahn, H., et al. Evaluation of contrasting techniques for X-ray imaging of velvet worms (Onychophora). Journal of Microscopy. 270 (3), 343-358 (2018).
- Martins de S. e Silva, J., et al. Three-dimensional non-destructive soft-tissue visualization with X-ray staining micro-tomography. Scientific Reports. 5, 14088 (2015).
- Metscher, B. D. MicroCT for Developmental Biology: A Versatile Tool for High-Contrast 3D Imaging at Histological Resolutions. Developmental Dynamics. 238, 632-640 (2009).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
- Mitzutani, R., et al. X-Ray Microtomographic Imaging of Three-Dimensional Structure of Soft Tissues. Tissue Engineering Part C: Methods. 14 (4), 359-363 (2008).
- Pauwels, E., Loo, D. v, Cornillie, P., Brabant, L., Hoorebeke, L. v An exploratory study of contrast agents for soft tissue visualization by means of high resolution X-ray computed tomography imaging. Journal of Microscopy. 250, 21-31 (2013).
- Degenhardt, K., Wright, A. C., Horng, D., Padmanabhan, A., Epstein, J. A. Rapid 3D phenotyping of cardiovascular development in mouse embryos by micro-CT with iodine staining. Circulation: Cardiovascular Imaging. 3 (3), 314-322 (2010).
- Dullin, C., et al. μCT of ex-vivo stained mouse hearts and embryos enables a precise match between 3D virtual histology, classical histology and immunochemistry. PLOS ONE. 12 (2), 0170597 (2017).
- Jeffrey, N. S., Stephenson, R. S., Gallagher, J. A., Cox, P. Micro-computed tomography with iodine staining resolves the arrangement of muscle fibres. Journal of Biomechanics. 44, 189-192 (2011).
- Johnson, J. T., et al. Virtual Histology of Transgenic Mouse Embryos for High-Throughput Phenotyping. PLOS Genetics. 2, 61 (2006).
- Leszczyński, B., et al. Visualization and Quantitative 3D Analysis of Intraocular Melanoma and Its Vascularization in a Hamster Eye. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 332 (2018).
- Mizutani, R., Suzuki, Y. X-ray microtomography in biology. Mircon. 43, 104-115 (2012).
- Busse, M., et al. Three-dimensional virtual histology enabled through cytoplasm-specific X-ray stain for microscopic and nanoscopic computed tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2293-2298 (2018).
- Müller, M., et al. Non-destructive high-resolution 3D virtual histology enabled through a cell nucleus-specific stain for X-ray computed tomography. Scientific Reports. 8, 17855 (2018).
- Anderson, T. F. Techniques for the preservation of three-dimensional structure in preparing specimens for the electron microscope. Transactions of the New York Academy of Sciences. 13 (4), Series II 130-134 (1951).
- Bray, D. Supercritical Fluid Methods and Protocols. Methods in Biotechnology. Williams, J. R., Clifford, A. A. 13, Humana Press. 235-243 (2000).
- Lucy, L. B. An iterative technique for the rectification of observed distributions. The Astronomical Journal. 79, 745-765 (1974).
- Richardson, W. H. Bayesian-Based Iterative Method of Image Restoration. The Journal of the Optical Society of America. 62 (1), 55-59 (1972).
- Paganin, F., Mayo, S. C., Gureyev, T. E., Miller, P. R., Wilkins, S. W. Simultaneous phase and amplitude extraction from a single defocused image of a homogeneous object. Journal of Microscopy. 206, 33-40 (2002).
- Riedelsheimer, B., Büchl-Zimmermann, S. Mikroskopische Technik. Mulisch, M., Welsch, U. , Spektrum-Verlag GmbH. Berlin Heidelberg. Ch. 10 193-194 (2015).
- Hubbell, J. H., Seltzer, S. M. Tables of Xray mass attenuation coefficients and mass energy-absorption coefficients from 1 keV to 92 keV and 48 additional substances of dosimetric interest, Table 3. National Institute of Standards and Technology. , (1995).
- Hong, H. Y., Yoo, G. S., Choi, J. K. An Eosin Y Method for Protein Determination in Solution. Analytical Letters. 32 (12), 2427-2442 (1999).
- Dierick, M., et al. Recent Micro-CT Scanner Developments at UGCT. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B. 324, 35-40 (2014).
- Kastner, J., Plank, B., Heinzl, C. Advanced X computed tomography methods: High resolution CT, quantitative CT, 4DCT and phase contrast CT. Proceedings of Digital Industrial Radiology and Computed Tomography. , 120-132 (2015).
