X선 컴퓨터 단층 촬영을 위해 설계된 X선 특이적 염색 방법을 사용하여 현미경 조직 구조의 3D 시각화프로토콜이 제시된다.
우리는 세포 세포질을 표적으로 하는 특정 엑스레이 얼룩과 엑스레이 microCT 및 nanoCT를 결합하는 실험실 기지를 둔 방법을 보여줍니다. 기재된 프로토콜은 적용이 용이하고 빠르며 더 큰 연조직 샘플에 적합합니다. 제시된 방법론은 중요한 조직 구조물의 특성화를 3차원으로 가능하게 하고 전체 마우스 신장에 입증됩니다. 다중 규모 접근법은 전체 마우스 신장을 이미지화할 수 있게 해주며, 나노미터 범위에 이르는 더 높은 해상도로 획득되는 추가 적인 관심의 선택을 지원합니다. 이에 따라, 상응하는 조직학적 광 현미경 이미지와 유사한 세부 수준을 가진 연조직 형태가 재생된다. 조직 구조의 3D 구성에 대한 심층적인 통찰력은 조직학적 방법을 통한 추가 조사를 방해하지 않고 달성됩니다.
연조직 표본의 전체 특성화에는 3D 조직 미세 구조에 대한 정보가 필요합니다. 연조직 시료 분석을 위한 현재 금 본위제는 조직병리학입니다. 견본의 조직 그리고 세포 형태는 광학 현미경 검사법1를사용하여 관심 있는 지역 (ROI) 내의 2D에서 탐구됩니다. 그러나 이 방법에는 몇 가지 단점이 있습니다. 샘플의 준비는 시간이 많이 걸리고 복잡하며 파괴적이며 아티팩트에 취약합니다. 생성된 현미경 슬라이드는 단면평면과 평행한 2D 정보만 제공합니다. 종종 조사되는 조직학적 섹션의 수는 시간 제약으로인해2,3.
최근 몇 년 동안, 3D 역학의 분야는 진화하고있다. 여기서, 원하는 공간 평면에서 가상 조직 조각에 액세스 할 수 있습니다. 이것은 다른 병리와 관련되었던 3D 조직 건축 및 구조 변경의 더 깊은 이해로 이끌어 내는 견본을 통하여 구조물의 추적을 허용합니다. 3D 볼륨 데이터의 생성을 달성하기 위해 다양한 방법이 개발되었습니다. 그들은 빛 또는 전자 현미경검사법4,5,6,7,8을사용하는 직렬 섹션 기반 접근법에서 후피 3D 이미징과 같은 블록 얼굴 이미징 방법에 이르기까지 다양합니다. 또는 블록 얼굴 주사 전자현미경7,8,9. 그러나 언급된 모든 방법은 샘플을 완전히 절편하거나 파괴하여 추가 조사를 허용하지 않습니다. 얻어진 분해능은 종래의 역학에서 설명한 바와 같이 아티팩트에 수그린 단면화 공정에 크게 의존한다. 이러한 메서드는 정렬 아티팩트에서도 어려움을 겪습니다.
현미경 및 나노 스코픽 컴퓨터 단층 촬영 (microCT 및 nanoCT)과 같은 3D X 선 이미징 기술은 조직 샘플의 파괴없이 3D 고해상도 데이터를 생성하는 것을 열망합니다. 지금까지 연조직의 약한 X선 감쇠 대비와 실험실 환경에서 고해상도에 대한 제한된 접근은 현미경 조직 구조의 3D 시각화에 대한 사용을 손상시켰습니다. 실험실 기반, 고해상도 X 선 CT를 향한 최근의 발전은 1 μm10,11,12,13보다 훨씬 낮은 해상도를 허용합니다.
기존의 감쇠 기반 X 선 이미징에서 연조직에 있는 콘트라스트의 부족은 X선 감쇠 대조를 향상시키는 염색제에 의해 보상됩니다. 오스뮴 테트옥사이드 (OsO4),요오드 칼륨 요오드화물 (IKI) 또는 인산화산 (PTA)과 같은 다른 이미징 기술로부터 알려진 염색제는 종종14,15,16,17, 18,19,20,21,22,23,24,25. (i) 특정 생물학적 표적화, (ii) 균일하고 완전한 염색, (iii) 쉬운 취급, (iv) 확산 고리와 같은 아티팩트를 생성하지 않고 조직의 빠른 침투, (v) 크고 조밀한 조직 염색, 및 (vi) 조직 병리학과의 완전한 호환성은 현미경 조직 구조의 3D 시각화를위한 도구로 X 선 CT를 확립하는 데 필요합니다. 이 작품에서는, 우리는 연조직 견본이26위에 명시된 요구사항을 충족시키는 에오신에 근거를 둔 세포질 특정 엑스레이 얼룩을 가진 엑스레이 CT 화상 진찰을 위해 어떻게 준비되는지 보여줍니다.
다중 스케일 이미징 접근 방식은 개요 microCT 측정및 추가 고해상도 조사를 위한 관심도(VOI)의 선택을 통해 염색 품질 평가를 보장합니다. 염색 품질은 (i) 완전성, (ii) 확산 링의 외관, (iii) 대비 향상, (iv) 줄무늬 및 (v) 균질성과 같은 CT 아티팩트의 모양과 같은 염색 매개변수에 초점을 맞추어 분석됩니다. 기하학적 배율을 사용하여 100 nm까지의 해상도에 도달하는 실험실 기반 nanoCT 설정은 (하위) 세포 수준10,27에서연조직 형태를 시각화합니다. 상응하는 조직학적 광 현미경 이미지와 나노CT 조각의 비교 분석은 조직의 조직 병리학 적 특성을 가능하게, 2D의 현미경 수준에 유사한 세부 사항과 조직 아키텍처의 재생을 확인 샘플. 이 상세한 비디오 프로토콜은 인식을 높이고 동물학자, 생물학자 및 건강과 같은 광범위한 과학 커뮤니티에 관심이있는 비파괴 3D 연조직 이미징 도구로이 방법론의 잠재력을 강조하기위한 것입니다. 전문가.
현재, 에오신은 세포질에 라벨을 붙이는 표준 조직학적 프로토콜로서 사용된다. 염색제는 연조직의 미세한 조각(일반적으로 2-10 μm의 두께로 절단)에 0.1% (w/v) 수성 용액으로 적용된다33. 이러한 표준화된 조직학적 프로토콜을 전체 마우스 신장과 같은 3D 조직 샘플에 적용해도 CT 이미지가 감쇠 대비를 강화하지 는 않는다. 한편으로는, 이것은 실험실 기지를 둔 microCT 시스템의 전형적으로 이용되는 엑스레이 에너지를 위한 연약한 조직의 낮은 본질적인 감쇠 특성에 기인할 수 있습니다. 일반적으로 연조직은 주로 탄소, 수소, 산소 및 질소34로구성되므로 대비 향상을 초래하지 않습니다. 한편, 염색에 사용되는 에오신의 농도가 낮을수록 제한 요인이 되었다. 1개의 에오신 분자가 4개의 브로마이드 원자 (Z= 3534를가진 높은 원자 수 요소 브롬)를 보유하더라도, X 선 CT 화상 진찰을 위해 요구된 감도 수준은 충족되지 않았습니다.
낮은 감쇠 대비의 이 도전을 극복하기 위하여, 에오신의 몇몇 사격량은 조사되었습니다. 제한은 여기에 수성 용액에서 30 %(w / v)인 물에서 에오신의 최대 용해도입니다. 연조직 내의 최고의 감쇠 대비 향상은 램버트 맥주 법에 따라 예상된 가장 높은 에오신 농도로 관찰되었다. 따라서, 최종 염색 프로토콜은 가장 높은 농도로 수행되었다.
연조직을 분자 수준에서 최적으로 준비하는 방법에 대한 질문은 대비 향상을 더욱 개선하기 위해 염색 시술에 대한 pH 조정에 의해 응답되었다. 여기서, 고정 시 또는 염색 전에 연조직 샘플의 산성화가 결정적인 것으로 나타났다. 이것은 또한 홍 외 에 의해 표시 되었다35. 산에 의해 세포 세포질 내의 염색제의 더 높은 축적은 세포 세포질 내에 존재하는 단백질 및 펩티드의 아미노산 측사슬의 protonation의 결과인 향상된 이온 상호 작용을 통해 달성되었다. 얼룩지지 않은 연조직 시료와 비교하여 대비 향상을 강조하는 대표적인 결과는 도 1a,b에나타내었다. 여기에서, 피질, 수질, 유두 및 신장 골반과 같은 중요한 해부학 적 영역을 시각화하는 전체 마우스 신장의 구조적 개요가 달성되었다.
제시된 염색 프로토콜은 적용이 간단하며 세 단계만 포함합니다. 필요한 시약에 쉽게 접근할 수 있습니다. 24 시간의 전반적인 염색 시간은 실험실 환경에서 연조직 샘플의 3D 시각화(그림 1c, 그림 2b 및 그림 4b)를가능하게하는 전체 장기 염색에 빠릅니다. 세포 수준으로 여러 스케일다운. 필요한 염색 용액의 전체 염색 시간과 부피는 샘플의 특성에 따라 일부 적응을 요청할 수 있음을 유의해야 한다. 그럼에도 불구하고, 에오신 계 염색 프로토콜은 전체 장기 염색에 적합하며, 이는 전체 장기의 고해상도 microCT 이미징을 가능하게 합니다. 마이크로CT 측정 동안 시료를 촉촉하게 유지하는 데 사용되었던 용매 에탄올로 인한 수축 아티팩트는 관찰되지 않았다. 나노CT 이미징을 위해 추가적인 준비 단계가 필요하며, 이를 통해 원래 샘플에서 회수된 더 작은 조직 조각을 조사할 수 있습니다. 향후 조직병리학 적 응용 과 관련하여 개요 검사는 변경 된 해부학 적 영역 및 구조에 대한 귀중한 통찰력을 제공하므로 그림2a에서설명 한 바와 같이 ROI를 결정할 수 있습니다. 이들은 microCT(도 1c 및 도 2b)또는 nanoCT(도 4b)에의해 3D로 연구될 수 있고 조직학으로 2D로 평가될 수 있다(그림3).
프로토콜의 또 다른 강점은 H & E 염색 절차와 관련하여 조직 병리학과의 완전한 호환성에서 볼 수 있습니다. 에오신 계 염색 시술을 대량 시료에 적용하는 것은 조직학적 염색 용액에 비해 적용된 에오신 농도가 훨씬 높음에도 불구하고 추가적인 조직학적 조사를 방해하지않는다(그림 3). 약 400 nm(도3a)의가상 두께를 가진 나노CT 슬라이스는 상응하는 연조직 샘플로부터 유래된 조직학적 단면도(도3c)와이미 매우 잘 비교된다. 조직학적 단면의 대략적인 두께를 7-10 μm로 고려하여, 약 7 μm의 가상 두께에 해당하는 나노CT 데이터의 최소 강도 투영슬라이스의생성을 조직학 섹션과 더 나은 비교(그림 3c). 여기서, 세포 핵은 세포세포질33에서단백질 및 펩티드를 특이적으로 염색하는 에오신으로서 비감쇠 영역으로서 명백하게 밝혀져 있다.
표준 조직학적 염색 절차에 비해 염색의 순서가 역전되었음에도 불구하고 표준 조직학적 방법으로 추가적인 역염색의 적용이 가능하다. 먼저 CT에 대한 개발 된 에오신 기반 염색 프로토콜로 시작하여 헤마톡시린으로 그 에오신 기반 조직 학적 섹션의 카운터 염색을 통해 완전한 호환성을 허용하고 예상 된 형태를 표시하는 고품질의 염색결과를 제공합니다. 외형의. 메이어의 신헤마톡실린을 함유한 세포 핵 특이적 염색을 보라색으로 세포 핵을 강조하는 조직학적 섹션에 적용하였다(도3d). 조직학적 카운터 얼룩의 적용은 현재 H-얼룩으로 제한된다. 주기산 Schiff의 기지, Elastica 반 기손 또는 고모리 실버와 같은 그밖 표준 조직학 카운터 얼룩은 면역 조직학 기술과의 호환성을 평가될 필요가 있습니다.
에오신 계 염색 프로토콜은 (i) 세포질 특이적 표적화, (ii) 균질하고 완전한 염색, (iii) 용이한 구현, (iv) 확산 고리와 같은 아티팩트를 생성하지 않고 조직의 빠른 침투, (v) 염색을 허용한다. 크고 조밀한 연조직 샘플, 및 (vi) H&E 얼룩과 관련하여 조직 병리학과의 완전한 호환성. 이 요구 사항은 세포 수준까지 연조직의 고해상도 엑스레이 CT 가시화를 허용하는 것이 중요합니다. 최근 개발된 나노CT 장치12,36,37,비파괴 생성과 결합하여 기존의 조직학적 데이터와 대조적으로 비교할 수 있는 가상 조직학적 슬라이스 렌더링할 수 있습니다. 이 결합된 접근법은 현미경 조직 구조의 3D 시각화를 위한 귀중한 공구로 엑스레이 CT의 설치를 가능하게 할 것입니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 조직학적 토론과 스웨덴 Excillum AB의 매우 도움이 되는 팀에 대해 Enken Drecoll 박사에게 감사드립니다. 우리는 고급 포토닉스 (MAP)에 대한 우수 뮌헨 센터의 DFG 클러스터와 DFG 고트 프리트 빌헬름 라이프 니츠 프로그램을 통해 재정 지원을 인정합니다. 또한, 이 연구 프로젝트는 마리 Skłodowska-퀴리 그랜트 협정 번호에 따라 유럽의 연합 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램에서 자금을 받고있다. H2020-MSCA-IF-2015-703745-CONSALT.
50-ml centrifuge tube by Falcon | VWR | 734-0453 | |
Formaldehyde solution, 37% | Carl Roth | CP10.2 | acid-free, stabilized with ~10% MeOH |
Glacial acetic acid | Alfa Aesar | 36289.AP | |
Eosin Y disodium salt | Sigma-Aldrich | E4382 | certified by Biological Stain Commission |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | L1825 | Dulbecco's formualtion, w/o calcium and magnesium |
Sample Tubes by Nalgene | Carl Roth | ATK5.1 | |
Rocking Shaker ST5 | CAT | 60281-0000 | |
Cellulose tissue paper | VWR | 115-0600 | |
Forceps, by USBECK Laborgeräte | VWR | 232-0096 | |
Microcentrifuge tubes by Eppendorf | VWR | 211-2120 | safe-lock, 2.0 ml |
Ethanol absolute by Baker Analyzed | VWR | 80252500 | |
Disposable safety scalpel by Aesculap | VWR | AESCBA210 | |
Petri dish by Sterilin | VWR | 391-2019 | |
Plastic pasteur pipette | Carl Roth | EA68.1 | graduated, 1 ml |
Desiccator by Duran | VWR | SCOT247826954 | |
Silicone grease by Bayer | Sigma-Aldrich | 85404 | high-vacuum |
Carbon dioxide cylinder with standpipe | Linde | 3700113 | 10 kg, short |
micro-porous treatment capsule | PLANO GmbH | 4614 | pore size 78 µm (B) |
Bal-Tec CPD 030 | Bal-Tec AG | CO2 as drying agent | |
Stemi 2000-C stereomicroscope with KL 1500 LCD | Zeiss | this stereomicroscope has been updated(1) | |
Zeiss Xradia Versa 500 | Zeiss | this microCT scanner has been updated(2) | |
Avizo Fire 8.1 | Thermo Fisher Scientific | ||
PILATUS detector as part of the nanoCT scanner | Dectris | single-photon counting detector(4,5); there are commercially availble nanoCT systems available (6,7) | |
nanofocus X-ray source as part of the nanoCT scanner | Excillum | high-flux nanofocus X-ray transmission tube(3); there are commercially availble nanoCT systems available(6,7) | |
(1) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS stereomicroscopes https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/Stereomikroskope/1006> (September 06, 2019). | |||
(2) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS Xradia 510 Versa https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/zeiss-xradia-510-versa.html> (April 10, 2019). | |||
(3) Nachtrab, F. et al. Development of a Timepix based detector for the NanoXCT project. Journal of Instrumentation 10 (11), C11009, (2015). | |||
(4) Kraft, P. et al. Performance of single-photon-counting PILATUS detector modules. Journal of Synchrotron Radiation 16 (3), 368-375, (2009). | |||
(5) Kraft, P. et al. Characterization and calibration of PILATUS detectors. IEEE Transactions on Nuclear Science 56 (3), 758-764, (2009). | |||
(6) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS Xradia 810 Ultra https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/xradia-810-ultra.html> (April 9 2019). | |||
(7) Company, G. E. GE product information: Phoenix nanotom m, https://www.gemeasurement.com/sites/gemc.dev/files/geit-31344en_nanotom_m_0517.pdf> (April 10, 2019). |