Summary
Een protocol voor 3D-visualisatie van microscopische weefselstructuren met behulp van een X-Ray-specifieke kleurings methode ontworpen voor röntgenstraling computertomografie wordt gepresenteerd.
Abstract
We demonstreren een laboratorium gebaseerde methode combineren X-Ray microCT en nanoCT met een specifieke Röntgen vlek, die gericht is op het cytoplasma van de cel. Het beschreven protocol is eenvoudig aan te brengen, snel en geschikt voor grotere zachte weefselmonsters. De gepresenteerde methodologie maakt de karakterisering van cruciale weefselstructuren in drie dimensies mogelijk en wordt aangetoond op een hele muis nier. De Multiscale aanpak maakt het mogelijk om de hele muis nier beeld en ondersteunt de selectie van verdere volumes van belang, die worden verworven met hogere resoluties variërend in de nanometer bereik. Daardoor wordt de morfologie van zacht weefsel met een vergelijkbaar detailniveau als de corresponderende histologische Lichtmicroscopie beelden gereproduceerd. Diepere inzichten in de 3D-configuratie van weefselstructuren worden bereikt zonder verdere onderzoeken te belemmeren door middel van histologische methoden.
Introduction
Volledige karakterisatie van zachte weefselmonsters vereist informatie over de microstructuur van het 3D-weefsel. De huidige gouden standaard voor de analyse van zachte weefselmonsters is histopathologie. De weefsel-en cellulaire morfologie van het preparaat wordt onderzocht in 2D in geselecteerde gebieden van belang (ROIs) met behulp van optische microscopie1. Deze methode heeft echter verschillende nadelen. De voorbereiding van het monster is tijdrovend, ingewikkeld, destructief en vatbaar voor artefacten. De geproduceerde microscopische dia's bieden alleen 2D-informatie die parallel is aan het snijvlak. Vaak is het aantal histologische secties, die worden onderzocht, beperkt vanwege tijdsbeperkingen2,3.
In de afgelopen jaren is het gebied van 3D histologie geëvolueerd. Hier zijn virtuele weefsel segmenten van elk gewenst ruimtelijk vlak toegankelijk. Dit maakt het bijhouden van structuren in het monster mogelijk, wat leidt tot een dieper begrip van de 3D-weefsel architectuur en structurele veranderingen die gepaard gaan met verschillende pathologieën. Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om het genereren van 3D-volumegegevens te bereiken. Ze variëren van de seriële-sectie gebaseerde benaderingen, die gebruik maken van licht of elektronenmicroscopie4,5,6,7,8, om te blokkeren gezicht Imaging methoden, zoals Episcopic 3D-beeldvorming of blok-gezicht Scanning elektronenmicroscopie7,8,9. Alle genoemde methoden, echter, omvatten ofwel snijden of vernietigen van het monster volledig, die niet mogelijk voor verdere onderzoeken. De verkregen resolutie is sterk afhankelijk van het snijproces dat vatbaar is voor artefacten zoals beschreven in conventionele histologie. Deze methoden lijden ook van uitlijning artefacten.
3D X-Ray Imaging technieken zoals microscopisch en nanoscopische computertomografie (microCT en nanoCT) streven naar het genereren van 3D hoge-resolutie gegevens zonder vernietiging van het weefselmonster. Tot dusver heeft het zwakke Röntgen dempings contrast van zacht weefsel en de beperkte toegang tot hoge resoluties in een laboratoriumomgeving hun gebruik voor 3D-visualisatie van microscopische weefselstructuren aangetast. Recente ontwikkelingen in de richting van een op laboratoria gebaseerde X-Ray CT met hoge resolutie zorgen voor resoluties die ruim onder 1 μm10,11,12en13liggen.
Het gebrek aan contrast in zacht weefsel in conventionele op demping gebaseerde Röntgen beeldvorming wordt gecompenseerd door kleurings middelen, die het contrast van röntgenstraling versterken. Kleurings middelen die bekend zijn uit andere beeldvormingstechnieken zoals osmium tetroxide (OsO4), jodium kaliumjodide (IKI) of foshotungstisch zuur (PTA) worden vaak gebruikt14,15,16,17, 18,19,20,21,22,23,24,25. Kleurings middelen die (i) specifieke biologische targeting mogelijk maken, (II) homogene en volledige kleuring, (III) eenvoudige hantering, (IV) snelle penetratie van het weefsel zonder het creëren van artefacten zoals diffusie ringen, (v) grote en dichte weefsel kleuring, en (VI) volledige compatibiliteit met histopathologie is vereist om X-Ray CT te maken als gereedschap voor 3D-visualisatie van microscopische weefselstructuren. In dit werk laten we zien hoe zacht-weefselmonsters worden voorbereid op Röntgen-CT-beeldvorming met een cytoplasma-specifieke Röntgen vlek op basis van eosine die voldoet aan de bovenstaande eisen die hierboven zijn vermeld26.
De Multiscale Imaging-benadering waarborgt de beoordeling van de kleuringskwaliteit door middel van een overzichts microCT-meting en de selectie van belangstelling (VOIs) voor verdere onderzoeken met een hoge resolutie. De kleuringskwaliteit wordt geanalyseerd op kleurings parameters zoals (i) volledigheid, (II) verschijning van diffusie ringen, (III) contrastverbetering, (IV) verschijning van CT-artefacten zoals strepen en (v) homogeniteit. De laboratorium-gebaseerde nanoct Setup, die geometrische vergroting gebruikt om resoluties tot 100 nm te bereiken, visualiseert de morfologie van zacht weefsel op (sub)-cellulair niveau10,27. Een vergelijkende analyse van de segmenten van nanoCT met bijbehorende histologische Lichtmicroscopie beelden bevestigt de reproductie van weefsel architectuur met vergelijkbare Details op een microscopisch niveau in 2D, waardoor histopathologische karakterisering van het weefsel Monster. Dit gedetailleerde video protocol is bedoeld om het bewustzijn te vergroten en het potentieel van deze methodologie te benadrukken als niet-destructief 3D-soft-tissue beeldvormings instrument dat van belang is voor een brede wetenschappelijke gemeenschap zoals zoölogen, biologen en gezondheids Professionals.
Protocol
Let op: Raadpleeg voor gebruik alle relevante veiligheidsinformatiebladen (MSD'S). Verscheidene van de in het Protocol gebruikte chemicaliën zijn acuut giftig en kankerverwekkend. Gebruik alstublieft alle geschikte veiligheidspraktijken bij het uitvoeren van het kleurings protocol, inclusief het gebruik van technische controles (rook afzuigkap, Glovebox) en persoonlijke beschermingsmiddelen (veiligheidsbril, handschoenen, Labcoat, broek van volledige lengte, schoenen met gesloten teen).
Gebruikte dieren:
De huisvesting van dieren werd uitgevoerd bij de Klinikum rechts der Isar, Technische Universiteit van München overeenkomstig de richtsnoeren van de Europese Unie 2010/63. Orgaanverwijdering werd goedgekeurd door een intern dierenbeschermings Comité van Klinikum rechts der Isar, München, Duitsland (intern referentienummer 4-005-09). Alle procedures waren in overeenstemming met de relevante richtlijnen en verordeningen. Alle laboratoria worden geïnspecteerd volgens de OESO-beginselen van goede laboratoriumpraktijken.
1. eosine-kleurings Protocol
- Voor het fixeren van zachte weefselmonsters vult u een centrifugebuis van 50 mL met een fixatieve oplossing met 9,5 mL van 4% (v/v) formaldehyde oplossing (FA) en 0,5 mL ijsazijn (AA).
Opmerking: bereid de FA-oplossing vers van een 37% zuur vrije FA-oplossing gestabiliseerd met ongeveer 10% methanol. Verdun de FA-oplossing nog verder met de in Dulbecco's fosfaat gebufferde Saline (DPBS). Kies DPBS zonder calcium en magnesium. Houd de verdunde VA-oplossing niet langer dan één maand. Tijdens de verzuring verandert de pH van de fixatieve oplossing van neutraal naar ongeveer 3.
Let op: omdat FA acuut orgaan giftig, corrosief en kankerverwekkend is, is het gebruik van een rook afzuigkap verplicht en moet passende beschermende persoonlijke uitrusting worden gebruikt.- Voeg de vers verwijderde zacht weefselmonster toe aan een 50-mL centrifugebuis en koel de 50-mL centrifugebuis voor 24-72h.
Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken. - Was het zachte weefselmonster met DPBS-oplossing voor 1h.
- Voeg de vers verwijderde zacht weefselmonster toe aan een 50-mL centrifugebuis en koel de 50-mL centrifugebuis voor 24-72h.
- Om het gefixeerde zachte weefselmonster (bijv. een hele muis nier) te vlekken, plaatst u het zachte weefsel in 2 mL eosine Y-kleurings oplossing en incubeerd u het monster gedurende 24 uur. Houd het monster op een horizontale schud plaat voor een gladde schommeling (ca. 60 rpm) tijdens de incubatie Proces.
NB: de eosine Y-kleuring oplossing heeft een concentratie van 30% (w/v) in gedistilleerd water. Kies het volume van de kleurings oplossing zodanig dat het monster volledig door de kleurings oplossing wordt bedekt en laat het monster vrij in de monsterhouder bewegen. De incubatietijd kan voor andere monsters verschillen en moet dienovereenkomstig worden aangepast. - Verwijder na het vlekken het zachte weefselmonster voorzichtig uit de monsterhouder.
- Verwijder voorzichtig overtollig kleurstof middel met cellulose-tissuepapier.
- Plaats het zachte weefselmonster in een conische monsterhouder boven een ethanol Dampfase voor opslag en verder gebruik.
Opmerking: de conische monsterhouder moet altijd een paar druppels van 70% (v/v) ethanol op de bodem van de buis bevatten om het zachte weefselmonster vochtig te houden en artefacten te voorkomen.
2. Röntgen microCT-beeldvorming
Opmerking: de X-Ray microCT-metingen werden uitgevoerd met een microCT-scanner, die overzicht CT-metingen biedt (de mogelijkheid om het hele monster in het gezichtsveld (FOV) te afbeelden) en de prestaties van CT-metingen met hoge resolutie (de mogelijkheid om scherp te stellen in op een gewenst volume van belangstelling (VOI) van hetzelfde monster) tot 1 μm.
- Monteer het zachte weefselmonster op een geschikte monsterhouder. Zorg voor een strakke pasvorm van het monster op de monsterhouder om te voorkomen dat het monster tijdens de X-Ray CT-metingen beweegt.
- In geval van een bevlekt muis nier: bereid een monsterhouder met twee centrifugebuizen, waarbij de onderkant van een buis wordt afgesneden. Lijm de twee centrifugebuizen samen met behulp van twee componenten lijm. Zorg voor een rechte uitlijning van de centrifugebuizen rond de rotatie-as. Wacht tot de lijm verharden.
- Zodra de monsterhouder klaar is voor gebruik, breng de muis nier over in de intacte centrifugebuis, die een paar druppels van 70% (v/v) ethanol op de bodem van de buis vasthoudt.
Opmerking: de stabiliteit van het monster is cruciaal. Neem de tijd om het monster voor te bereiden op X-Ray CT-metingen. Het zachte weefselmonster wordt over een ethanol Dampfase gehouden om het monster vochtig te houden tijdens de X-Ray CT-metingen en het zachte weefselmonster te voorkomen van krimp en andere artefacten. Het zachte-weefselmonster mag niet in contact komen met het oplosmiddel om accumulatie van het oplosmiddel rond het monster tijdens de X-Ray CT-meting te voorkomen, wat kan leiden tot een monster beweging tijdens de meting of problemen kan veroorzaken tijdens de reconstructie. Als de monsterhouder niet toelaat om een oplosmiddel aan de onderzijde vast te houden, kan een cellulose papier dat met 70% (v/v) ethanol is bevochtigd in de monsterhouder worden geplaatst. Opgemerkt moet worden dat krimp artefacten als gevolg van het oplosmiddel ethanol werden niet waargenomen.
Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken.
- Kies na zorgvuldige uitlijning van het voorbeeld acquisitie parameters voor de beste beeldkwaliteit. In het geval van de gepresenteerde microCT-gegevens, verwerven van de scan bij een piekspanning van 50 kV, een stroom van 3,5 W met behulp van 1601 projecties gelijkelijk verdeeld over 360 °.
Opmerking: de acquisitie parameters voor de overzicht CT-scan zijn gekozen voor de beste beeldkwaliteit. Als zodanig werd de 0.39 x camera doelstelling gekozen om het hele monster te bedekken binnen het gezichtsveld (FOV). Dit resulteerde in een effectieve pixelgrootte van 12 μm. De belichtingstijd van 2 sec. per projectie voorzag in een goede signaal-ruis verhouding. De ROI voor de CT-scan met hoge resolutie is geïdentificeerd met behulp van de microCT-gegevens uit de overzichts scan. MicroCT scanners bevatten vaak een geïntegreerde software tool, die de precieze selectie van de vastgestelde ROI mogelijk maakt. Voor de CT-gegevens met hoge resolutie werd de 4x-camera doelstelling gekozen, resulterend in een effectieve pixelgrootte van 3,3 μm. Hier was een belichtingstijd van 15 sec. per projectie nodig.
Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken. - Na overname van de X-Ray CT-gegevens worden de projecties dienovereenkomstig verwerkt voor reconstructie van het 3D-volume. In het geval van de gepresenteerde microCT-gegevens: reconstrueren de X-Ray CT-gegevens met de geïntegreerde software.
Opmerking: de volume weergave van de microCT-gegevens weergegeven in afbeelding 1 en Figuur 2 is gegenereerd met behulp van een visualisatiesoftware.
Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken.
3. X-Ray nanoCT Imaging
Opmerking: de X-Ray nanoCT scanner is ontwikkeld inhouse. Het gratis instrument van de lens is uitgerust met een nano focus röntgenbron en een Single-Photon tellings detector. 3D-gegevens met resoluties tot 100 nm kunnen worden gegenereerd10. Over het algemeen zijn nanoCT-systemen, waaronder die met Röntgen optiek, commercieel beschikbaar en niet beperkt tot de beschreven nano Oct-scanner.
- NanoCT monstervoorbereiding
- Bereid VOIs van het zachte weefselmonster. Snijd het zachte weefsel in zeer kleine stukjes van ongeveer 0,5 mm rand lengte met behulp van een scalpel en een stereomicroscoop. In het geval van de nier van de muis: Snijd de muis nier in twee helften langs de langste as. Neem een helft van de muis nier en bereid verschillende anatomische gebieden zoals nierschors en niermerg.
NB: de andere halve muis nier werd overgebracht naar de Histopathologie, waar het monster in paraffine werd ingesloten en dienovereenkomstig werd verwerkt om de typische histologische secties zoals te zien in Figuur 3c en Figuur 3d . - Breng de kleine stukjes voor de eerste dehydratie stap over naar een nieuwe Petri schaal, waar ze voor alle volgende stappen blijven.
- Dehydraat de monsters met behulp van concentraties (alle v/v) in%: 50, 60, 70, 80, 90, 96 en 100 ethanol gebalanceerd met gedistilleerd water. Voer elke dehydratie stap voor 1 uur per stuk.
Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken. Houd de kleine weefsel stukken in 100% ethanol 's nachts. - Kritische punt droog (CPD) de kleine stukjes van het weefsel.
Opmerking: de toepassing van CPD maakt de volledige dehydratie van het weefselmonster mogelijk door het oplosmiddel (dit is ethanol) uit te wisselen met het droogmiddel (hier CO2). Dit is noodzakelijk om ervoor te zorgen dat het monster aan de Monsterhouders van de nanoCT kan worden gemonteerd, niet beweegt tijdens de meting en zeer dicht bij de röntgenbron kan worden gepositioneerd om de beste geometrische vergroting mogelijk te maken. De installatie van nanoCT is gebaseerd op een simpele vergroting, waarbij de vergrotingsfactor wordt gedefinieerd als de afstand van de bron-naar-detector over de afstand van de bron tot het monster. De droogtechniek werd voor het eerst geïntroduceerd door Anderson om de 3D-structuur van biologische specimens voor elektronenmicroscopie28te behouden. Een overzicht van de techniek wordt geleverd door Bray29.- Vul de vacuümkamer vooraf met 100% ethanol. Breng de kleine weefsel stukjes over in een micro-poreuze capsule en plaats deze in de vacuümkamer van de CPD. Sluit het systeem.
Opmerking: aangezien hoge druk is betrokken bij het CPD-proces, moet ervoor worden gezorgd dat alle onderdelen van de CPD, in het bijzonder de fittingen, intact zijn en het systeem goed wordt gesloten. - Koel de kamer af tot 6-8 °C en vul aan met Liquid CO2.
- Terwijl u roeren, wacht 3 min om de juiste menging van de twee componenten mogelijk te maken. De kamer voorzichtig aftappen. Zorg ervoor dat de monsterhouder nog steeds bedekt is met oplosmiddel. Herhaal deze stap tien keer om de volledige vervanging van ethanol met CO2 in het monster mogelijk te maken.
- Verwarm de machine na de laatste vulling van de kamer met CO2op het kritieke punt van co2 (31 °c en 73.8 bar), gevolgd door een zeer langzame afgifte van de gasvormige co2 over een tijd van 30 min.
Opmerking: de afgifte van het gas moet zeer langzaam worden uitgevoerd, omdat anders condenseer water op het monster kan vormen. Zorg ervoor dat de temperatuur niet onder het kritieke punt van CO2daalt. Open de CPD-machine alleen als alle druk uit het systeem is vrijgegeven. - Verwijder de CPD-weefsel stukken snel uit de machine en bewaar ze in een nieuwe Petri schaal die in een exsiccator wordt opgeslagen voordat ze verder worden gebruikt.
Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken.
- Vul de vacuümkamer vooraf met 100% ethanol. Breng de kleine weefsel stukjes over in een micro-poreuze capsule en plaats deze in de vacuümkamer van de CPD. Sluit het systeem.
- Bereid VOIs van het zachte weefselmonster. Snijd het zachte weefsel in zeer kleine stukjes van ongeveer 0,5 mm rand lengte met behulp van een scalpel en een stereomicroscoop. In het geval van de nier van de muis: Snijd de muis nier in twee helften langs de langste as. Neem een helft van de muis nier en bereid verschillende anatomische gebieden zoals nierschors en niermerg.
- Monteer de CPD-weefsel stukken op een geschikte monsterhouder. Zorg voor een strakke pasvorm van het monster op de monsterhouder om te voorkomen dat het monster tijdens de CT-metingen beweegt. In het geval van de CPD-muis nierweefsel stukken: lijm de weefsel stukken met superlijm aan een monsterhouder.
Opmerking: elke ongewenste verplaatsing van het monster tijdens CT-metingen kan problemen veroorzaken tijdens het volume reconstructie-vooral bij het verwerven van een gegevensset met nanometer Voxel grootte.
Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken. - Kies na zorgvuldige uitlijning van het voorbeeld acquisitie parameters voor de beste beeldkwaliteit. In het geval van de gepresenteerde gegevens van de nanoCT: verwerven van projecties bij een piekspanning van 60 kV met 1599 projecties gelijkelijk verdeeld over 360 ° en een Voxel grootte van ongeveer 400 nm.
Opmerking: een enkele CT-meting verworven op 400 nm Voxel grootte heeft een FOV van 75 μm in de richting van de rotatie-as (verticaal) en ongeveer 560 μm in de richting loodrecht op de rotatie-as (horizontaal). Om grotere volumes te onderzoeken, kan een uitbreiding van de FOV langs de rotatie-as worden bereikt door meerdere scans op verschillende verticale posities te combineren. Daarnaast kunnen lokale tomografie scans worden uitgevoerd om monsters te meten met een grotere monster diameter loodrecht op de rotatie-as dan gegeven door de FOV van een wereldwijde CT-scan. De gegevens van nanoCT werden verkregen met een blootstellingstijd van 4 sec. per projectie. Als zodanig was de totale acquisitie tijd per gegevensset ongeveer 3,5 uur.
Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken. - Verwerk na overname van de CT-gegevens de projecties dienovereenkomstig voor reconstructie van het 3D-volume.
- In het geval van de gepresenteerde nanoCT gegevens Normaliseer de verworven projecties met flatfield images. Verbeter de scherpte van de projecties met behulp van een Richardson-Lucy deconvolutie-algoritme30,31. Gebruik een rotationeel symmetrische Gaussiaanse functie met een standaarddeviatie van één pixel als deconvolutie-kernel.
- Pas het fase-retrieval algoritme van Paganin toe op de geslepen beelden om het zachte weefsel contrast te vergroten. Stel de parameters van het algoritme in om de beeldkwaliteit te optimaliseren32. Reconstrueer de voorbewerkte projecties met een state-of-the-art gefilterd Backprojection-algoritme.
Opmerking: Figuur 3 evalueert de verkregen nanoct-gegevens met bijbehorende histologische secties, die ongeveer 7 μm dik waren. Daarom werden projectie segmenten met een minimale intensiteit van 18 aangrenzende nanoCT-schijfjes met een virtuele dikte van ongeveer 7 μm gegenereerd door middel van het berekenen van de minimumwaarde voor elke pixel in de relevante segmenten. Een visualisatiesoftware werd gebruikt om het volume van de nanoCT gegevens te renderen, die wordt weergegeven in Figuur 4.
Representative Results
Figuur 1 toont CT-segmenten en volume rendering van microct-gegevens met een lage resolutie en accentueren contrastverbetering na kleuring. Figuur 2 toont CT-segmenten en volume weergave van microct-gegevens met hoge resolutie afgeleid van een lokale tomografie van de hele muis nier. Figuur 3 toont CT-segmenten van nanoct-gegevens in vergelijking met de bijbehorende histologische secties. Figuur 4 toont CT slice en volume rendering van gegevens van nanoct structurele details markeren op cellulair niveau. De microCT-meting met lage resolutie maakt een overzicht van het hele orgel mogelijk en helpt bij het identificeren van volumes van belangstelling (VOIs) voor de hoge-resolutie microCT-meting. Via deze Multiscale benadering wordt de VOI voor de nanoCT bepaald. De nanoCT maakt een zeer gedetailleerd beeld van het zachte weefselmonster op cellulair niveau. De vergelijkende studie met de bijbehorende histologische sectie benadrukt volledige compatibiliteit met histopathologie. Hier bevestigt de multimodale beeldvormings benadering de resultaten die met beide modaliteiten zijn verkregen.
Figuur 1. CT-segmenten en volume weergave van de microCT-gegevens met lage resolutie. (a, b) overzichts beelden van dezelfde muis nier vóór en na de kleuring, waarbij de contrastverbetering wordt benadrukt die is verkregen na de toepassing van het eosin-gebaseerde kleurings protocol. Beide microCT-gegevenssets zijn verkregen met behulp van identieke acquisitie parameters. De grootte van de Voxel in beide datasets is 12 μm. De bij (b) bereikte contrastverbetering maakt het mogelijk de volgende anatomische structuur gebieden te identificeren: cortex (I), buitenste MEDULLA (II) met verder onderscheid in buitenste strepen van buitenste medulla (IIA) en binnenste strepen van buitenste medulla (IIB); binnenste medulla (III), Papil (IV) en nierbekken (V). c) volume-rendering van microct-gegevens die een virtueel Sagittaal gedeelte door de hele muis nier weergeven. Dit cijfer is gewijzigd van Busse en Müller et al.26Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2. CT-segment en volume rendering van microCT-gegevens met hoge resolutie die zijn afgeleid van dezelfde muis nier na toepassing van het ontwikkelde eosin-gebaseerde kleurings protocol. (a) de linker hoek toont de overzicht microct afbeelding markeren van de ROI (Blue Box) voor de weergegeven hoge resolutie afbeelding. De volgende anatomische structuur gebieden zijn identificeerbaar: cortex (I), buitenste medulla (II) met verdere onderscheiding in buitenste strepen van buitenste medulla (IIa) en binnenste strepen van buitenste medulla (IIb), binnenste medulla (III), kleine kelk (IV) en vaten (V en VI). b) het volume van de rente rendering van de microct-gegevens met hoge resolutie die zijn verkregen met een Voxel-grootte van 3,3 μm. De Medulla regio en een virtueel deel door een vaartuig afgeleid van een lokale tomografie van de hele nier wordt getoond. Dit cijfer is gewijzigd van Busse en Müller et al.26. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3. CT-segmenten van nanoCT-gegevens (a, b) in vergelijking met de histologische secties (c, d) die zijn afgeleid van dezelfde muis nier na toepassing van het ontwikkelde eosin-gebaseerde kleurings protocol. a) het nanoct-beeld van hetzelfde muizen niermonster na kleuring, ontsnij ding en CPD toont gedetailleerde structuren van regio (IIB) in Figuur 1 en Figuur 2. Deze staan bekend als dikke oplopende ledematen van de lus van Henle. b) projectie segment met minimale intensiteit, afgeleid van dezelfde gegevensverzameling van nanoct als aangegeven ondera) meteen virtuele snijdikte van ongeveer 7 μm, die een duidelijke visualisatie van de celkernen mogelijk maakt. c) representatieve histologische sectie met dikke oplopende ledematen van de lus van Henle met duidelijke visualisatie van celkernen en borstel rand. De histologische sectie heeft een geschatte dikte van 7 μm en werd verkregen uit hetzelfde niermonster voor muizen na de toegepaste eosin-gebaseerde kleuring en inbedding in een paraffine blok. d) representatieve histologische sectie met toepassing van tegen vlek hematoxyline die de celkernen in paars accentueren. Bereiding van de histologische sectie in de buurt van de sectie (c) met een geschatte dikte van 7 μm. Dit cijfer is gewijzigd van Busse en Müller et al.26Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4. CT-segment en volume rendering van gegevens van nanoCT. a) het nanoct-beeld van hetzelfde muizen niermonster dat de structuren weergeeft die bekend staan als dikke oplopende ledematen van de lus van Henle. Dit is een gedetailleerd overzicht van de regio (IIb) gezien in Figuur 1 en Figuur 2 verkregen uit een klein stukje van de nier met een Voxel-grootte van ongeveer 400 nm. De bereiding van het monster betrof kleuring, ontleed en CPD. (b) volume-rendering van gegevens van nanoct visualiseren van de 3D-structuur van dikke oplopende ledematen van de lussen van Henle. Dit cijfer is gewijzigd van Busse en Müller et al.26Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
Momenteel wordt eosine gebruikt als het standaard histologische protocol om het cytoplasma van de cel te labelen. Het kleurings middel wordt aangebracht als een 0,1% (w/v) waterige oplossing voor microscopische schijfjes zacht weefsel (over het algemeen gesneden met een dikte van 2-10 μm)33. De toepassing van dit gestandaardiseerde histologische protocol op 3D-weefselmonsters zoals een hele muis nier resulteert niet in een verzwakking contrast verbeterde CT-afbeelding. Aan de ene kant kan dit worden toegeschreven aan de lage intrinsieke dempingseigenschappen van zacht weefsel voor typisch gebruikte Röntgen energieën van laboratorium-gebaseerde microCT-systemen. Doorgaans, zachte weefsel bestaat uit voornamelijk koolstof, waterstof, zuurstof en stikstof34, en daarom, resulteert niet in contrastverbetering. Aan de andere kant was de lage concentratie van eosine gebruikt voor kleuring de beperkende factor. Hoewel één eosine molecuul vier bromide-atomen (High atomic number element broom met Z = 3534) vasthoudt, werd niet voldaan aan de gevoeligheidsniveaus die nodig waren voor X-Ray CT-beeldvorming.
Om deze uitdaging van laag dempings contrast te overwinnen, werden verschillende concentraties van eosine onderzocht. Een beperking is hier de maximale oplosbaarheid van eosine in water, dat is 30% (w/v) in een waterige oplossing. Beste demping contrastverbetering binnen het zachte weefsel werd waargenomen met de hoogste eosine concentratie, die werd verwacht volgens de Lambert-Beer Law. Daarom werd het uiteindelijke kleurings protocol met de hoogste concentratie uitgevoerd.
De vraag hoe het zachte weefsel optimaal op moleculair niveau moet worden bereid voor de kleurings procedure om de contrastverbetering verder te verbeteren, werd beantwoord door aanpassing van de pH. Hier bleek de verzuring van het zachte weefselmonster tijdens fixatie of vóór kleuring cruciaal te zijn. Dit werd ook getoond door Hong et al.35. De hogere accumulatie van kleurstof in het cytoplasma van de cel door het zuur werd bereikt door verbeterde Ionische interacties, die een gevolg van de protonatie van aminozuur zijketens van eiwitten en peptiden aanwezig in het cytoplasma van de cel waren. Een representatief resultaat dat de contrastverbetering in vergelijking met een ongekleurd zacht weefselmonster benadrukt, wordt weergegeven in Figuur 1a, b. Hier werd een structureel overzicht van een hele muis nier visualisering van cruciale anatomische gebieden zoals cortex, medulla, Papil en nierbekken bereikt.
Het gepresenteerde kleurings protocol is eenvoudig aan te brengen en bevat slechts drie stappen. De benodigde reagentia zijn gemakkelijk toegankelijk. De totale kleurings tijd van 24 uur is snel voor een volledig-orgaan kleuring, waardoor de 3D-visualisatie van zachte weefselmonsters (Figuur 1c, Figuur 2b en Figuur 4b) in een laboratoriumomgeving op meerdere schalen omlaag naar cellulair niveau. Opgemerkt moet worden dat de totale kleurings tijd en het volume van de kleurings oplossing die nodig is, afhankelijk van de aard van het monster een aantal aanpassingen kunnen vragen. Niettemin is het op eosin gebaseerde kleurings protocol geschikt voor het kleuren van hele organen, waardoor een microCT-beeldvorming met hoge resolutie van hele orgels mogelijk wordt. Krimp artefacten als gevolg van het oplosmiddel ethanol, die werd gebruikt om het monster vochtig te houden tijdens de microCT-metingen, werden niet waargenomen. Er zijn extra voorbereidingsstappen vereist voor nanoCT Imaging, die het mogelijk maakt om kleinere weefsel stukken uit het oorspronkelijke monster te onderzoeken. Met betrekking tot toekomstige histopathologische toepassingen zullen de overzichts scans waardevolle inzichten bieden in gewijzigde anatomische gebieden en structuren, die de bepaling van ROIs mogelijk maken, zoals aangetoond in Figuur 2a. Deze kunnen worden bestudeerd in 3D door microCT (Figuur 1c en Figuur 2b) of nanoct (Figuur 4b) en geëvalueerd in 2D met histologie (Figuur 3).
Een andere sterkte van het protocol is te zien in de volledige verenigbaarheid met histopathologie met betrekking tot de H & E-kleurings procedure. De toepassing van de op eosine gebaseerde kleurings procedure voor bulk monsters vormt geen belemmering voor verdere histologische onderzoeken (Figuur 3), ook al is de toegepaste eosine concentratie veel hoger in vergelijking met de histologische kleurings oplossing. Het segment van nanoct met een virtuele dikte van ongeveer 400 nm (Figuur 3a) vergelijkt al heel goed met het histologische gedeelte (Figuur 3c), dat is afgeleid van het overeenkomstige zachte weefselmonster. Gezien de geschatte dikte van een histologische sectie met 7-10 μm, maakt het genereren van projectie segmenten met minimale intensiteit van de nanoCT-gegevens (Figuur 3b), die overeenkomen met een virtuele dikte van ongeveer 7 μm, een betere vergelijking met de histologische sectie (Figuur 3c). Hier, de celkernen zijn duidelijk geopenbaard als niet-verzwaking gebied als eosine specifiek vlekken eiwitten en peptiden in de cel cytoplasma33.
De toepassing van verdere tegen kleuring met standaard histologische methoden is mogelijk, ook al is de volgorde van de kleuring vergeleken met de standaard histologische kleurings procedure omgekeerd. Beginnend met het ontwikkelde eosin-gebaseerde kleurings protocol voor CT, gevolgd door contra kleuring van die op eosin gebaseerde histologische secties met hematoxylin, zorgt voor volledige compatibiliteit en resulteert in een hoogwaardige kleuring die de verwachte vorm weergeeft van uiterlijk. De celkernen-specifieke kleuring met Mayer's zure hematoxyline werd toegepast op de histologische sectie waarin de celkernen in paars worden gemarkeerd (Figuur 3d). De toepassing van histologische tegen kleuring is momenteel beperkt tot de H-vlek. Andere standaard histologische contra-kleuringen zoals de basis van de periodieke acid Schiff, Elastica van Gieson of Gomori Silver moeten worden geëvalueerd en de compatibiliteit met immunohistologische technieken moet worden getest.
Het op eosin gebaseerde kleurings protocol zorgt voor (i) cel cytoplasma-specifieke targeting, (II) homogene en volledige kleuring, (III) eenvoudige uitvoering, (IV) snelle penetratie van het weefsel zonder het creëren van artefacten zoals diffusie ringen, (v) de kleuring van grote en dichte zachte weefselmonsters, en (VI) volledige compatibiliteit met histopathologie met betrekking tot de H & E vlek. Deze vereisten zijn belangrijk om te zorgen voor hoge resolutie X-Ray CT visualisatie van zachte weefsel naar cellulair niveau. In combinatie met de recentelijk ontwikkelde nanoct-apparaten12,36,37, niet-destructieve generatie van virtuele histologische segmenten die in contrast en resolutie vergelijkbaar zijn met conventionele histologische gegevens wordt mogelijk gemaakt. Deze gecombineerde aanpak zal de oprichting van X-Ray CT mogelijk maken als een waardevol hulpmiddel voor de 3D-visualisatie van microscopische weefselstructuren.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We danken Dr. Enken Drecoll voor histologische discussies en het zeer behulpzame team van Excillum AB, Zweden. We erkennen financiële steun via het DFG cluster of Excellence Munich Center for Advanced Photonics (MAP) en het DFG Gottfried Wilhelm Leibniz-programma. Bovendien heeft dit onderzoeksproject financiering ontvangen van het EU Horizon 2020-programma voor onderzoek en innovatie van de Marie Skłodowska-Curie-subsidieovereenkomst nr. H2020-MSCA-IF-2015-703745-CONSALT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50-ml centrifuge tube by Falcon | VWR | 734-0453 | |
| Formaldehyde solution, 37% | Carl Roth | CP10.2 | acid-free, stabilized with ~10% MeOH |
| Glacial acetic acid | Alfa Aesar | 36289.AP | |
| Eosin Y disodium salt | Sigma-Aldrich | E4382 | certified by Biological Stain Commission |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | L1825 | Dulbecco's formualtion, w/o calcium and magnesium |
| Sample Tubes by Nalgene | Carl Roth | ATK5.1 | |
| Rocking Shaker ST5 | CAT | 60281-0000 | |
| Cellulose tissue paper | VWR | 115-0600 | |
| Forceps, by USBECK Laborgeräte | VWR | 232-0096 | |
| Microcentrifuge tubes by Eppendorf | VWR | 211-2120 | safe-lock, 2.0 ml |
| Ethanol absolute by Baker Analyzed | VWR | 80252500 | |
| Disposable safety scalpel by Aesculap | VWR | AESCBA210 | |
| Petri dish by Sterilin | VWR | 391-2019 | |
| Plastic pasteur pipette | Carl Roth | EA68.1 | graduated, 1 ml |
| Desiccator by Duran | VWR | SCOT247826954 | |
| Silicone grease by Bayer | Sigma-Aldrich | 85404 | high-vacuum |
| Carbon dioxide cylinder with standpipe | Linde | 3700113 | 10 kg, short |
| micro-porous treatment capsule | PLANO GmbH | 4614 | pore size 78 µm (B) |
| Bal-Tec CPD 030 | Bal-Tec AG | CO2 as drying agent | |
| Stemi 2000-C stereomicroscope with KL 1500 LCD | Zeiss | this stereomicroscope has been updated(1) | |
| Zeiss Xradia Versa 500 | Zeiss | this microCT scanner has been updated(2) | |
| Avizo Fire 8.1 | Thermo Fisher Scientific | ||
| PILATUS detector as part of the nanoCT scanner | Dectris | single-photon counting detector(4,5); there are commercially availble nanoCT systems available (6,7) | |
| nanofocus X-ray source as part of the nanoCT scanner | Excillum | high-flux nanofocus X-ray transmission tube(3); there are commercially availble nanoCT systems available(6,7) | |
| (1) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS stereomicroscopes https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/Stereomikroskope/1006> (September 06, 2019). | |||
| (2) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS Xradia 510 Versa https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/zeiss-xradia-510-versa.html> (April 10, 2019). | |||
| (3) Nachtrab, F. et al. Development of a Timepix based detector for the NanoXCT project. Journal of Instrumentation 10 (11), C11009, (2015). | |||
| (4) Kraft, P. et al. Performance of single-photon-counting PILATUS detector modules. Journal of Synchrotron Radiation 16 (3), 368-375, (2009). | |||
| (5) Kraft, P. et al. Characterization and calibration of PILATUS detectors. IEEE Transactions on Nuclear Science 56 (3), 758-764, (2009). | |||
| (6) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS Xradia 810 Ultra https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/xradia-810-ultra.html> (April 9 2019). | |||
| (7) Company, G. E. GE product information: Phoenix nanotom m, https://www.gemeasurement.com/sites/gemc.dev/files/geit-31344en_nanotom_m_0517.pdf> (April 10, 2019). |
References
- Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. Theory and Practice of Histological Techniques. 7th edn. , Churchill Livingstone Elsevier. (2013).
- Chatterjee, S. Artefacts in histopathology. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 18 (4), 111-116 (2014).
- McInnes, E. Artefacts in histopathology. Comparative Clinical Pathology. 13 (3), 100-108 (2005).
- Andreasen, A., Drewes, A., Assentoft, J., Larsen, N. Computer-assisted alignment of standard serial sections without use of artificial land-marks. A practical approach to the utilization of incomplete information in 3-d reconstruction of the hippocampal region. Journal of Neuroscience Methods. 45 (3), 199-207 (1992).
- Braverman, M. S., Braverman, I. M. Three-dimensional reconstructions of objects from serial sections using a microcomputer graphics system. Journal of Investigative Dermatology. 86 (3), 290-294 (1986).
- Denk, W., Hortsmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).
- Mohun, T. J., Weninger, J. W. Imaging heart development using high-resolution episcopic microscopy. Current Opinion in Genetics and Development. 21, 573-578 (2011).
- Weninger, J. W., Meng, S., Streicher, J., Müller, G. B. A new episcopic method for rapid 3-d reconstruction: applications in anatomy and embryology. Anatomy and Embryology. 197 (5), 341-348 (1998).
- Odgaard, A., Andersen, K., Melsen, F., Gundersen, H. J. G. A Direct Method for Fast 3-Dimensional Serial Reconstruction. Journal of Microscopy. 159, 335-342 (1990).
- Müller, M., et al. Myoanatomy of the velevt worm leg revealed by labratory-based nanofocus X-ray source tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12378-12383 (2017).
- Salomon, M., Hanke, R., Krüger, P., Uhlmann, N., Voland, V. Realization of a computed tomography setup to achieve resolutions below 1 µm. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A. 591, 50-53 (2008).
- Tkachuk, A., et al. X-ray computed tomography in Zernike phase contrast mode at 8 keV with 50-nm resolution using Cu rotating anode X-ray source. Zeitschrift für Kristallographie. 222, 650-655 (2007).
- Withers, P. J. X-ray nanotomography. Materials Today. 10, 26-34 (2007).
- Jahn, H., et al. Evaluation of contrasting techniques for X-ray imaging of velvet worms (Onychophora). Journal of Microscopy. 270 (3), 343-358 (2018).
- Martins de S. e Silva, J., et al. Three-dimensional non-destructive soft-tissue visualization with X-ray staining micro-tomography. Scientific Reports. 5, 14088 (2015).
- Metscher, B. D. MicroCT for Developmental Biology: A Versatile Tool for High-Contrast 3D Imaging at Histological Resolutions. Developmental Dynamics. 238, 632-640 (2009).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
- Mitzutani, R., et al. X-Ray Microtomographic Imaging of Three-Dimensional Structure of Soft Tissues. Tissue Engineering Part C: Methods. 14 (4), 359-363 (2008).
- Pauwels, E., Loo, D. v, Cornillie, P., Brabant, L., Hoorebeke, L. v An exploratory study of contrast agents for soft tissue visualization by means of high resolution X-ray computed tomography imaging. Journal of Microscopy. 250, 21-31 (2013).
- Degenhardt, K., Wright, A. C., Horng, D., Padmanabhan, A., Epstein, J. A. Rapid 3D phenotyping of cardiovascular development in mouse embryos by micro-CT with iodine staining. Circulation: Cardiovascular Imaging. 3 (3), 314-322 (2010).
- Dullin, C., et al. μCT of ex-vivo stained mouse hearts and embryos enables a precise match between 3D virtual histology, classical histology and immunochemistry. PLOS ONE. 12 (2), 0170597 (2017).
- Jeffrey, N. S., Stephenson, R. S., Gallagher, J. A., Cox, P. Micro-computed tomography with iodine staining resolves the arrangement of muscle fibres. Journal of Biomechanics. 44, 189-192 (2011).
- Johnson, J. T., et al. Virtual Histology of Transgenic Mouse Embryos for High-Throughput Phenotyping. PLOS Genetics. 2, 61 (2006).
- Leszczyński, B., et al. Visualization and Quantitative 3D Analysis of Intraocular Melanoma and Its Vascularization in a Hamster Eye. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 332 (2018).
- Mizutani, R., Suzuki, Y. X-ray microtomography in biology. Mircon. 43, 104-115 (2012).
- Busse, M., et al. Three-dimensional virtual histology enabled through cytoplasm-specific X-ray stain for microscopic and nanoscopic computed tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2293-2298 (2018).
- Müller, M., et al. Non-destructive high-resolution 3D virtual histology enabled through a cell nucleus-specific stain for X-ray computed tomography. Scientific Reports. 8, 17855 (2018).
- Anderson, T. F. Techniques for the preservation of three-dimensional structure in preparing specimens for the electron microscope. Transactions of the New York Academy of Sciences. 13 (4), Series II 130-134 (1951).
- Bray, D. Supercritical Fluid Methods and Protocols. Methods in Biotechnology. Williams, J. R., Clifford, A. A. 13, Humana Press. 235-243 (2000).
- Lucy, L. B. An iterative technique for the rectification of observed distributions. The Astronomical Journal. 79, 745-765 (1974).
- Richardson, W. H. Bayesian-Based Iterative Method of Image Restoration. The Journal of the Optical Society of America. 62 (1), 55-59 (1972).
- Paganin, F., Mayo, S. C., Gureyev, T. E., Miller, P. R., Wilkins, S. W. Simultaneous phase and amplitude extraction from a single defocused image of a homogeneous object. Journal of Microscopy. 206, 33-40 (2002).
- Riedelsheimer, B., Büchl-Zimmermann, S. Mikroskopische Technik. Mulisch, M., Welsch, U. , Spektrum-Verlag GmbH. Berlin Heidelberg. Ch. 10 193-194 (2015).
- Hubbell, J. H., Seltzer, S. M. Tables of Xray mass attenuation coefficients and mass energy-absorption coefficients from 1 keV to 92 keV and 48 additional substances of dosimetric interest, Table 3. National Institute of Standards and Technology. , (1995).
- Hong, H. Y., Yoo, G. S., Choi, J. K. An Eosin Y Method for Protein Determination in Solution. Analytical Letters. 32 (12), 2427-2442 (1999).
- Dierick, M., et al. Recent Micro-CT Scanner Developments at UGCT. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B. 324, 35-40 (2014).
- Kastner, J., Plank, B., Heinzl, C. Advanced X computed tomography methods: High resolution CT, quantitative CT, 4DCT and phase contrast CT. Proceedings of Digital Industrial Radiology and Computed Tomography. , 120-132 (2015).
