Summary
Ett protokoll för 3D-visualisering av mikroskopiska vävnads strukturer med hjälp av en röntgen-specifik färgningsmetod avsedd för röntgendatortomografi presenteras.
Abstract
Vi visar en laboratoriebaserad metod som kombinerar röntgen-microCT och nanoCT med en specifik röntgen fläck, som riktar cellcytoplasman. Det beskrivna protokollet är lätt att applicera, snabbt och lämpligt för större mjukvävnads prov. Den presenterade metoden gör det möjligt att karakterisera viktiga vävnads strukturer i tre dimensioner och visas på en hel mus njure. Flerskalningsmetoden gör det möjligt att avbilda hela mus njure och stöder valet av ytterligare volymer av intresse, som förvärvas med högre upplösningar som sträcker sig in i nanometer Range. Därmed återges mjukvävnads morfologi med en liknande detaljnivå som motsvarande histologiska ljusmikroskopibilder. Djupare insikter i 3D-konfigurationen av vävnads strukturer uppnås utan att hindra ytterligare utredningar genom histologiska metoder.
Introduction
Fullständig karakterisering av mjukvävnads preparat kräver information om 3D-vävnadens mikrostruktur. Den nuvarande guldmynt normen för mjukvävnads provanalyser är histopatologi. Den vävnad och cellulära morfologi av preparatet utforskas i 2D inom utvalda områden av intresse (ROIs) med hjälp av optisk mikroskopi1. Den här metoden har dock flera nackdelar. Beredningen av provet är tidskrävande, komplicerat, destruktivt och benägna att artefakter. De producerade mikroskopiska bilderna ger endast 2D-information parallellt med snittnings planet. Ofta begränsas numrera av histologiska delar upp, som undersöks, på grund av tid begränsningar2,3.
Under de senaste åren har området 3D-histologi utvecklats. Här är virtuella vävnads skivor från alla önskade rumsliga plan tillgängliga. Detta möjliggör spårning av strukturer i hela provet, vilket leder till en djupare förståelse av 3D vävnad arkitektur och strukturella förändringar i samband med olika patologier. Olika metoder har utvecklats för att uppnå generering av 3D-volymdata. De sträcker sig från seriell-avsnitt baserade metoder, som använder antingen ljus eller elektronmikroskopi4,5,6,7,8, att blockera-Face Imaging metoder, såsom episkopisk 3D-avbildning eller block-Face scanning elektronmikroskopi7,8,9. Alla nämnda metoder inbegriper dock antingen snittning eller förstörelse provet fullständigt, vilket inte medger ytterligare utredningar. Den erhållna upplösningen är mycket beroende av snittningsprocessen är benägna att artefakter som beskrivs i konventionell histologi. Dessa metoder lider också från justerings artefakter.
3D röntgenbild teknik såsom mikroskopisk och nanoskopisk datortomografi (microCT och nanoCT) strävar efter att generera 3D-högupplösta data utan förstörelse av vävnadsprovet. Hittills har den svaga röntgen dämpningen kontrasten i mjuk vävnad och den begränsade tillgången till höga upplösningar i en laboratoriemiljö minskat deras användning för 3D-visualisering av mikroskopiska vävnads strukturer. De senaste framstegen mot laboratoriebaserad, högupplöst röntgen CT möjliggör upplösningar långt under 1 μm10,11,12,13.
Bristen på kontrast i mjuk vävnad i konventionell dämpning-baserade röntgenbilder kompenseras av färgning agenter, som förbättrar röntgen dämpningen kontrast. Färgämnen som är kända från andra avbildningstekniker såsom osmium tetroxid (OSO4), jod kaliumjodid (IKI) eller fosfotungstic syra (PTA) används ofta14,15,16,17, 18,19,20,21,22,23,24,25. Färgämnen som möjliggör (i) specifik biologisk inriktning, (II) homogen och fullständig färgning, (III) enkel hantering, (IV) snabb inträngning av vävnaden utan att skapa artefakter som diffusions ringar, (v) stor och tät vävnads färgning, och (vi) Full kompatibilitet med histopatologi krävs för att etablera röntgen CT som verktyg för 3D-visualisering av mikroskopiska vävnads strukturer. I detta arbete visar vi hur mjukvävnads prov förbereds för röntgen-CT-avbildning med en cytoplasman-specifik röntgen fläck baserad på eosin som uppfyller de krav som anges ovan26.
Metoden med flerskalig avbildning säkerställer bedömningen av infärgnings kvaliteten genom en översikt över Mikroct-mätningar och urvalet av intresse volymer (VOIs) för ytterligare utredningar med hög upplösning. Färgning kvalitet analyseras med fokus på färgning parametrar såsom (i) fullständighet, (II) utseende diffusions ringar, (III) kontrastförbättring, (IV) utseende av CT artefakter såsom streck och (v) homogenitet. Den laboratoriebaserade nanoct-installationen, som använder geometrisk förstoring för att nå upplösningar ner till 100 nm, visualiserar mjukvävnads morfologi på (sub)-cellulär nivå10,27. En jämförande analys av Nanult skivor med motsvarande histologiska ljusmikroskopi bilder bekräftar reproduktion av vävnads arkitektur med liknande detalj på en mikroskopisk nivå i 2D, vilket möjliggör histopatologisk karakterisering av vävnaden Prov. Detta detaljerade video protokoll är avsett att öka medvetenheten och belysa potentialen hos denna metod som icke-förstörande 3D mjuk vävnad imaging verktyg är av intresse för ett brett vetenskapligt samhälle som zoologer, biologer och hälsa Yrkesverksamma.
Protocol
Var försiktig: Se alla relevanta Materialsäkerhetsdatablad (MSDS) före användning. Flera av de kemikalier som används i protokollet är akut giftiga och cancerframkallande. Använd alla lämpliga säkerhetsmetoder när du utför infärgnings protokollet, inklusive användning av tekniska kontroller (draghuv, glovebox) och personlig skyddsutrustning (skyddsglasögon, handskar, labbrock, full längd byxor, skor med sluten tå).
Djur som används:
Djur huset utfördes vid Klinikum Rechts der Isar, Münchens tekniska universitet i enlighet med Europeiska unionens riktlinjer 2010/63. Organ avlägsnande godkändes av en intern djurskydds kommitté i Klinikum Rechts der Isar, München, Tyskland (internt referensnummer 4-005-09). Alla procedurer var i enlighet med relevanta riktlinjer och förordningar. Alla laboratorier inspekteras enligt OECD: s principer för god laboratoriesed.
1. eosin Färgnings protokoll
- För att fixera mjukvävnads prov, Fyll ett 50 mL centrifugeringsrör med en fixativ lösning som innehåller 9,5 mL 4% (v/v) formaldehydlösning (FA) och 0,5 mL isättika (AA).
Anmärkning: Förbered FA-lösningen från en 37% syra fri FA-lösning stabiliserad med cirka 10% metanol. Späd FA-lösningen vidare med Dulbecco ' s fosfatbuffrad saltlösning (DPBS). Välj DPBS utan kalcium och magnesium. Behåll den utspädda FA-lösningen längre än en månad. Under försurningen ändras pH-värdet för fixativ lösning från neutralt till cirka 3.
FÖRSIKTIGHET: eftersom FA är akut organ toxisk, frätande och cancerframkallande, är användningen av en draghuv obligatorisk och lämplig personlig skyddsutrustning måste användas.- Tillsätt det nyligen borttagna mjukvävnads provet till ett 50-mL centrifugerör och kylskåp 50-mL Centrifugera röret för 24-72h.
Obs: protokollet kan pausas här. - Tvätta mjukvävnads provet med DPBS-lösning för 1H.
- Tillsätt det nyligen borttagna mjukvävnads provet till ett 50-mL centrifugerör och kylskåp 50-mL Centrifugera röret för 24-72h.
- För att färga det fixerade mjukvävnads provet (t. ex. en hel mus njure), placera mjukvävnaden i 2 mL eosin Y-Färgnings lösning och inkubera provet i 24 timmar. Håll provet på en horisontell skakplatta för en slät gunga (ca. 60 rpm) under inkubationstiden Process.
Anmärkning: eosin Y-färgning lösning har en koncentration på 30% (w/v) i destillerat vatten. Välj volymen på infärgnings lösningen på ett sådant sätt att provet helt täcks av infärgnings lösningen och låt provet röra sig fritt i provbehållaren. Inkubationstiden kan variera för andra prover och måste justeras i enlighet med detta. - Efter färgning, ta försiktigt bort mjukvävnads provet från provbehållaren.
- Ta försiktigt bort överskott av färgämne med cellulosa vävnad papper.
- Placera mjukvävnads provet i en konisk provbehållare över en etanol ångfas för lagring och vidare användning.
Anmärkning: den koniska provbehållaren måste alltid innehålla några droppar 70% (v/v) etanol i botten av röret för att hålla mjukvävnads provet fuktig och förhindra artefakter.
2. röntgen microCT Imaging
Anmärkning: röntgen Mikroct mätningar utfördes med en microCT scanner, som erbjuder översikt CT mätningar (förmågan att avbilda hela provet inom synfältet (FOV)) och utförandet av högupplöst CT mätningar (förmågan att fokusera på en önskad volym av intresse (VOI) av samma prov) ner till 1 μm.
- Montera mjukvävnads provet på en lämplig provhållare. Se till att provet sitter tätt på provhållaren för att förhindra att provet rör sig under röntgen CT-mätningarna.
- När det gäller den färgade musen njure: Förbered en provhållare med två centrifugrör, varvid botten av ett rör skärs av. Limma de två centrifugrör tillsammans med två-komponentslim. Säkerställ en rak justering av centrifugrör runt rotationsaxeln. Vänta tills limmet stelnar.
- När provhållaren är klar för användning, överför musens njure till intakt centrifug röret, som rymmer några droppar 70% (v/v) etanol i botten av röret.
Anm.: provets stabilitet är avgörande. Ta dig tid att förbereda provet för röntgen CT mätningar. Mjukvävnads provet hålls över en etanol ångfas för att hålla provet fuktigt under röntgen CT mätningar och förhindra mjukvävnads provet från krympning och andra artefakter. Mjukvävnads provet bör inte vara i kontakt med lösningsmedlet för att undanröja ansamling av lösningsmedlet runt provet under röntgen CT mätning, vilket kan leda till prov förflyttning under mätningen eller kan orsaka problem under återuppbyggnaden. Om provhållaren inte tillåter att man håller lösningsmedel i botten, kan ett cellulosa papper som fuktats med 70% (v/v) etanol placeras i provhållaren. Det bör noteras att krympning artefakter på grund av lösningsmedels etanol observerades inte.
Obs: protokollet kan pausas här.
- Efter noggrann justering av provet väljer du anskaffnings parametrar för bästa bildkvalitet. I händelse av den presenterade microCT data, förvärva skanningen vid en topp spänning på 50 kV, en ström av 3,5 W med 1601 projektioner jämnt fördelade över 360 °.
Obs: förvärvs parametrarna för översikts-datortomografi valdes för bästa bildkvalitet. Som sådan valdes målet för 0.39 x kamera till att omfatta hela urvalet inom synfältet (FOV). Detta resulterade i en effektiv pixelstorlek på 12 μm. Exponeringstiden för 2 s per projektion gav en bra signal-brus-förhållande. ROI för högupplöst datortomografi identifierades med hjälp av microCT data från översikts skanningen. MicroCT skannrar innehåller ofta ett integrerat program verktyg, vilket gör det möjligt att exakt välja den fastställda avkastningen. För högupplöst CT-data valdes 4x-kamerans mål vilket resulterade i en effektiv pixelstorlek på 3,3 μm. Här behövdes en exponeringstid på 15 s per projektion.
Obs: protokollet kan pausas här. - Efter förvärvet av röntgen CT data, bearbeta projektionerna därefter för rekonstruktion av 3D-volymen. I händelse av den presenterade microCT data: rekonstruera röntgen CT data med integrerad programvara.
Anmärkning: volymens renderingar av Mikroct-data som visas i figur 1 och figur 2 har genererats med hjälp av en visualiseringsprogramvara.
Obs: protokollet kan pausas här.
3. röntgen nanoCT Imaging
Anmärkning: X-ray nanoCT Scanner har utvecklats inhouse. Linsen fria instrumentet är utrustad med en nanofocus röntgenkälla och en enda Photon räknar detektor. 3D-data med upplösningar ner till 100 nm kan genereras10. Generellt, Nanult system inklusive de med röntgen optik är kommersiellt tillgängliga och inte begränsat till den beskrivna nanoCT scanner.
- NanoCT provberedning
- Bered VOIs av mjukvävnads provet. Skär mjuk vävnad i mycket små bitar av ca 0,5 mm kantlängd med hjälp av en skalpell och ett stereomikroskop. I händelse av musen njure: skär mus njure i två halvor längs den längsta axeln. Ta ena halvan av mus njure och förbereda olika anatomiska regioner såsom njurcortex och renal medulla.
Anmärkning: den andra halvera av musens njure överfördes till histopatologi, där provet bäddades in i paraffin och behandlades därefter för att ge de typiska histologiska avsnitten som ses i figur 3c och figur 3d . - Överför de små bitarna innan det första dehydratiseringstest till en ny petriskål, där de återstår för alla efterföljande steg.
- Torka proverna med koncentrationer (alla v/v) i%: 50, 60, 70, 80, 90, 96 och 100 etanol som är balanserat med destillerat vatten. Utför varje uttorkning steg för 1 h vardera.
Obs: protokollet kan pausas här. Håll de små vävnads bitarna i 100% etanol över natten. - Kritisk punkt torr (CPD) de små vävnad bitar.
Anmärkning: tillämpningen av CPD möjliggör fullständig uttorkning av vävnadsprovet genom att utbyta lösningsmedlet (här etanol) med torkmedlet (här CO2). Detta har varit nödvändigt för att säkerställa att provet kan monteras på prov innehavarna i nanoCT, inte rör sig under mätningen och kan placeras mycket nära röntgenkällan för att möjliggöra bästa geometriska förstoring. NanoCT-installationen är baserad på enbart geometrisk förstoring, med förstoringsfaktorn definierad som avståndet mellan källan och detektorn över avståndet mellan källan och provet. Torknings tekniken introducerades först av Anderson för att bevara 3D-strukturen hos biologiska preparat för elektronmikroskopi28. En översikt av tekniken ges av Bray29.- Förfyll vakuumkammaren med 100% etanol. Överför små Vävnadsdelar till en mikro-porös kapsel och placera den i vakuumkammaren av CPD. Stäng systemet.
Obs: eftersom högt tryck är involverat i CPD-processen, se till att alla delar av CPD, särskilt beslag, är intakta och att systemet är ordentligt stängt. - Kyl kammaren till 6-8 ° c och fyll på med Liquid CO2.
- Under omrörning, vänta 3 min för att möjliggöra korrekt blandning av de två komponenterna. Dränera kammaren noggrant. Se till att provhållaren fortfarande är täckt med spädningsvätska. Upprepa detta steg tio gånger för att tillåta fullständig ersättning av etanol med CO2 inom provet.
- Efter den slutliga fyllningen av kammaren med CO2, värm maskinen till den kritiska punkten av co2 (31 ° c och 73.8 bar) följt av mycket långsam frisättning av gasformiga Co2 över en tid av 30 min.
Anmärkning: frisläppandet av gasen bör ske mycket långsamt, eftersom kondensvatten på annat sätt kan bildas på provet. Se till att temperaturen inte sjunker under den kritiska punkten i CO2. Öppna bara CPD-maskinen när allt tryck har släppts från systemet. - Ta snabbt bort CPD-vävnadsbitarna från maskinen och förvara dem i en ny petriskål som lagrats i en exsickator innan den används vidare.
Obs: protokollet kan pausas här.
- Förfyll vakuumkammaren med 100% etanol. Överför små Vävnadsdelar till en mikro-porös kapsel och placera den i vakuumkammaren av CPD. Stäng systemet.
- Bered VOIs av mjukvävnads provet. Skär mjuk vävnad i mycket små bitar av ca 0,5 mm kantlängd med hjälp av en skalpell och ett stereomikroskop. I händelse av musen njure: skär mus njure i två halvor längs den längsta axeln. Ta ena halvan av mus njure och förbereda olika anatomiska regioner såsom njurcortex och renal medulla.
- Montera CPD-vävnaderna i en lämplig provhållare. Se till att provet sitter tätt på provhållaren för att förhindra att provet rör sig under CT-mätningarna. I fråga om CPD mus njure vävnad bitar: lim vävnaden bitar med superlim till en provhållare.
Obs: alla oönskade rörelser av provet under CT mätningar kan orsaka problem under volym rekonstruktion-särskilt när förvärva en datamängd med nanometer Voxel storlek.
Obs: protokollet kan pausas här. - Efter noggrann justering av provet väljer du anskaffnings parametrar för bästa bildkvalitet. När det gäller de presenterade nanoCT-data: förvärva projektioner vid en topp spänning på 60 kV med 1599 projektioner jämnt fördelade över 360 ° och en Voxel storlek på cirka 400 nm.
Anmärkning: en enda CT mätning förvärvas vid 400 nm Voxel storlek har en FOV på 75 μm i riktning mot rotationsaxeln (vertikal) och cirka 560 μm i riktning vinkelrätt mot rotationsaxeln (horisontell). För att undersöka större volymer kan en utökning av FOV längs rotationsaxeln uppnås genom att kombinera flera skanningar vid olika vertikala positioner. Dessutom kan lokala tomografi-skanningar utföras för att mäta prover med en större prov diameter vinkelrätt mot rotationsaxeln än vad som anges av FOV för en global datortomografi. NanoCT-data förvärvades med en exponeringstid på 4 s per projektion. Som sådan var den sammanlagda förvärvs tiden per datauppsättning cirka 3,5 h.
Obs: protokollet kan pausas här. - Efter förvärvet av CT-data, bearbeta projektionerna därefter för rekonstruktion av 3D-volymen.
- När det gäller de presenterade nanoCT-data normalisera de förvärvade projektionerna med flatfield images. Förbättra skärpan i prognoserna med hjälp av en Richardson-Lucy deconvolution algoritm30,31. Använd en rotationsformade symmetrisk Gaussisk funktion med en standardavvikelse på en pixel som deconvolution kernel.
- Använd Paganin ' s fas-återhämtningsalgoritm till de vässade bilderna för att öka mjukvävnads kontrasten. Ställ in parametrarna för algoritmen för att optimera bildkvaliteten32. Rekonstruera de förbehandlade projektionerna med en State-of-the-art filtrerad backprojection algoritm.
Anm.: i figur 3 utvärderas erhållna nanult-data med motsvarande histologiska avsnitt, vilka var cirka 7 μm tjocka. Därför genererades minimiprojektionsskivor av 18 intilliggande Nanult-skivor med en virtuell tjocklek på cirka 7 μm genom att beräkna minimivärdet för varje pixel i de relevanta sektorerna. En visualiseringsprogramvara användes för att återge volymen av nanoCT-data, som visas i figur 4.
Representative Results
Bild 1 visar CT skivor och volym återgivning av lågupplöst MicroCT data belyser kontrastförbättring efter färgning. Figur 2 visar CT skivor och volym rendering av högupplösta MicroCT data som härrör från en lokal tomografi av hela mus njure. Figur 3 visar CT skivor av nanult data i jämförelse med motsvarande histologiska avsnitt. Figur 4 visar CT-skiva och volym återgivning av nanoct-data som belyser strukturella Detaljer på cellnivå. Mikroct-mätningen med låg upplösning möjliggör en överblick över hela orgeln och hjälper till att identifiera volymer av intresse (VOIs) för högupplöst Mikroct-mätning. Genom detta flerskaliga tillvägagångssätt bestäms VOI för Nanult. NanoCT möjliggör en mycket detaljerad bild av mjukvävnads provet på cellnivå. Den jämförande studien med motsvarande histologisk sektion belyser full kompatibilitet med histopatologi. Här bekräftar den multimodala avbildnings metoden de resultat som erhålls med båda modaliteterna.
Figur 1. CT-skivor och volym återgivning av Mikroct-data med låg upplösning. (a, b) Översikt bilder av samma mus njure före och efter färgning, respektive, belysa kontrasten förbättring erhålls efter applicering av eosin-baserade färgning protokoll. Båda microCT-datauppsättningarna förvärvades med identiska förvärvs parametrar. Voxel-storleken i båda datauppsättningarna är 12 μm. Den kontrastförstärkning som uppnåtts ib) möjliggör identifiering av följande anatomiska struktur regioner: Cortex (i), yttre MEDULLA (II) med ytterligare åtskillnad i yttre ränder av yttre medulla (IIA) och inre ränder av yttre medulla (IIB), inre medulla (III), papilla (IV) och njurbäckenet (V). (c) volym återgivning av MicroCT data som visar en virtuell sagittal avsnitt genom hela mus njure. Denna siffra har modifierats från Busse och Müller et al.26vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. CT-skiva och volym återgivning av högupplösta microCT-data som härrör från samma mus njure efter applicering av det utvecklade eosinbaserade färg protokollet. (a) det vänstra hörnet visar översikten MicroCT bild belysa ROI (blå rutan) för den visade högupplöst bild. Följande anatomiska strukturella regioner är identifierbara: Cortex (I), yttre medulla (II) med ytterligare distinktion i yttre ränder av yttre medulla (IIa) och inre ränder av yttre medulla (IIb), inre medulla (III), mindre Calyx (IV) och fartyg (V och VI). b) volym av ränterendering av de högupplösta MicroCT-data som erhållits med en Voxel-storlek på 3,3 μm. Den medulla regionen och en virtuell sektion genom ett fartyg som härrör från en lokal tomografi av hela njuren visas. Denna siffra har modifierats från Busse och Müller et al.26. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. CT skivor av Nanult data (a, b) i jämförelse med de histologiska avsnitten (c, d) härrör från samma mus njure efter applicering av det utvecklade eosin-baserade färgning protokoll. a) nanult-bilden av samma mus njure prov efter färgning, dissekera och CPD visar detaljerade strukturer i regionen (IIB) som ses i figur 1 och figur 2. Dessa kallas tjocka stigande extremiteter i slingan av Henle. bminsta projektionsskiva för intensitet som härrör från samma datamängd i nanoct som visasi a meden virtuell segment tjock lek på cirka 7 μm, vilket möjliggör en tydlig visualisering av cellkärnan. c) representativ histologisk sektion som uppvisar tjocka uppstigande extremiteter i Henle-slingan med tydlig visualisering av cellkärnor och borst kant. Den histologiska delen har en ungefärlig tjocklek av 7 μm och erhölls från samma mus njure provet efter den applicerade eosin-baserade färgning och inbäddning i ett paraffinblock. drepresentativ histologisk sektion med applicering av motfläcken hematoxylin som belyser cellkärnan i lila. Beredning av den histologiska sektionen nära den sektion som visas i (c) med ungefärlig tjocklek av 7 μm. Denna siffra har modifierats från Busse och Müller et al.26vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. CT-skiva och volym återgivning av Nanult-data. ananult-bilden av samma mus njure prov som visar de strukturer som kallas tjocka stigande extremiteter i slingan av Henle. Detta är en detaljerad vy av region (IIb) sett i figur 1 och figur 2 förvärvas från en liten bit av njuren med en Voxel storlek på cirka 400 nm. Beredningen av provet involverade färgning, dissekering och CPD.bvolym återgivning av nanoct-data som visualiserar 3D-strukturen hos tjocka uppstigande extremiteter i Henle-slingorna. Denna siffra har modifierats från Busse och Müller et al.26vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
För närvarande, eosin används som standard histologiskt protokoll för att märka cellens cytoplasma. Färgämnet appliceras som en 0,1% (w/v) vattenlösning på mikroskopiska skivor av mjuk vävnad (vanligtvis skuren med en tjocklek av 2-10 μm)33. Tillämpningen av denna standardiserade histologiska protokoll till 3D vävnadsprover såsom en hel mus njure inte resulterar i en dämpning kontrast förstärkt CT bild. Å ena sidan kan detta tillskrivas den låga inneboende dämpning egenskaper av mjuk vävnad för vanligtvis används röntgen energi av laboratoriebaserade microCT system. Vanligtvis är mjuk vävnad består av främst kol, väte, syre och kväve34, och därför inte leder till kontrastförbättring. Å andra sidan var den låga koncentrationen av eosin som användes för färgning den begränsande faktorn. Även om en eosin molekyl har fyra bromid atomer (hög atomnummer element bromin med Z = 3534), de känslighetsnivåer som krävs för röntgen CT Imaging var inte uppfyllda.
För att övervinna denna utmaning med låg dämpningen kontrast, flera koncentrationer av eosin undersöktes. En begränsning är här den maximala lösligheten av eosin i vatten, som är 30% (w/v) i en vattenlösning. Bästa dämpning kontrastförbättring inom mjuk vävnad observerades med den högsta eosin koncentrationen, som förväntades enligt Lambert-öllag. Därför genomfördes det slutliga Färgnings protokollet med den högsta koncentrationen.
Frågan hur man förbereder mjuk vävnad optimalt på molekylär nivå för färgning förfarande för att ytterligare förbättra kontrastförbättring besvarades av pH-justering. Här konstaterades försurning av mjukvävnads provet under fixering eller före färgning vara avgörande. Detta visades också av Hong et al.35. Den högre ackumuleringen av färgning agent inom cellens cytoplasma av syran uppnåddes genom förbättrade Joniska interaktioner, som var ett resultat av protonering av aminosyran sidokedjor av proteiner och peptider som finns inom cellens cytoplasma. Ett representativt resultat som belyser kontrast förbättringen jämfört med ett omålat mjukvävnads prov visas i figur 1a, b. Här, en strukturell översikt av en hel mus njure visualisera avgörande anatomiska regioner såsom cortex, medulla, papilla och njurbäckenet uppnåddes.
Det presenterade färg protokollet är enkelt att applicera och innehåller bara tre steg. De reagenser som krävs är lättillgängliga. Den totala infärgnings tiden på 24 timmar är snabb för en hel-organfärgning, vilket möjliggör 3D-visualisering av mjukvävnads prov (figur 1c, figur 2b och figur 4b) i laboratoriemiljö vid flera skalor ner till cellnivå. Det bör noteras att den totala infärgnings tiden och volymen av den infärgnings lösning som behövs kan begära vissa anpassningar beroende på typ av prov. Icke desto mindre lämpar sig eosinbaserade infärgnings protokollet för hel-organfärgning, som sedan möjliggör högupplöst Mikroct-avbildning av hela organ. Shrinkage artefakter på grund av lösningsmedels etanol, som användes för att hålla provet fuktigt under microCT mätningar, observerades inte. Ytterligare förberedelsesteg krävs för nanoCT Imaging, vilket möjliggör utredning av mindre Vävnadsdelar som hämtats från det ursprungliga provet. Med avseende på framtida histopatologiska tillämpningar kommer översikts skanningar att ge värdefulla insikter i förändrade anatomiska regioner och strukturer, vilket möjliggör bestämning av ROIs som visas i figur 2a. Dessa kan studeras i 3D av microCT (figur1c och figur 2b) eller nanult (figur 4b) och utvärderas i 2D med histologi (figur 3).
En annan styrka av protokollet ses i Full förenlighet med histopatologi med avseende på H & E färgning förfarande. Tillämpningen av det eosinbaserade infärgnings förfarandet på bulkprover hindrar inte ytterligare histologiska undersökningar (figur 3), även om den tillämpade eosinkoncentrationen är mycket högre jämfört med den histologiska infärgnings lösningen. Den nanult slice med en virtuell tjocklek på cirka 400 nm (figur 3a) jämför redan mycket väl med den histologiska avsnitt (figur 3c), som härrör från motsvarande mjuk vävnad provet. Med tanke på den ungefärliga tjockleken på en histologisk sektion med 7-10 μm, möjliggör generering av minimibildprojektions skivor av Nanult-data (figur 3b), som motsvarar en virtuell tjocklek av cirka 7 μm, för en bättre jämförelse med histologisk sektion (figur 3c). Här är cellkärnan tydligt avslöjas som icke-dämpande område som eosin specifikt fläckar proteiner och peptider i cellens cytoplasma33.
Tillämpningen av ytterligare motverka färgning med standard histologiska metoder är möjligt, även om ordningen på färgning jämfört med standard histologisk färgning förfarande var omvänd. Börjar först med den utvecklade eosin-baserade färgning protokoll för CT, följt av motverka färgning av de eosin-baserade histologiska avsnitt med hematoxylin, möjliggör full kompatibilitet och resulterar i en högkvalitativ färgning visar den förväntade formen av utseende. Cellen kärnor-specifik färgning med Mayers sura hematoxylin applicerades på den histologiska delen som belyser cellkärnan i lila (figur 3d). Tillämpningen av histologisk räknare färgning är för närvarande begränsad till H-fläcken. Andra standard histologiska Counter Infärgningar såsom periodiska acid Schiff bas, Elastica van Gieson eller Gomori silver måste utvärderas samt kompatibiliteten med immunohistokologiska tekniker måste testas.
Den eosin-baserade färgning protokollet möjliggör (i) cell cytoplasma-specifik inriktning, (II) homogen och fullständig färgning, (III) enkel implementering, (IV) snabb penetration av vävnaden utan att skapa artefakter såsom diffusions ringar, (v) färgning av stora och täta mjukvävnads prov, och vi) fullständig kompatibilitet med histopatologi med avseende på H & E-fläcken. Dessa krav är viktiga för att möjliggöra högupplöst röntgen CT visualisering av mjuk vävnad ner till cellnivå. I kombination med de nyligen utvecklade nanoct-apparaterna12,36,37, icke-förstörande generering av virtuella histologiska segment som är jämförbara i kontrast och upplösning till konventionella histologiska data är möjlig. Detta kombinerade tillvägagångssätt kommer att möjliggöra inrättandet av röntgen CT som ett värdefullt verktyg för 3D-visualisering av mikroskopiska vävnads strukturer.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Enken Drecoll för histologiska diskussioner och det oerhört hjälpsamma teamet på Excillum AB, Sverige. Vi erkänner finansiellt stöd genom DFG Cluster of Excellence München Center for Advanced Photonics (karta) och DFG Gottfried Wilhelm Leibniz program. Vidare har detta forskningsprojekt erhållit finansiering från Europeiska unionens Horisont 2020 forsknings-och innovationsprogram inom ramen för Marie Skłodowska-Curie Grant Agreement No. HORISONT 2020-MSCA-IF-2015-703745-CONSALT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50-ml centrifuge tube by Falcon | VWR | 734-0453 | |
| Formaldehyde solution, 37% | Carl Roth | CP10.2 | acid-free, stabilized with ~10% MeOH |
| Glacial acetic acid | Alfa Aesar | 36289.AP | |
| Eosin Y disodium salt | Sigma-Aldrich | E4382 | certified by Biological Stain Commission |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | L1825 | Dulbecco's formualtion, w/o calcium and magnesium |
| Sample Tubes by Nalgene | Carl Roth | ATK5.1 | |
| Rocking Shaker ST5 | CAT | 60281-0000 | |
| Cellulose tissue paper | VWR | 115-0600 | |
| Forceps, by USBECK Laborgeräte | VWR | 232-0096 | |
| Microcentrifuge tubes by Eppendorf | VWR | 211-2120 | safe-lock, 2.0 ml |
| Ethanol absolute by Baker Analyzed | VWR | 80252500 | |
| Disposable safety scalpel by Aesculap | VWR | AESCBA210 | |
| Petri dish by Sterilin | VWR | 391-2019 | |
| Plastic pasteur pipette | Carl Roth | EA68.1 | graduated, 1 ml |
| Desiccator by Duran | VWR | SCOT247826954 | |
| Silicone grease by Bayer | Sigma-Aldrich | 85404 | high-vacuum |
| Carbon dioxide cylinder with standpipe | Linde | 3700113 | 10 kg, short |
| micro-porous treatment capsule | PLANO GmbH | 4614 | pore size 78 µm (B) |
| Bal-Tec CPD 030 | Bal-Tec AG | CO2 as drying agent | |
| Stemi 2000-C stereomicroscope with KL 1500 LCD | Zeiss | this stereomicroscope has been updated(1) | |
| Zeiss Xradia Versa 500 | Zeiss | this microCT scanner has been updated(2) | |
| Avizo Fire 8.1 | Thermo Fisher Scientific | ||
| PILATUS detector as part of the nanoCT scanner | Dectris | single-photon counting detector(4,5); there are commercially availble nanoCT systems available (6,7) | |
| nanofocus X-ray source as part of the nanoCT scanner | Excillum | high-flux nanofocus X-ray transmission tube(3); there are commercially availble nanoCT systems available(6,7) | |
| (1) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS stereomicroscopes https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/Stereomikroskope/1006> (September 06, 2019). | |||
| (2) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS Xradia 510 Versa https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/zeiss-xradia-510-versa.html> (April 10, 2019). | |||
| (3) Nachtrab, F. et al. Development of a Timepix based detector for the NanoXCT project. Journal of Instrumentation 10 (11), C11009, (2015). | |||
| (4) Kraft, P. et al. Performance of single-photon-counting PILATUS detector modules. Journal of Synchrotron Radiation 16 (3), 368-375, (2009). | |||
| (5) Kraft, P. et al. Characterization and calibration of PILATUS detectors. IEEE Transactions on Nuclear Science 56 (3), 758-764, (2009). | |||
| (6) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS Xradia 810 Ultra https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/xradia-810-ultra.html> (April 9 2019). | |||
| (7) Company, G. E. GE product information: Phoenix nanotom m, https://www.gemeasurement.com/sites/gemc.dev/files/geit-31344en_nanotom_m_0517.pdf> (April 10, 2019). |
References
- Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. Theory and Practice of Histological Techniques. 7th edn. , Churchill Livingstone Elsevier. (2013).
- Chatterjee, S. Artefacts in histopathology. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 18 (4), 111-116 (2014).
- McInnes, E. Artefacts in histopathology. Comparative Clinical Pathology. 13 (3), 100-108 (2005).
- Andreasen, A., Drewes, A., Assentoft, J., Larsen, N. Computer-assisted alignment of standard serial sections without use of artificial land-marks. A practical approach to the utilization of incomplete information in 3-d reconstruction of the hippocampal region. Journal of Neuroscience Methods. 45 (3), 199-207 (1992).
- Braverman, M. S., Braverman, I. M. Three-dimensional reconstructions of objects from serial sections using a microcomputer graphics system. Journal of Investigative Dermatology. 86 (3), 290-294 (1986).
- Denk, W., Hortsmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).
- Mohun, T. J., Weninger, J. W. Imaging heart development using high-resolution episcopic microscopy. Current Opinion in Genetics and Development. 21, 573-578 (2011).
- Weninger, J. W., Meng, S., Streicher, J., Müller, G. B. A new episcopic method for rapid 3-d reconstruction: applications in anatomy and embryology. Anatomy and Embryology. 197 (5), 341-348 (1998).
- Odgaard, A., Andersen, K., Melsen, F., Gundersen, H. J. G. A Direct Method for Fast 3-Dimensional Serial Reconstruction. Journal of Microscopy. 159, 335-342 (1990).
- Müller, M., et al. Myoanatomy of the velevt worm leg revealed by labratory-based nanofocus X-ray source tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12378-12383 (2017).
- Salomon, M., Hanke, R., Krüger, P., Uhlmann, N., Voland, V. Realization of a computed tomography setup to achieve resolutions below 1 µm. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A. 591, 50-53 (2008).
- Tkachuk, A., et al. X-ray computed tomography in Zernike phase contrast mode at 8 keV with 50-nm resolution using Cu rotating anode X-ray source. Zeitschrift für Kristallographie. 222, 650-655 (2007).
- Withers, P. J. X-ray nanotomography. Materials Today. 10, 26-34 (2007).
- Jahn, H., et al. Evaluation of contrasting techniques for X-ray imaging of velvet worms (Onychophora). Journal of Microscopy. 270 (3), 343-358 (2018).
- Martins de S. e Silva, J., et al. Three-dimensional non-destructive soft-tissue visualization with X-ray staining micro-tomography. Scientific Reports. 5, 14088 (2015).
- Metscher, B. D. MicroCT for Developmental Biology: A Versatile Tool for High-Contrast 3D Imaging at Histological Resolutions. Developmental Dynamics. 238, 632-640 (2009).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
- Mitzutani, R., et al. X-Ray Microtomographic Imaging of Three-Dimensional Structure of Soft Tissues. Tissue Engineering Part C: Methods. 14 (4), 359-363 (2008).
- Pauwels, E., Loo, D. v, Cornillie, P., Brabant, L., Hoorebeke, L. v An exploratory study of contrast agents for soft tissue visualization by means of high resolution X-ray computed tomography imaging. Journal of Microscopy. 250, 21-31 (2013).
- Degenhardt, K., Wright, A. C., Horng, D., Padmanabhan, A., Epstein, J. A. Rapid 3D phenotyping of cardiovascular development in mouse embryos by micro-CT with iodine staining. Circulation: Cardiovascular Imaging. 3 (3), 314-322 (2010).
- Dullin, C., et al. μCT of ex-vivo stained mouse hearts and embryos enables a precise match between 3D virtual histology, classical histology and immunochemistry. PLOS ONE. 12 (2), 0170597 (2017).
- Jeffrey, N. S., Stephenson, R. S., Gallagher, J. A., Cox, P. Micro-computed tomography with iodine staining resolves the arrangement of muscle fibres. Journal of Biomechanics. 44, 189-192 (2011).
- Johnson, J. T., et al. Virtual Histology of Transgenic Mouse Embryos for High-Throughput Phenotyping. PLOS Genetics. 2, 61 (2006).
- Leszczyński, B., et al. Visualization and Quantitative 3D Analysis of Intraocular Melanoma and Its Vascularization in a Hamster Eye. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 332 (2018).
- Mizutani, R., Suzuki, Y. X-ray microtomography in biology. Mircon. 43, 104-115 (2012).
- Busse, M., et al. Three-dimensional virtual histology enabled through cytoplasm-specific X-ray stain for microscopic and nanoscopic computed tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2293-2298 (2018).
- Müller, M., et al. Non-destructive high-resolution 3D virtual histology enabled through a cell nucleus-specific stain for X-ray computed tomography. Scientific Reports. 8, 17855 (2018).
- Anderson, T. F. Techniques for the preservation of three-dimensional structure in preparing specimens for the electron microscope. Transactions of the New York Academy of Sciences. 13 (4), Series II 130-134 (1951).
- Bray, D. Supercritical Fluid Methods and Protocols. Methods in Biotechnology. Williams, J. R., Clifford, A. A. 13, Humana Press. 235-243 (2000).
- Lucy, L. B. An iterative technique for the rectification of observed distributions. The Astronomical Journal. 79, 745-765 (1974).
- Richardson, W. H. Bayesian-Based Iterative Method of Image Restoration. The Journal of the Optical Society of America. 62 (1), 55-59 (1972).
- Paganin, F., Mayo, S. C., Gureyev, T. E., Miller, P. R., Wilkins, S. W. Simultaneous phase and amplitude extraction from a single defocused image of a homogeneous object. Journal of Microscopy. 206, 33-40 (2002).
- Riedelsheimer, B., Büchl-Zimmermann, S. Mikroskopische Technik. Mulisch, M., Welsch, U. , Spektrum-Verlag GmbH. Berlin Heidelberg. Ch. 10 193-194 (2015).
- Hubbell, J. H., Seltzer, S. M. Tables of Xray mass attenuation coefficients and mass energy-absorption coefficients from 1 keV to 92 keV and 48 additional substances of dosimetric interest, Table 3. National Institute of Standards and Technology. , (1995).
- Hong, H. Y., Yoo, G. S., Choi, J. K. An Eosin Y Method for Protein Determination in Solution. Analytical Letters. 32 (12), 2427-2442 (1999).
- Dierick, M., et al. Recent Micro-CT Scanner Developments at UGCT. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B. 324, 35-40 (2014).
- Kastner, J., Plank, B., Heinzl, C. Advanced X computed tomography methods: High resolution CT, quantitative CT, 4DCT and phase contrast CT. Proceedings of Digital Industrial Radiology and Computed Tomography. , 120-132 (2015).
