Summary
X선 컴퓨터 단층 촬영을 위해 설계된 X선 특이적 염색 방법을 사용하여 현미경 조직 구조의 3D 시각화프로토콜이 제시된다.
Abstract
우리는 세포 세포질을 표적으로 하는 특정 엑스레이 얼룩과 엑스레이 microCT 및 nanoCT를 결합하는 실험실 기지를 둔 방법을 보여줍니다. 기재된 프로토콜은 적용이 용이하고 빠르며 더 큰 연조직 샘플에 적합합니다. 제시된 방법론은 중요한 조직 구조물의 특성화를 3차원으로 가능하게 하고 전체 마우스 신장에 입증됩니다. 다중 규모 접근법은 전체 마우스 신장을 이미지화할 수 있게 해주며, 나노미터 범위에 이르는 더 높은 해상도로 획득되는 추가 적인 관심의 선택을 지원합니다. 이에 따라, 상응하는 조직학적 광 현미경 이미지와 유사한 세부 수준을 가진 연조직 형태가 재생된다. 조직 구조의 3D 구성에 대한 심층적인 통찰력은 조직학적 방법을 통한 추가 조사를 방해하지 않고 달성됩니다.
Introduction
연조직 표본의 전체 특성화에는 3D 조직 미세 구조에 대한 정보가 필요합니다. 연조직 시료 분석을 위한 현재 금 본위제는 조직병리학입니다. 견본의 조직 그리고 세포 형태는 광학 현미경 검사법1를사용하여 관심 있는 지역 (ROI) 내의 2D에서 탐구됩니다. 그러나 이 방법에는 몇 가지 단점이 있습니다. 샘플의 준비는 시간이 많이 걸리고 복잡하며 파괴적이며 아티팩트에 취약합니다. 생성된 현미경 슬라이드는 단면평면과 평행한 2D 정보만 제공합니다. 종종 조사되는 조직학적 섹션의 수는 시간 제약으로인해2,3.
최근 몇 년 동안, 3D 역학의 분야는 진화하고있다. 여기서, 원하는 공간 평면에서 가상 조직 조각에 액세스 할 수 있습니다. 이것은 다른 병리와 관련되었던 3D 조직 건축 및 구조 변경의 더 깊은 이해로 이끌어 내는 견본을 통하여 구조물의 추적을 허용합니다. 3D 볼륨 데이터의 생성을 달성하기 위해 다양한 방법이 개발되었습니다. 그들은 빛 또는 전자 현미경검사법4,5,6,7,8을사용하는 직렬 섹션 기반 접근법에서 후피 3D 이미징과 같은 블록 얼굴 이미징 방법에 이르기까지 다양합니다. 또는 블록 얼굴 주사 전자현미경7,8,9. 그러나 언급된 모든 방법은 샘플을 완전히 절편하거나 파괴하여 추가 조사를 허용하지 않습니다. 얻어진 분해능은 종래의 역학에서 설명한 바와 같이 아티팩트에 수그린 단면화 공정에 크게 의존한다. 이러한 메서드는 정렬 아티팩트에서도 어려움을 겪습니다.
현미경 및 나노 스코픽 컴퓨터 단층 촬영 (microCT 및 nanoCT)과 같은 3D X 선 이미징 기술은 조직 샘플의 파괴없이 3D 고해상도 데이터를 생성하는 것을 열망합니다. 지금까지 연조직의 약한 X선 감쇠 대비와 실험실 환경에서 고해상도에 대한 제한된 접근은 현미경 조직 구조의 3D 시각화에 대한 사용을 손상시켰습니다. 실험실 기반, 고해상도 X 선 CT를 향한 최근의 발전은 1 μm10,11,12,13보다 훨씬 낮은 해상도를 허용합니다.
기존의 감쇠 기반 X 선 이미징에서 연조직에 있는 콘트라스트의 부족은 X선 감쇠 대조를 향상시키는 염색제에 의해 보상됩니다. 오스뮴 테트옥사이드 (OsO4),요오드 칼륨 요오드화물 (IKI) 또는 인산화산 (PTA)과 같은 다른 이미징 기술로부터 알려진 염색제는 종종14,15,16,17, 18,19,20,21,22,23,24,25. (i) 특정 생물학적 표적화, (ii) 균일하고 완전한 염색, (iii) 쉬운 취급, (iv) 확산 고리와 같은 아티팩트를 생성하지 않고 조직의 빠른 침투, (v) 크고 조밀한 조직 염색, 및 (vi) 조직 병리학과의 완전한 호환성은 현미경 조직 구조의 3D 시각화를위한 도구로 X 선 CT를 확립하는 데 필요합니다. 이 작품에서는, 우리는 연조직 견본이26위에 명시된 요구사항을 충족시키는 에오신에 근거를 둔 세포질 특정 엑스레이 얼룩을 가진 엑스레이 CT 화상 진찰을 위해 어떻게 준비되는지 보여줍니다.
다중 스케일 이미징 접근 방식은 개요 microCT 측정및 추가 고해상도 조사를 위한 관심도(VOI)의 선택을 통해 염색 품질 평가를 보장합니다. 염색 품질은 (i) 완전성, (ii) 확산 링의 외관, (iii) 대비 향상, (iv) 줄무늬 및 (v) 균질성과 같은 CT 아티팩트의 모양과 같은 염색 매개변수에 초점을 맞추어 분석됩니다. 기하학적 배율을 사용하여 100 nm까지의 해상도에 도달하는 실험실 기반 nanoCT 설정은 (하위) 세포 수준10,27에서연조직 형태를 시각화합니다. 상응하는 조직학적 광 현미경 이미지와 나노CT 조각의 비교 분석은 조직의 조직 병리학 적 특성을 가능하게, 2D의 현미경 수준에 유사한 세부 사항과 조직 아키텍처의 재생을 확인 샘플. 이 상세한 비디오 프로토콜은 인식을 높이고 동물학자, 생물학자 및 건강과 같은 광범위한 과학 커뮤니티에 관심이있는 비파괴 3D 연조직 이미징 도구로이 방법론의 잠재력을 강조하기위한 것입니다. 전문가.
Protocol
주의: 사용하기 전에 모든 관련 재료 안전 데이터 시트(MSDS)를 참조하십시오. 프로토콜에 사용되는 화학 물질의 일부는 급성 독성 및 발암성이다. 엔지니어링 컨트롤(연기 후드, 글로브박스) 및 개인 보호 장비(안전 안경, 장갑, 실험실 코트, 전신 바지, 발가락 신발)의 사용을 포함하여 염색 프로토콜을 수행할 때는 모든 적절한 안전 관행을 사용하십시오.
사용된 동물:
동물 주택은 유럽 연합 (EU) 지침에 따라 뮌헨 의 기술 대학 Klinikum rechts der Isar에서 수행되었다 2010/63. 장기 제거는 독일 뮌헨의 클리니쿰 레흐츠 데르 이사르(4-005-09)의 내부 동물 보호 위원회로부터 승인되었다. 모든 절차는 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다. 모든 실험실은 좋은 실험실 사례의 OECD 원칙에 따라 검사됩니다.
1. 이오신 염색 프로토콜
- 연조직 시료를 고정하려면 50mL 원심분리기 튜브에 9.5 mL의 포름알데히드 용액(FA) 및 0.5 mL의 빙하 아세트산(AA)을 함유하는 고정 용액으로 채웁니다.
참고: 약 10% 메탄올로 안정화된 37% 산성 FA 용액에서 FA 용액을 신선하게 준비합니다. 덜베코의 인산완충식염수린(DPBS)으로 FA 용액을 더 희석합니다. 칼슘과 마그네슘이 없는 DPBS를 선택하십시오. 희석 된 FA 용액을 1 개월 이상 보관하십시오. 산성화 동안 고정 용액의 pH는 중성에서 약 3으로 변화한다.
주의: FA는 급성 장기 독성, 부식성 및 발암성이므로 연기 후드의 사용은 필수이며 적절한 보호 개인 장비를 사용해야 합니다.- 갓 제거된 연조직 샘플을 50mL 원심분리기 튜브에 넣고 50mL 원심분리튜브를 24-72시간 동안 냉장 보관합니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. - 연조직 샘플을 DPBS 용액으로 1시간 동안 세척합니다.
- 갓 제거된 연조직 샘플을 50mL 원심분리기 튜브에 넣고 50mL 원심분리튜브를 24-72시간 동안 냉장 보관합니다.
- 고정된 연조직 샘플(예: 전체 마우스 신장)을 염색하려면 연조직을 2 mL의 에오신 Y 염색 용액에 놓고 24 시간 동안 샘플을 배양하십시오. 프로세스.
참고: 에오신 Y 염색 용액은 증류수에서 30%(v)의 농도를 가합니다. 샘플이 염색 용액에 의해 완전히 덮여 있는 방식으로 염색 용액의 부피를 선택하고 샘플이 샘플 용기 내에서 자유롭게 이동할 수 있도록 합니다. 인큐베이션 시간은 다른 샘플에 대해 다를 수 있으며 그에 따라 조정되어야 합니다. - 염색 후, 샘플 용기에서 연조직 샘플을 조심스럽게 제거합니다.
- 셀룰로오스 티슈 페이퍼로 염색약의 과잉을 조심스럽게 제거하십시오.
- 연조직 샘플을 에탄올 증기상 위에 있는 원엽 샘플 용기에 넣고 보관하고 추가로 사용하십시오.
참고: 원유 질 샘플 용기는 연조직 시료를 촉촉하게 유지하고 유물을 방지하기 위해 튜브 바닥에 70 % (v / v) 에탄올 몇 방울을 항상 포함해야합니다.
2. 엑스레이 마이크로CT 화상 진찰
참고: X선 마이크로CT 측정은 개요 CT 측정(시야(FOV) 내의 전체 샘플을 이미지화하는 기능) 및 고해상도 CT 측정의 성능(에 초점을 맞출 수 있는 기능)을 제공하는 microCT 스캐너로 수행되었습니다. 1 μm까지 매우 동일한 샘플의 관심 (VOI)의 하나의 원하는 볼륨에.
- 연조직 샘플을 적절한 샘플 홀더에 장착합니다. X선 CT 측정 중에 시료가 움직이지 않도록 시료 홀더에 시료가 단단히 끼도록 하십시오.
- 염색된 마우스 신장의 경우: 두 개의 원심분리기 튜브가 있는 샘플 홀더를 준비하여 한 튜브의 바닥이 잘려나오게 합니다. 두 성분 접착제를 사용하여 두 개의 원심 분리튜브를 함께 붙입니다. 회전 축 을 중심으로 원심 분리기 튜브의 직선 정렬을 보장합니다. 접착제가 굳을 때까지 기다립니다.
- 시료 홀더를 사용할 준비가 되면 마우스 신장을 그대로 원심분리기 튜브로 옮기고 튜브 바닥에 70%(v/v) 에탄올을 몇 방울 떨어뜨립니다.
참고: 샘플의 안정성은 매우 중요합니다. X선 CT 측정을 위해 샘플을 준비하는 데 시간을 할애하십시오. 연조직 샘플은 에탄올 증기 상 에 의해 보관되어 X 선 CT 측정 중에 샘플을 촉촉하게 유지하고 연조직 샘플이 수축 및 기타 아티팩트를 방지합니다. 연조직 샘플은 X선 CT 측정 중에 시료 주위의 용매가 축적되어 용매와 접촉해서는 안 되며, 이는 측정 중에 시료 이동으로 이어지거나 재구성 중에 문제를 일으킬 수 있습니다. 시료 홀더가 용매를 바닥에 고정하지 못하는 경우 70%(v/v) 에탄올로 적신 셀룰로오스 종이를 샘플 홀더에 놓을 수 있습니다. 용매 에탄올로 인한 수축 아티팩트는 관찰되지 않았다는 점에 유의해야합니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
- 샘플을 신중하게 정렬한 후 최상의 이미지 품질을 위해 수집 매개변수를 선택합니다. 제시된 microCT 데이터의 경우, 360°에 걸쳐 균등하게 분포된 1601개의 프로젝션을 사용하여 3.5W의 전류인 50kV의 피크 전압에서 스캔을 획득합니다.
참고: 최상의 이미지 품질을 위해 개요 CT 스캔에 대한 수집 매개변수가 선택되었습니다. 따라서 0.39x 카메라 대물렌즈는 시야(FOV) 내의 전체 샘플을 커버하도록 선택되었습니다. 그 결과 유효 픽셀 크기는 12 μm입니다. 프로젝션당 2s의 노출 시간은 잡음 비에 양호한 신호를 제공했습니다. 고분해능 CT 스캔에 대한 ROI는 개요 스캔으로부터의 microCT 데이터를 사용하여 확인되었다. MicroCT 스캐너는 종종 통합 된 소프트웨어 도구를 통합하여 결정된 ROI를 정확하게 선택할 수 있습니다. 고해상도 CT 데이터의 경우 4x 카메라 대물렌즈를 선택하여 3.3μm의 유효 픽셀 크기를 생성했습니다. 여기서, 프로젝션당 15s의 노출 시간이 필요했다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. - X선 CT 데이터를 수집한 후 3D 부피의 재구성을 위해 그에 따라 투영을 처리합니다. 제시된 microCT 데이터의 경우: X선 CT 데이터를 통합 소프트웨어로 재구성합니다.
참고: 그림 1및 그림 2에 표시된 microCT 데이터의 볼륨 렌더링은 시각화 소프트웨어를 사용하여 생성되었습니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
3. 엑스레이 나노CT 화상 진찰
참고 : X 선 나노 CT 스캐너는 사내에서 개발되었습니다. 렌즈 프리 기기에는 나노포커스 X선 소스와 단일 광자 계수 검출기가 장착되어 있습니다. 해상도가 100 nm까지 3D 데이터는10을생성 할 수 있습니다. 일반적으로, X선 광학을 가진 것을 포함하는 nanoCT 시스템은 기술된 nanoCT 스캐너에 한정되지 않고 상업적으로 이용가능합니다.
- 나노CT 시료 전형
- 연조직 샘플의 VOI를 준비합니다. 메스와 입체 현미경을 사용하여 약 0.5mm 가장자리 길이의 매우 작은 조각으로 연조직을 잘라. 마우스 신장의 경우: 마우스 신장을 가장 긴 축을 따라 두 개의 반쪽으로 자른다. 마우스 신장의 반을 가지고 신장 피질과 신장 수질과 같은 다른 해부학 적 영역을 준비.
참고: 마우스 신장의 다른 반쪽은 조직병리학으로 옮겨졌고, 여기서 샘플을 파라핀에 삽입하고 그에 따라 처리하여 그림 3c 및 그림 3d에서 볼 수 있는 전형적인 조직학적 섹션을 산출하였다. . - 첫 번째 탈수 단계 전에 작은 조각을 새로운 페트리 접시로 옮기고 이후의 모든 단계에 남아 있습니다.
- 50, 60, 70, 80, 90, 96 및 100 에탄올과 증류수로 균형 잡힌 농도(모든 v/v)를 사용하여 샘플을 탈수합니다. 각 탈수 단계를 각각 1 시간씩 수행합니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 작은 티슈 조각을 하룻밤 동안 100% 에탄올에 보관하십시오. - 임계 점 건조 (CPD) 작은 조직 조각.
참고: CPD의 적용은 용매(여기에 에탄올)를 건조제와 교환함으로써 조직 샘플의 완전한 탈수를 가능하게 한다(여기CO2). 이는 샘플이 nanoCT의 샘플 홀더에 장착될 수 있고, 측정 중에 이동하지 않으며, 최상의 기하학적 배율을 허용하도록 X선 소스에 매우 가깝게 배치될 수 있도록 하기 위해 필요했습니다. nanoCT 설정은 단순한 기하학적 배율을 기반으로 하며, 배율 계수는 소스 대 샘플 거리동안의 소스 대 검출기 거리로 정의됩니다. 건조 기술은 전자 현미경 검사법(28)에대한 생물학적 표본의 3D 구조를 보존하기 위해 앤더슨에 의해 처음 도입되었다. 기술의 개요는 Bray29에의해 제공됩니다.- 진공 챔버를 100% 에탄올로 미리 채웁니다. 작은 조직 조각을 마이크로 다공성 캡슐로 옮기고 CPD의 진공 챔버에 넣습니다.
참고: CPD 공정에 고압이 관여하므로 CPD의 모든 부분, 특히 피팅이 손상되지 않고 시스템이 제대로 닫혀 있는지 확인하십시오. - 챔버를 6- 8 ° C로 냉각하고 액체 CO2로채웁니다.
- 교반하는 동안 두 성분을 적절히 혼합할 수 있도록 3분간 기다립니다. 조심스럽게 챔버를 배출합니다. 시료 홀더가 여전히 용매로 덮여 있는지 확인하십시오. 이 단계를 10번 반복하여 샘플 내에서CO2로 에탄올을 완전히 대체할 수 있도록 합니다.
- 챔버를CO2로최종 충전한 후, 기계를 CO2(31°C 및 73.8bar)의 임계 점까지 가열한 다음 30분 동안 기체 CO2의 매우 느린 방출을 거친후.
참고 : 가스의 방출그렇지 않으면 응축 물이 샘플에 형성 될 수 있기 때문에 매우 천천히 착수해야한다. 온도가CO2의임계점 아래로 떨어지지 않도록 하십시오. 시스템에서 모든 압력이 해제된 경우에만 CPD 기계를 엽니다. - 기계에서 CPD 조직 조각을 신속하게 제거하고 추가 사용 전에 건조기에 저장된 새로운 페트리 접시에 보관하십시오.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
- 진공 챔버를 100% 에탄올로 미리 채웁니다. 작은 조직 조각을 마이크로 다공성 캡슐로 옮기고 CPD의 진공 챔버에 넣습니다.
- 연조직 샘플의 VOI를 준비합니다. 메스와 입체 현미경을 사용하여 약 0.5mm 가장자리 길이의 매우 작은 조각으로 연조직을 잘라. 마우스 신장의 경우: 마우스 신장을 가장 긴 축을 따라 두 개의 반쪽으로 자른다. 마우스 신장의 반을 가지고 신장 피질과 신장 수질과 같은 다른 해부학 적 영역을 준비.
- CPD 조직 조각을 적절한 샘플 홀더에 장착합니다. CT 측정 중에 시료가 이동하지 않도록 시료 홀더에 시료가 단단히 고정되도록 하십시오. CPD 마우스 신장 조직 조각의 경우: 샘플 홀더에 슈퍼 접착제로 조직 조각을 접착제.
참고: CT 측정 중에 시료의 원치 않는 움직임은 부피 재구성 중에 특히 나노미터 복셀 크기의 데이터 세트를 획득할 때 문제를 일으킬 수 있습니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. - 샘플을 신중하게 정렬한 후 최상의 이미지 품질을 위해 수집 매개변수를 선택합니다. 제시된 nanoCT 데이터의 경우: 360° 이상에 동등하게 분포된 1599개의 프로젝션과 약 400 nm의 복셀 크기로 60kV의 피크 전압에서 투영을 획득합니다.
참고: 400 nm 복셀 크기에서 획득한 단일 CT 측정은 회전 축(수직)의 방향으로 75 μm의 FOV를 가지며 회전 축(수평)에 수직인 방향으로 약 560μm를 가합니다. 더 큰 볼륨을 조사하기 위해 회전 축을 따라 FOV의 확장을 다른 수직 위치에서 여러 스캔을 결합하여 얻을 수 있습니다. 추가적으로, 현지 단층 촬영 검사는 글로벌 CT 검사의 FOV에 의해 주어진 보다는 회전 축에 수직으로 더 큰 견본 직경을 가진 견본을 측정하기 위하여 수행될 수 있습니다. 나노CT 데이터는 프로젝션당 4 s의 노출 시간으로 획득되었다. 따라서 데이터 집합당 총 수집 시간은 약 3.5시간이었습니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. - CT 데이터를 수집한 후 3D 볼륨의 재구성을 위해 그에 따라 투영을 처리합니다.
- 제시된 nanoCT 데이터의 경우, 획득된 투영을 플랫필드 이미지로 정규화합니다. 리처드슨-루시 데천권 알고리즘30,31을사용하여 프로젝션의 선명도를 향상시킵니다. 한 픽셀의 표준 편차가 있는 회전 대칭 가우시안 함수를 데콘볼루션 커널로 사용합니다.
- Paganin의 위상 검색 알고리즘을 선명하게 한 이미지에 적용하여 연조직 대비를 높입니다. 알고리즘의 매개 변수를 설정하여 이미지 품질32를최적화합니다. 최첨단 필터링된 백프로젝션 알고리즘으로 전처리된 프로젝션을 재구성합니다.
참고: 도 3은 약 7 μm 두께였던 상응하는 조직학적 단면으로 얻어진 nanoCT 데이터를 평가한다. 따라서, 약 7 μm의 가상 두께를 가진 18개의 인접한 나노CT 슬라이스의 최소 강도 프로젝션 슬라이스는 관련 슬라이스의 각 픽셀에 대한 최소값을 계산하는 방법으로 생성되었다. 그림 4에표시되는 nanoCT 데이터의 볼륨을 렌더링하기 위해 시각화 소프트웨어가 사용되었습니다.
Representative Results
그림 1은 염색 후 대비 향상을 강조하는 저해상도 마이크로CT 데이터의 CT 슬라이스 및 볼륨 렌더링을 보여줍니다. 도 2는 전체 마우스 신장의 국소 단층 촬영으로부터 유래된 고해상도 마이크로CT 데이터의 CT 슬라이스 및 부피 렌더링을 나타낸다. 도 3은 상응하는 조직학적 단면과 비교하여 나노CT 데이터의 CT 슬라이스를 나타낸다. 그림 4는 셀룰러 수준에서 구조적 세부 사항을 강조하는 nanoCT 데이터의 CT 슬라이스 및 볼륨 렌더링을 보여줍니다. 저분해능 마이크로CT 측정을 통해 전체 장기의 개요를 확인할 수 있으며 고해상도 마이크로CT 측정에 대한 관심도(VOI)를 식별하는 데 도움이 됩니다. 이러한 다중 스케일 접근법을 통해, 나노CT에 대한 VOI가 결정된다. 나노CT는 세포 수준에서 연조직 샘플의 매우 상세한 보기를 가능하게 합니다. 해당 조직학 섹션과의 비교 연구는 조직 병리학과의 완전한 호환성을 강조합니다. 여기서, 다중 모달 이미징 접근법은 두 양식으로 얻은 결과를 확인한다.
그림 1. 저해상도 마이크로CT 데이터의 CT 슬라이스 및 볼륨 렌더링. (a,b)염색 전후에 동일한 마우스 신장의 이미지를 개관하고, 각각 에오신 계열 염색 프로토콜의 적용 후 얻어진 대비 향상을 강조한다. 두 microCT 데이터 집합은 동일한 수집 매개 변수를 사용하여 수집되었습니다. 두 데이터 세트의 복셀 크기는 12 μm입니다. (b)에서달성된 대비 향상은 다음과 같은 해부학적 구조 영역의 식별을 가능하게 한다: 피질 (I), 외부 수질 (II) 외부 수질 (IIa) 및 외부 수질 (IIb)의 외부 줄무늬에서 추가 구별, 내부 수질 (III), 유두 (IV) 및 신장 골반 (V). (c)전체 마우스 신장을 통해 가상 시상 절편을 나타내는 microCT 데이터의 볼륨 렌더링. 이 그림은 Busse 및 Müller외에서수정되었습니다. 26이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 개발된 에오신 계체 염색 프로토콜의 적용 후 동일한 마우스 신장으로부터 유래된 고해상도 마이크로CT 데이터의 CT 슬라이스 및 부피 렌더링. (a)왼쪽 모서리에는 표시된 고해상도 이미지에 대한 ROI(파란색 상자)를 강조하는 개요 microCT 이미지가 표시됩니다. 다음 해부학 구조 영역은 식별 할 수 있습니다 : 피질 (I), 외부 수질 (II) 외부 수질 (IIa) 외부 수질 (IIb) 및 외부 수질 (IIb), 내부 수질 (III), 작은 꽃줄 (IV) 및 혈관 (V 및 VI)의 외부 줄무늬에 추가 구별. (b)복셀 크기가 3.3 μm인 고해상도 마이크로CT 데이터의 관심 렌더링 볼륨. 전체 신장의 국소 단층 촬영으로부터 유래된 혈관을 통한 수질 영역 및 가상 섹션이 도시된다. 이 그림은 Busse와 뮐러 외26에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 나노CT 데이터의 CT 슬라이스(a,b)는 개발된 에오신 계 염색 프로토콜의 적용 후 동일한 마우스 신장으로부터 유래된 조직학적 단면도(c,d)와 비교한다. (a) 염색, 해부 및 CPD 후 동일한 마우스 신장 샘플의 nanoCT 이미지는 도 1 및 도 2에서볼 수 있는 영역(IIb)의 상세한 구조를 나타낸다. 이들은 헨레의 루프의 두꺼운 오름차순 사지로 알려져 있습니다. (b)(a)에도시된 동일한 나노CT 데이터 세트에서 유래된 최소 강도 프로젝션 슬라이스는 약 7 μm의 가상 슬라이스 두께를 가지며, 이는 세포 핵의 명확한 시각화를 가능하게 한다. (c)세포 핵과 브러쉬 테두리의 명확한 시각화와 헨레의 루프의 두꺼운 오름차순 사지를 표시하는 대표 조직 섹션. 조직학적 섹션은 약 7 μm의 두께를 가지며 파라핀 블록에 에오신 계 염색 및 포함시킨 후 동일한 마우스 신장 샘플로부터 수득하였다. (d)보라색으로 세포 핵을 강조하는 카운터 얼룩 헤마톡실린의 적용을 받는 대표적인 조직학적 섹션. (c)에 도시된 단면에 가까운조직학적 단면의 제조는 대략 7 μm의 두께를 가진. 이 그림은 Busse 및 Müller외에서수정되었습니다. 26이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 나노CT 데이터의 CT 슬라이스 및 볼륨 렌더링. (a)동일한 마우스 신장 샘플의 nanoCT 이미지는 헨레의 고리에서 두꺼운 오름차순 으로 알려진 구조를 나타낸 것이다. 이는 약 400 nm의 복셀 크기를 가진 신장의 작은 조각으로부터 획득한 도 1 및 도 2에서 볼 수 있는 영역(IIb)에 대한 상세한 보기이다. 샘플의 제조는 염색, 해부 및 CPD를 수반하였다.(b)Henle의 고리에서 두꺼운 오름차순 사지의 3D 구조를 시각화하는 nanoCT 데이터의 볼륨 렌더링. 이 그림은 Busse 및 Müller외에서수정되었습니다. 26이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
현재, 에오신은 세포질에 라벨을 붙이는 표준 조직학적 프로토콜로서 사용된다. 염색제는 연조직의 미세한 조각(일반적으로 2-10 μm의 두께로 절단)에 0.1% (w/v) 수성 용액으로 적용된다33. 이러한 표준화된 조직학적 프로토콜을 전체 마우스 신장과 같은 3D 조직 샘플에 적용해도 CT 이미지가 감쇠 대비를 강화하지 는 않는다. 한편으로는, 이것은 실험실 기지를 둔 microCT 시스템의 전형적으로 이용되는 엑스레이 에너지를 위한 연약한 조직의 낮은 본질적인 감쇠 특성에 기인할 수 있습니다. 일반적으로 연조직은 주로 탄소, 수소, 산소 및 질소34로구성되므로 대비 향상을 초래하지 않습니다. 한편, 염색에 사용되는 에오신의 농도가 낮을수록 제한 요인이 되었다. 1개의 에오신 분자가 4개의 브로마이드 원자 (Z= 3534를가진 높은 원자 수 요소 브롬)를 보유하더라도, X 선 CT 화상 진찰을 위해 요구된 감도 수준은 충족되지 않았습니다.
낮은 감쇠 대비의 이 도전을 극복하기 위하여, 에오신의 몇몇 사격량은 조사되었습니다. 제한은 여기에 수성 용액에서 30 %(w / v)인 물에서 에오신의 최대 용해도입니다. 연조직 내의 최고의 감쇠 대비 향상은 램버트 맥주 법에 따라 예상된 가장 높은 에오신 농도로 관찰되었다. 따라서, 최종 염색 프로토콜은 가장 높은 농도로 수행되었다.
연조직을 분자 수준에서 최적으로 준비하는 방법에 대한 질문은 대비 향상을 더욱 개선하기 위해 염색 시술에 대한 pH 조정에 의해 응답되었다. 여기서, 고정 시 또는 염색 전에 연조직 샘플의 산성화가 결정적인 것으로 나타났다. 이것은 또한 홍 외 에 의해 표시 되었다35. 산에 의해 세포 세포질 내의 염색제의 더 높은 축적은 세포 세포질 내에 존재하는 단백질 및 펩티드의 아미노산 측사슬의 protonation의 결과인 향상된 이온 상호 작용을 통해 달성되었다. 얼룩지지 않은 연조직 시료와 비교하여 대비 향상을 강조하는 대표적인 결과는 도 1a,b에나타내었다. 여기에서, 피질, 수질, 유두 및 신장 골반과 같은 중요한 해부학 적 영역을 시각화하는 전체 마우스 신장의 구조적 개요가 달성되었다.
제시된 염색 프로토콜은 적용이 간단하며 세 단계만 포함합니다. 필요한 시약에 쉽게 접근할 수 있습니다. 24 시간의 전반적인 염색 시간은 실험실 환경에서 연조직 샘플의 3D 시각화(그림 1c, 그림 2b 및 그림 4b)를가능하게하는 전체 장기 염색에 빠릅니다. 세포 수준으로 여러 스케일다운. 필요한 염색 용액의 전체 염색 시간과 부피는 샘플의 특성에 따라 일부 적응을 요청할 수 있음을 유의해야 한다. 그럼에도 불구하고, 에오신 계 염색 프로토콜은 전체 장기 염색에 적합하며, 이는 전체 장기의 고해상도 microCT 이미징을 가능하게 합니다. 마이크로CT 측정 동안 시료를 촉촉하게 유지하는 데 사용되었던 용매 에탄올로 인한 수축 아티팩트는 관찰되지 않았다. 나노CT 이미징을 위해 추가적인 준비 단계가 필요하며, 이를 통해 원래 샘플에서 회수된 더 작은 조직 조각을 조사할 수 있습니다. 향후 조직병리학 적 응용 과 관련하여 개요 검사는 변경 된 해부학 적 영역 및 구조에 대한 귀중한 통찰력을 제공하므로 그림2a에서설명 한 바와 같이 ROI를 결정할 수 있습니다. 이들은 microCT(도 1c 및 도 2b)또는 nanoCT(도 4b)에의해 3D로 연구될 수 있고 조직학으로 2D로 평가될 수 있다(그림3).
프로토콜의 또 다른 강점은 H & E 염색 절차와 관련하여 조직 병리학과의 완전한 호환성에서 볼 수 있습니다. 에오신 계 염색 시술을 대량 시료에 적용하는 것은 조직학적 염색 용액에 비해 적용된 에오신 농도가 훨씬 높음에도 불구하고 추가적인 조직학적 조사를 방해하지않는다(그림 3). 약 400 nm(도3a)의가상 두께를 가진 나노CT 슬라이스는 상응하는 연조직 샘플로부터 유래된 조직학적 단면도(도3c)와이미 매우 잘 비교된다. 조직학적 단면의 대략적인 두께를 7-10 μm로 고려하여, 약 7 μm의 가상 두께에 해당하는 나노CT 데이터의 최소 강도 투영슬라이스의생성을 조직학 섹션과 더 나은 비교(그림 3c). 여기서, 세포 핵은 세포세포질33에서단백질 및 펩티드를 특이적으로 염색하는 에오신으로서 비감쇠 영역으로서 명백하게 밝혀져 있다.
표준 조직학적 염색 절차에 비해 염색의 순서가 역전되었음에도 불구하고 표준 조직학적 방법으로 추가적인 역염색의 적용이 가능하다. 먼저 CT에 대한 개발 된 에오신 기반 염색 프로토콜로 시작하여 헤마톡시린으로 그 에오신 기반 조직 학적 섹션의 카운터 염색을 통해 완전한 호환성을 허용하고 예상 된 형태를 표시하는 고품질의 염색결과를 제공합니다. 외형의. 메이어의 신헤마톡실린을 함유한 세포 핵 특이적 염색을 보라색으로 세포 핵을 강조하는 조직학적 섹션에 적용하였다(도3d). 조직학적 카운터 얼룩의 적용은 현재 H-얼룩으로 제한된다. 주기산 Schiff의 기지, Elastica 반 기손 또는 고모리 실버와 같은 그밖 표준 조직학 카운터 얼룩은 면역 조직학 기술과의 호환성을 평가될 필요가 있습니다.
에오신 계 염색 프로토콜은 (i) 세포질 특이적 표적화, (ii) 균질하고 완전한 염색, (iii) 용이한 구현, (iv) 확산 고리와 같은 아티팩트를 생성하지 않고 조직의 빠른 침투, (v) 염색을 허용한다. 크고 조밀한 연조직 샘플, 및 (vi) H&E 얼룩과 관련하여 조직 병리학과의 완전한 호환성. 이 요구 사항은 세포 수준까지 연조직의 고해상도 엑스레이 CT 가시화를 허용하는 것이 중요합니다. 최근 개발된 나노CT 장치12,36,37,비파괴 생성과 결합하여 기존의 조직학적 데이터와 대조적으로 비교할 수 있는 가상 조직학적 슬라이스 렌더링할 수 있습니다. 이 결합된 접근법은 현미경 조직 구조의 3D 시각화를 위한 귀중한 공구로 엑스레이 CT의 설치를 가능하게 할 것입니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
우리는 조직학적 토론과 스웨덴 Excillum AB의 매우 도움이 되는 팀에 대해 Enken Drecoll 박사에게 감사드립니다. 우리는 고급 포토닉스 (MAP)에 대한 우수 뮌헨 센터의 DFG 클러스터와 DFG 고트 프리트 빌헬름 라이프 니츠 프로그램을 통해 재정 지원을 인정합니다. 또한, 이 연구 프로젝트는 마리 Skłodowska-퀴리 그랜트 협정 번호에 따라 유럽의 연합 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램에서 자금을 받고있다. H2020-MSCA-IF-2015-703745-CONSALT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50-ml centrifuge tube by Falcon | VWR | 734-0453 | |
| Formaldehyde solution, 37% | Carl Roth | CP10.2 | acid-free, stabilized with ~10% MeOH |
| Glacial acetic acid | Alfa Aesar | 36289.AP | |
| Eosin Y disodium salt | Sigma-Aldrich | E4382 | certified by Biological Stain Commission |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | L1825 | Dulbecco's formualtion, w/o calcium and magnesium |
| Sample Tubes by Nalgene | Carl Roth | ATK5.1 | |
| Rocking Shaker ST5 | CAT | 60281-0000 | |
| Cellulose tissue paper | VWR | 115-0600 | |
| Forceps, by USBECK Laborgeräte | VWR | 232-0096 | |
| Microcentrifuge tubes by Eppendorf | VWR | 211-2120 | safe-lock, 2.0 ml |
| Ethanol absolute by Baker Analyzed | VWR | 80252500 | |
| Disposable safety scalpel by Aesculap | VWR | AESCBA210 | |
| Petri dish by Sterilin | VWR | 391-2019 | |
| Plastic pasteur pipette | Carl Roth | EA68.1 | graduated, 1 ml |
| Desiccator by Duran | VWR | SCOT247826954 | |
| Silicone grease by Bayer | Sigma-Aldrich | 85404 | high-vacuum |
| Carbon dioxide cylinder with standpipe | Linde | 3700113 | 10 kg, short |
| micro-porous treatment capsule | PLANO GmbH | 4614 | pore size 78 µm (B) |
| Bal-Tec CPD 030 | Bal-Tec AG | CO2 as drying agent | |
| Stemi 2000-C stereomicroscope with KL 1500 LCD | Zeiss | this stereomicroscope has been updated(1) | |
| Zeiss Xradia Versa 500 | Zeiss | this microCT scanner has been updated(2) | |
| Avizo Fire 8.1 | Thermo Fisher Scientific | ||
| PILATUS detector as part of the nanoCT scanner | Dectris | single-photon counting detector(4,5); there are commercially availble nanoCT systems available (6,7) | |
| nanofocus X-ray source as part of the nanoCT scanner | Excillum | high-flux nanofocus X-ray transmission tube(3); there are commercially availble nanoCT systems available(6,7) | |
| (1) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS stereomicroscopes https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/Stereomikroskope/1006> (September 06, 2019). | |||
| (2) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS Xradia 510 Versa https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/zeiss-xradia-510-versa.html> (April 10, 2019). | |||
| (3) Nachtrab, F. et al. Development of a Timepix based detector for the NanoXCT project. Journal of Instrumentation 10 (11), C11009, (2015). | |||
| (4) Kraft, P. et al. Performance of single-photon-counting PILATUS detector modules. Journal of Synchrotron Radiation 16 (3), 368-375, (2009). | |||
| (5) Kraft, P. et al. Characterization and calibration of PILATUS detectors. IEEE Transactions on Nuclear Science 56 (3), 758-764, (2009). | |||
| (6) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS Xradia 810 Ultra https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/xradia-810-ultra.html> (April 9 2019). | |||
| (7) Company, G. E. GE product information: Phoenix nanotom m, https://www.gemeasurement.com/sites/gemc.dev/files/geit-31344en_nanotom_m_0517.pdf> (April 10, 2019). |
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