Summary
X線コンピュータ断層撮影用に設計されたX線特異的染色法を用いた顕微鏡組織構造の3D可視化のためのプロトコルを提示する。
Abstract
X線マイクロCTとナノCTを細胞細胞質を標的とする特定のX線染色と組み合わせた実験室ベースの方法を実証する。記載されたプロトコルは適用が容易で、高速で、より大きな軟部組織サンプルに適しています。提示された方法論は、3次元の重要な組織構造の特徴付けを可能にし、マウス腎臓全体で実証される。マルチスケールアプローチは、マウス腎臓全体を画像化することができ、ナノメートルの範囲に及ぶより高い解像度で取得される関心のさらなるボリュームの選択をサポートしています。それにより、対応する組織学的光顕微鏡画像と同様の詳細レベルを有する軟組織形態が再現される。組織構造の3D構成に関するより深い洞察は、組織学的方法を介してさらなる調査を妨げることなく達成される。
Introduction
軟組織標本の完全な特徴付けは、3D組織の微細構造に関する情報を必要とする。軟組織サンプル分析のための現在の金標準は組織病理学である。検体の組織および細胞形態は、光学顕微鏡1を用いて目的の選択された領域(ROI)内の2Dで探索される。ただし、この方法にはいくつかの欠点があります。サンプルの準備は、時間がかかり、複雑で、破壊的で、アーティファクトが発生しやすくなります。生成された顕微鏡スライドは、断面に平行な2D情報のみを提供します。多くの場合、調査される組織学的セクションの数は、時間の制約2、3に制限されます。
近年、3Dヒストロジーの分野が進化しています。ここで、任意の所望の空間平面からの仮想組織スライスにアクセス可能である。これにより、サンプル全体の構造の追跡が可能になり、3D組織アーキテクチャと異なる病理に関連する構造変化をより深く理解できます。3D体積データの生成を実現するために、様々な方法が開発されています。光または電子顕微鏡4、5、6、7、8を使用するシリアルセクションベースのアプローチから、エピスコピック3Dイメージングなどのブロック面イメージング方法まで多岐にわたる。またはブロック面走査型電子顕微鏡7,8,9.ただし、上記のすべての方法には、サンプルを完全に断面化または破棄する必要があり、それ以上の調査はできません。得られた解像度は、従来の組織学で説明されているようにアーティファクトを受けやすい断面化プロセスに大きく依存する。これらのメソッドは、アライメントアーティファクトにも苦しみます。
顕微鏡やナノスコピックコンピュータ断層撮影(microCTおよびnanoCT)などの3D X線イメージング技術は、組織サンプルを破壊することなく3D高解像度データを生成することを目指しています。これまでのところ、軟部組織の弱いX線減衰コントラストと実験室環境での高解像度へのアクセスの制限は、顕微鏡組織構造の3D可視化のための使用を損なっている。実験室ベースの高解像度X線CTに向けた最近の進歩は、1μm10、11、12、13をはるかに下回る分解能を可能にする。
従来の減衰ベースのX線イメージングにおける軟部組織におけるコントラストの欠如は、染色剤によって補償され、X線減衰コントラストを高める。四酸化オスミウム(OsO4)、ヨウ化ヨウ素カリウム(IKI)またはホスホトンチン酸(PTA)などの他のイメージング技術から知られている染色剤は、しばしば14、15、16、17、使用される。 18、19、20、21、22、23、24、25 。(i)特異的生物学的ターゲティングを可能にする染色剤、(ii)均質かつ完全な染色、(iii)容易な取り扱い、(iv)拡散リング、(v)大型で緻密な組織染色、および(vi)などのアーティファクトを作成することなく組織の高速浸透、および(vi)組織病理学との完全な互換性は、顕微鏡組織構造の3D可視化のためのツールとしてX線CTを確立するために必要とされる。本研究では、26以上の要件を満たすエオシンに基づく細胞質特異的X線染色を用いたX線CTイメージングのために軟組織試料がどのように調製されるかを示す。
マルチスケールイメージングアプローチは、概要microCT測定と関心のあるボリューム(VOI)の選択を通じて染色品質の評価を保証し、さらなる高解像度の調査を行います。染色品質は、(i)完全性、(ii)拡散リングの外観、(iii)コントラスト増強、(iv)ストリークなどのCTアーティファクトの外観および(v)均質性などの染色パラメータに着目して分析される。実験室ベースのnanoCTセットアップは、幾何学的な倍率を使用して100nmまでの解像度に達し、(サブ)細胞レベル10、27上の軟組織形態を可視化する。対応する組織学的光顕微鏡画像を用いたnanoCTスライスの比較分析により、2Dの顕微鏡レベルで同様の詳細を有する組織アーキテクチャの再生が確認され、組織の組織病理学的特徴付けが可能サンプル。この詳細なビデオプロトコルは、認知度を高め、動物学者、生物学者、健康などの広範な科学界に関心を持つ非破壊的な3D軟組織イメージングツールとしてのこの方法論の可能性を強調することを目的としています。専門家。
Protocol
注意: 使用前に関連するすべての材料安全データシート(MSDS)を参照してください。プロトコルで使用される化学物質のいくつかは、急性毒性および発癌性である。エンジニアリングコントロール(ヒュームフード、グローブボックス)および個人用保護具(安全メガネ、手袋、ラボコート、全長ズボン、クローズドつま先シューズ)の使用を含む染色プロトコルを実行する際には、すべての適切な安全対策をご使用ください。
使用される動物:
動物住宅は、欧州連合ガイドライン2010/63に従ってミュンヘン工科大学クリニクム・レヒト・デア・イサールで行われました。臓器除去は、クリニクム・レヒト・デル・イサール、ミュンヘン、ドイツの内部動物保護委員会(内部参照番号4-005-09)から承認された。すべての手順は、関連するガイドラインと規制に従っていました。すべての実験室はよい実験室の練習のOECDの原則に従って点検される。
1. エオシン染色プロトコル
- 軟部組織試料を固定するには、50mL遠心チューブに、9.5mLの4%(v/v)ホルムアルデヒド溶液(FA)と0.5mLの氷酢酸(AA)を含む固定液を充填します。
注:約10%のメタノールで安定化した37%酸フリーFA溶液から新鮮なFA溶液を調製します。ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)でさらにFA溶液を希釈します。カルシウムとマグネシウムを含まないDPBSを選択してください。希釈FA溶液は1ヶ月以下に保ちます。酸性化の間、固定溶液のpHは中性から約3に変化している。
注意:FAは急性臓器毒性、腐食性および発癌性であるため、ヒュームフードの使用は必須であり、適切な保護パーソナル機器を使用する必要があります。- 取り出したばかりの軟組織サンプルを50mL遠心管に加え、50mL遠心管を24~72h冷蔵します。
注: プロトコルはここで一時停止できます。 - 軟組織試料をDPBS溶液で1時間洗浄します。
- 取り出したばかりの軟組織サンプルを50mL遠心管に加え、50mL遠心管を24~72h冷蔵します。
- 固定された軟部組織サンプル(例えば、マウス腎臓全体)を染色するには、軟組織を2mLのエオシンY染色液に入れ、サンプルを24時間インキュベートし、インキュベーション中に滑らかな揺れ(ca. 60 rpm)のために水平揺れ板にサンプルを置く。プロセス。
注:エオシンY染色液は、蒸留水中の濃度が30%(w/v)です。サンプルが染色溶液によって完全に覆されるように染色溶液の体積を選択し、サンプル容器内でサンプルが自由に移動できるようにします。インキュベーション時間は他のサンプルによって異なる場合があり、それに応じて調整する必要があります。 - 染色後、サンプル容器から軟部組織試料を慎重に取り出します。
- セルロースティッシュペーパーで過剰な染色剤を慎重に取り除きます。
- 軟組織試料をエタノール蒸気相の上の円錐形サンプル容器に入れ、さらに使用します。
メモ:円錐形のサンプル容器は、軟部組織サンプルを湿らせ、アーティファクトを防ぐために、常にチューブの底部に70%(v/v)エタノールの数滴を含んでいる必要があります。
2. X線マイクロCTイメージング
注:X線マイクロCT測定は、概要CT測定(視野内のサンプル全体を画像化する機能(FOV))と高解像度CT測定の性能(集中力)を提供するマイクロCTスキャナを使用して行いました。非常に同じサンプルの目的の1つの所望の容積(VOI)で1μmまで下がった。
- 軟組織サンプルを適切なサンプルホルダーに取り付けます。サンプルホルダーのサンプルのしっかりとしたフィット感を確保し、X線CT測定中にサンプルが動かないようにします。
- 染色されたマウス腎臓の場合:2本の遠心管を持つサンプルホルダーを準備し、それによって1本のチューブの底部を切断します。2成分接着剤を使用して、2つの遠心チューブを接着します。回転軸を中心に遠心管の直線位置合わせを確認します。接着剤が固まるのを待ちます。
- サンプルホルダーを使用する準備ができたら、マウス腎臓を無傷の遠心管に移し、チューブの底部に70%(v/v)エタノールを数滴保持します。
注: サンプルの安定性は非常に重要です。X線CT測定用のサンプルの準備に時間をかけてください。軟部組織サンプルは、X線CT測定中にサンプルを湿っと保ち、軟組織サンプルが収縮やその他のアーティファクトを防ぐために、エタノール蒸気相上に保持されます。軟部組織サンプルは、X線CT測定中にサンプルの周囲の溶媒の蓄積を回避するために溶媒と接触してはならない。サンプルホルダーが底部に溶媒を保持できない場合、70%(v/v)エタノールで湿らせたセルロース紙をサンプルホルダーに入れることができます。なお、溶媒エタノールによる収縮アーティファクトは認められなかった。
注: プロトコルはここで一時停止できます。
- サンプルの慎重な位置合わせの後、最高の画質のための集録パラメータを選択します。提示されたmicroCTデータの場合、50kVのピーク電圧でスキャンを取得し、1601プロジェクションを使用して3.5Wの電流を360°以上均等に分布させます。
注:概要CTスキャンの集録パラメータは、最高の画質のために選択されました。このように、0.39xカメラの目的は、視野(FOV)内のサンプル全体をカバーするために選択されました。その結果、有効画素サイズは12μmとなった。投影あたり2秒の露光時間は、ノイズ比に良好な信号を提供しました。高解像度CTスキャンのROIは、概要スキャンのmicroCTデータを使用して特定されました。MicroCTスキャナには、多くの場合、統合されたソフトウェアツールが組み込まれており、決定されたROIを正確に選択できます。高解像度CTデータでは、4xカメラの目標を選択し、有効画素サイズは3.3μmになりました。ここでは、投影あたり15秒の露光時間が必要であった。
注: プロトコルはここで一時停止できます。 - X線CTデータを取得した後、3D体積の再構成に応じて突起を処理します。提示されたmicroCTデータの場合:統合ソフトウェアを使用してX線CTデータを再構築します。
注:図 1および図 2に示す microCT データのボリューム レンダリングは、視覚化ソフトウェアを使用して生成されました。
注: プロトコルはここで一時停止できます。
3. X線ナノCTイメージング
メモ:X線ナノCTスキャナは社内で開発されました。レンズフリーの器械はナノフォーカスX線源および単光子計数えが装備されている。100 nmまでの解像度を持つ3Dデータは10を生成することができます。一般に、X線光学を有するものを含むnanoCTシステムは市販されており、記載のnanoCTスキャナに限定されない。
- ナノCTサンプル調製
- 軟組織サンプルのVOIを準備します。メスとステレオ顕微鏡を使用して、柔らかいティッシュを約0.5mmのエッジ長の非常に小さな部分に切断します。マウス腎臓の場合:マウス腎臓を最も長い軸に沿って2つの半分にカットします。マウス腎臓の半分を取り、腎皮質や腎髄質などの異なる解剖学的領域を準備します。
注:マウス腎臓の他の半分は組織病理学に移され、そこでサンプルはパラフィンに埋め込まれ、図3cおよび図3 dに示すように典型的な組織学的セクションを得るためにそれに応じて処理された. - 最初の脱水ステップの前に小片を新しいペトリ皿に移し、その後のすべてのステップのために残ります。
- 濃度(すべてv/v)を%で使用してサンプルを脱水します:50、60、70、80、90、96、100エタノールと蒸留水のバランスをとります。各脱水ステップをそれぞれ1時間ずつ行う。
注: プロトコルはここで一時停止できます。小さな組織片を100%エタノールに一晩入れておく。 - 臨界点ドライ(CPD)小さな組織片。
注:CPDの適用は、乾燥剤(ここではCO2)と溶媒(ここではエタノール)を交換することにより、組織サンプルの完全な脱水を可能にします。これは、サンプルがナノCTのサンプルホルダーに取り付けることができ、測定中に動かず、X線源に非常に近い位置に配置して、最良の幾何学的倍率を可能にするために必要でした。nanoCT の設定は単なる幾何学的倍率に基づいており、倍率はソースからサンプルまでの距離に対するソースから検出器までの距離として定義されます。乾燥技術は、電子顕微鏡28のための生体標本の3D構造を保存するためにアンダーソンによって最初に導入された。テクニックの概要は、ブレイ29によって提供されています。- 真空チャンバーに100%エタノールをプリフィルします。小さなティッシュ片をマイクロ多孔質カプセルに移し、CPDの真空チャンバーに入れます。
メモ:CPDプロセスには高圧が関与するため、CPDのすべての部品、特に継手が無傷で、システムが正しく閉じていることを確認してください。 - チャンバーを6~8°Cに冷却し、液体CO2で満たします。
- 攪拌しながら、2つの成分の適切な混合を可能にするために3分間待ちます。慎重にチャンバーを排水します。サンプルホルダーがまだ溶剤で覆われていることを確認します。この手順を 10 回繰り返して、エタノールをサンプル内の CO2に完全に置き換えるようにします。
- CO2でチャンバーの最終充填後、機械をCO2(31°Cおよび73.8bar)の臨界点に加熱し、その後30分の時間をかけて気体CO2の非常に遅い放出を行います。
メモ:ガスの放出は、そうでなければ凝縮水がサンプル上に形成することができるので、非常にゆっくりと行われるべきです。温度がCO2の臨界点を下回らないようにしてください。すべての圧力がシステムから解放された場合にのみ、CPDマシンを開きます。 - CPDティッシュピースを機械から素早く取り出し、使い続ける前にデシケーターに保存された新しいペトリ皿に保管してください。
注: プロトコルはここで一時停止できます。
- 真空チャンバーに100%エタノールをプリフィルします。小さなティッシュ片をマイクロ多孔質カプセルに移し、CPDの真空チャンバーに入れます。
- 軟組織サンプルのVOIを準備します。メスとステレオ顕微鏡を使用して、柔らかいティッシュを約0.5mmのエッジ長の非常に小さな部分に切断します。マウス腎臓の場合:マウス腎臓を最も長い軸に沿って2つの半分にカットします。マウス腎臓の半分を取り、腎皮質や腎髄質などの異なる解剖学的領域を準備します。
- CPDティッシュピースを適切なサンプルホルダーに取り付けます。サンプルホルダーのサンプルのしっかりとしたフィット感を確保し、CT測定中にサンプルが動かないようにします。CPDマウス腎臓組織片の場合:サンプルホルダーにスーパーグルーで組織片を接着します。
メモ:CT測定中にサンプルが望ましくない動きをすると、特にナノメートルボクセルサイズのデータセットを取得する場合に、体積再構成中に問題が発生する可能性があります。
注: プロトコルはここで一時停止できます。 - サンプルの慎重な位置合わせの後、最高の画質のための集録パラメータを選択します。提示されたnanoCTデータの場合:1599の投影法が360°以上均等に分布し、ボクセルサイズが約400nmの60kVのピーク電圧でプロジェクションを取得します。
注:400 nmボクセルサイズで取得した単一のCT測定は、回転軸(垂直)の方向に75μm、回転軸(水平)に垂直な方向に約560μmのFOVを持ちます。より大きなボリュームを調査するには、異なる垂直位置で複数のスキャンを組み合わせることで、回転軸に沿ったFOVの拡張を実現できます。さらに、局所断層撮影スキャンを実行して、グローバルCTスキャンのFOVによって与えられるよりも回転軸に垂直なサンプル直径が大きいサンプルを測定することができます。ナノCTデータは、投影あたり4秒の露光時間で取得した。そのため、データセットあたりの総取得時間は約 3.5 h でした。
注: プロトコルはここで一時停止できます。 - CTデータを取得した後、3D体積の再構成に応じて投影を処理します。
- 提示されたnanoCTデータの場合は、フラットフィールド画像を使用して取得した投影を正規化します。リチャードソン・ルーシー・デコンボリューション・アルゴリズム30、31を使用して突起の鮮明さを高める。デコンボリューションカーネルとして1ピクセルの標準偏差を持つ回転対称ガウス関数を使用します。
- パガニンの位相検索アルゴリズムをシャープな画像に適用して、軟部組織のコントラストを高めます。アルゴリズムのパラメータを設定して画質32を最適化します。最先端のフィルターバックプロジェクション アルゴリズムを使用して、前処理済みの投影法を再構築します。
注:図3は、約7μmの厚さの対応する組織学的セクションを使用して得られたnanoCTデータを評価します。そこで、仮想厚が約7μmの隣接する18個の隣接するナノCTスライスの最小強度投影スライスは、関連するスライス内の各ピクセルの最小値を算出することによって生成された。図 4に示す nanoCT データのボリュームをレンダリングするために、視覚化ソフトウェアを使用しました。
Representative Results
図1は、染色後のコントラスト増強を強調する低分解能microCTデータのCTスライスとボリュームレンダリングを示しています。図2は、マウス腎臓全体の局所断層撮影に由来する高分解能microCTデータのCTスライスとボリュームレンダリングを示す。図3は、対応する組織学的セクションと比較してnanoCTデータのCTスライスを示す。図4は、細胞レベルで構造の詳細を強調するnanoCTデータのCTスライスとボリュームレンダリングを示しています。低分解能のmicroCT測定は器官全体の概要を可能にし、高解像度のマイクロCT測定のための目的の容積(VOI)を識別するのに役立つ。このマルチスケールアプローチを通じて、nanoCT の VOI が決定されます。nanoCTは細胞レベルの柔らかいティッシュのサンプルの非常に詳細なビューを可能にする。対応する組織学的セクションとの比較研究は、組織病理学との完全な互換性を強調する。ここで、マルチモーダルイメージングアプローチは、両方のモダリティで得られた結果を確認している。
図 1.低解像度 microCT データの CT スライスとボリューム レンダリング。(a,b)染色前後の同じマウス腎臓の概要画像は、それぞれ、エオシン系染色プロトコルの適用後に得られるコントラスト増強を強調する。両方のmicroCTデータ・セットは、同一の集録パラメータを使用して取得された。両方のデータ・セットのボクセル・サイズは 12 μm です。(b)で達成されるコントラスト強化により、皮質(I)、外側髄質(II)の外側のストライプと外側髄質(IIb)の内側のストライプのさらなる区別を有する、次の解剖学的構造領域の同定が可能になります。内髄質(III)、乳頭(IV)および腎骨盤(V)。(c)マウス腎臓全体を通して仮想矢状部を示すmicroCTデータの体積レンダリング。この図は、Busse と Müller らから変更されています。
図 2.開発されたeosinベースの染色プロトコルを適用した後、同じマウス腎臓から得られた高分解能microCTデータのCTスライスおよびボリュームレンダリング。(a) 左隅には、表示された高解像度画像の ROI (青いボックス) を強調表示する概要 microCT 画像が表示されます。次の解剖学的構造領域は識別可能である:皮質(I)、外側髄質(II)の外側のストライプ(IIa)および外側髄質(IIb)、内側髄質(III)、マイナーカリックス(IV)および血管(VおよびVI)の外側のストライプでさらに区別される。(b) ボクセルサイズ3.3μmで取得した高分解能microCTデータの対象レンダリング量。髄質領域および腎臓全体の局所断層撮影に由来する血管を介した仮想部分が示されている。この図は、ブッセとミュラーら26から変更されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.ナノCTデータのCTスライス(a,b)は、開発されたエオシン系染色プロトコルの適用後に同じマウス腎臓に由来する組織学的切片(c,d)と比較した。(a)染色、解剖およびCPD後の同じマウス腎臓試料のナノCT画像は、図1および図2に見られる領域(IIb)の詳細な構造を示す。これらは、ヘンレのループの太い上昇手足として知られています。( b )(a)に示す同じnanoCTデータセットに由来する最小強度投影スライスは、約7μmの仮想スライス厚さで、細胞核の明確な可視化を可能にする。(c)細胞核およびブラシ境界の明確な可視化を有するヘンレのループの厚い上昇肢を示す代表的な組織学的セクション。組織学的セクションは、およそ7μmの厚さを有し、適用されたエオシンベースの染色およびパラフィンブロックへの埋め込み後に同じマウス腎臓サンプルから得られた。(d)紫色で細胞核を強調するカウンター染色ヘマトキシリンの適用を有する代表的な組織学的セクション。(c)に示すセクションに近い組織学的断面の調製は、およそ7μmである。この図は、Busse と Müller らから変更されています。
図 4.nanoCT データの CT スライスとボリューム レンダリング。(a)ヘンレのループの厚い上昇肢として知られている構造を示す同じマウス腎臓試料のnanoCT画像。これは、約400nmのボクセルサイズを有する腎臓の小片から取得した図1および図2に見られる領域(IIb)の詳細な図である。試料の調製には、染色、解剖およびCPDを含む(b)ヘンレのループの厚い上昇肢の3D構造を可視化するnanoCTデータの体積レンダリング。この図は、Busse と Müller らから変更されています。
Discussion
現在、eosinは細胞細胞質に標識する標準的な組織学的プロトコルとして使用されている。染色剤は、軟部組織の顕微鏡スライス(一般に2〜10μmの厚さで切断される)33に0.1%(w/v)水溶液として塗布される。この標準化された組織学的プロトコルをマウス腎臓全体などの3D組織サンプルに適用しても、減衰コントラスト強化CT画像は得られる。一方で、これは、実験室ベースのmicroCTシステムの典型的に使用されるX線エネルギーのための軟部組織の低い固有減衰特性に起因することができる。通常、軟部組織は、主に炭素、水素、酸素及び窒素34から構成され、したがって、コントラスト増強をもたらさない。一方、染色に用いたエオシンの濃度が低かったのが制限因子であった。1つのエオシン分子が4つの臭化物原子(Z=3534の高原子数元素子臭素)を保持しているにもかかわらず、X線CTイメージングに必要な感度レベルは満たされなかった。
低減衰コントラストのこの課題を克服するために、いくつかの濃度のエオシンを調べた。ここで制限は、水溶液中の30%(w/v)である水中のエオシンの最大溶解度です。軟部組織内での最高の減衰コントラスト増強は、ランバートビール法に従って予想された最も高いエオシン濃度で観察された。そこで、最終的な染色プロトコルを最も高濃度で行った。
さらにコントラスト増強を改善する染色手順のための分子レベルで軟部組織を最適に調製する方法の質問は、pH調整によって回答された。ここで、固定中または染色前の軟組織試料の酸性化が重要であることが判明した。これもホンら35によって示された。酸による細胞細胞質内の染色剤の蓄積は、細胞細胞質内に存在するタンパク質およびペプチドのアミノ酸側鎖のプロトネーションの結果であるイオン相互作用の改善によって達成された。未染色軟組織試料と比較してコントラスト増強を強調する代表的な結果を図1a,bに示す。 ここでは、皮質、髄質、乳頭、腎骨盤などの重要な解剖学的領域を可視化するマウス腎臓全体の構造概要を達成した。
提示された染色プロトコルは適用が簡単で、3つのステップしか含みです。必要な試薬は容易にアクセスできる。24時間の全体的な染色時間は全臓器染色に対して高速であり、軟組織サンプルの3D可視化を可能にする(図1c、図2b及び図4b)で実験室環境で複数のスケールをセルラーレベルまで下げます。必要な染色溶液の全体的な染色時間および体積は、サンプルの性質に応じていくつかの適応を要求する可能性があることに留意すべきである。それにもかかわらず、eosinベースの染色プロトコルは、全臓器染色に適しており、臓器全体の高分解能マイクロCTイメージングを可能にします。マイクロCT測定中に試料を湿らせておくために用いた溶媒エタノールによる収縮アーティファクトは認められなかった。ナノCTイメージングには追加の調製ステップが必要であり、元のサンプルから取り出された小さな組織片の調査が可能です。将来の組織病理学的アプリケーションに関して、概要スキャンは、図2aに示すようにROIの決定を可能にする、変更された解剖学的領域および構造に関する貴重な洞察を提供する。これらは、microCT(図1cおよび図2b)またはnanoCT(図4b)によって3Dで研究し、2Dでヒストロジーで評価することができる(図3)。
プロトコルの別の強さは、H&E染色手順に関する組織病理学との完全な互換性に見られる。エオシンベースの染色手順をバルクサンプルに適用しても、適用されたエオシン濃度は組織学的染色溶液に比べてはるかに高いにもかかわらず、さらなる組織学的調査を妨げません(図3)。仮想厚が約400nm(図3a)のnanoCTスライスは、対応する軟組織試料から導出された組織学的断面(図3c)とすでに非常によく比較する。7-10 μmの組織学的断面のおおよその厚さを考慮すると、約7μmの仮想厚さに対応するナノCTデータの最小強度投影スライス(図3b)の生成により、組織学的セクションとのより良い比較 (図 3c)ここで、細胞核は、細胞細胞質33中のタンパク質およびペプチドを特異的に染色するエオシンとして非減衰領域として明らかにされる。
標準組織学的染色手順と比較して染色の順序が逆転したにもかかわらず、標準的な組織学的方法を用いたさらなるカウンター染色の適用は可能である。CT用に開発されたエオシンベースの染色プロトコルから始まり、続いてヘマトキシリンを用いたエオシンベースの組織学的セクションのカウンター染色により、完全な互換性を可能にし、期待される形を表示する高品質の染色結果外観の。マイヤーの酸っぱいヘマトキシリンを用いた細胞核特異的染色を、細胞核を紫色で強調する組織学的セクションに適用した(図3d)。組織学的カウンター染色の適用は、現在H染色に限定されている。周期酸シフの塩基、エラスティカ・ファン・ギーソンまたはゴモリ銀のような他の標準的な組織学的カウンター染色は、免疫組織学的手法との適合性と同様に評価されなければならない。
eosinベースの染色プロトコルは、(i)細胞細胞質特異的ターゲティング、(ii)均質かつ完全な染色、(iii)容易な実装、(iv)拡散リングなどのアーティファクトを作成することなく組織の迅速な浸透、(v)染色を可能にする大きく、密な軟部組織サンプル、および(vi)H&E染色に関する組織病理学との完全な互換性。これらの要件は、軟組織の高分解能X線CT可視化を細胞レベルまで可能にするために重要である。最近開発されたnanoCTデバイス12、36、37と組み合わせて、従来の組織学的データとの対比と解像度に匹敵する仮想組織学的スライスの非破壊生成可能なレンダリングが可能です。この組み合わせアプローチにより、顕微鏡組織構造の3D可視化のための貴重なツールとしてX線CTを確立することが可能になります。
Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
私たちは、スウェーデンのExcillum ABで組織学的な議論と非常に役に立つチームのためにケン・ドレコル博士に感謝します。我々は、DFGエクセレンス・クラスター・オブ・エクセレンス・ミュンヘン先端フォトニクスセンター(MAP)とDFGゴットフリート・ヴィルヘルム・ライプニッツ・プログラムを通じて財政支援を認めます。さらに、この研究プロジェクトは、マリー・スクウォドフスカ・キュリー補助金協定第1番号に基づき、欧州連合ホライズン2020研究革新プログラムから資金提供を受けています。H2020-MSCA-IF-2015-703745-コンソルト。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50-ml centrifuge tube by Falcon | VWR | 734-0453 | |
| Formaldehyde solution, 37% | Carl Roth | CP10.2 | acid-free, stabilized with ~10% MeOH |
| Glacial acetic acid | Alfa Aesar | 36289.AP | |
| Eosin Y disodium salt | Sigma-Aldrich | E4382 | certified by Biological Stain Commission |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | L1825 | Dulbecco's formualtion, w/o calcium and magnesium |
| Sample Tubes by Nalgene | Carl Roth | ATK5.1 | |
| Rocking Shaker ST5 | CAT | 60281-0000 | |
| Cellulose tissue paper | VWR | 115-0600 | |
| Forceps, by USBECK Laborgeräte | VWR | 232-0096 | |
| Microcentrifuge tubes by Eppendorf | VWR | 211-2120 | safe-lock, 2.0 ml |
| Ethanol absolute by Baker Analyzed | VWR | 80252500 | |
| Disposable safety scalpel by Aesculap | VWR | AESCBA210 | |
| Petri dish by Sterilin | VWR | 391-2019 | |
| Plastic pasteur pipette | Carl Roth | EA68.1 | graduated, 1 ml |
| Desiccator by Duran | VWR | SCOT247826954 | |
| Silicone grease by Bayer | Sigma-Aldrich | 85404 | high-vacuum |
| Carbon dioxide cylinder with standpipe | Linde | 3700113 | 10 kg, short |
| micro-porous treatment capsule | PLANO GmbH | 4614 | pore size 78 µm (B) |
| Bal-Tec CPD 030 | Bal-Tec AG | CO2 as drying agent | |
| Stemi 2000-C stereomicroscope with KL 1500 LCD | Zeiss | this stereomicroscope has been updated(1) | |
| Zeiss Xradia Versa 500 | Zeiss | this microCT scanner has been updated(2) | |
| Avizo Fire 8.1 | Thermo Fisher Scientific | ||
| PILATUS detector as part of the nanoCT scanner | Dectris | single-photon counting detector(4,5); there are commercially availble nanoCT systems available (6,7) | |
| nanofocus X-ray source as part of the nanoCT scanner | Excillum | high-flux nanofocus X-ray transmission tube(3); there are commercially availble nanoCT systems available(6,7) | |
| (1) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS stereomicroscopes https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/Stereomikroskope/1006> (September 06, 2019). | |||
| (2) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS Xradia 510 Versa https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/zeiss-xradia-510-versa.html> (April 10, 2019). | |||
| (3) Nachtrab, F. et al. Development of a Timepix based detector for the NanoXCT project. Journal of Instrumentation 10 (11), C11009, (2015). | |||
| (4) Kraft, P. et al. Performance of single-photon-counting PILATUS detector modules. Journal of Synchrotron Radiation 16 (3), 368-375, (2009). | |||
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