Summary
X-ışını bilgisayarlı tomografisi için tasarlanmış x-ışınına özgü boyama yöntemi kullanılarak mikroskobik doku yapılarının 3boyutlu görüntülenmesi için bir protokol sunulmuştur.
Abstract
X-ışını mikroCT ve nanoCT ile hücre sitoplazmasını hedefleyen belirli bir X-ışını lekesi birleştiren laboratuvar tabanlı bir yöntem gösteriyoruz. Açıklanan protokolün uygulanması kolay, hızlı ve daha büyük yumuşak doku örnekleri için uygundur. Sunulan metodoloji, önemli doku yapılarının üç boyutlu olarak karakterizasyonunu sağlar ve tüm fare böbreği üzerinde gösterilmiştir. Çok ölçekli yaklaşım tüm fare böbreğinin görüntülenmesine olanak tanır ve nanometre aralığına kadar daha yüksek çözünürlüklerle elde edilen daha fazla ilgi hacminin seçilmesini destekler. Böylelikle, ilgili histolojik ışık mikroskobu görüntüleri gibi benzer bir detay düzeyine sahip yumuşak doku morfolojisi çoğaltılır. Doku yapılarının 3Boyutlu konfigürasyonuna dair daha derin kavrayışlar histolojik yöntemlerle daha fazla araştırmaya engel olmadan elde edilir.
Introduction
Yumuşak doku örneklerinin tam karakterizasyonu 3D doku mikroyapısı hakkında bilgi gerektirir. Yumuşak doku örnek analizleri için geçerli altın standart histopatolojidir. Numunenin doku ve hücresel morfolojisi optik mikroskopi1kullanılarak seçilen ilgi bölgelerinde (ROI) 2Boyutlu olarak incelenir. Ancak bu yöntemin çeşitli dezavantajları vardır. Örneğin hazırlanması zaman alıcı, karmaşık, yıkıcı ve eserlere yatkındır. Üretilen mikroskobik slaytlar kesit düzlemine paralel olarak sadece 2B bilgi sağlar. Genellikle incelenen histolojik bölümlerin sayısı, zaman kısıtlamaları nedeniyle sınırlıdır2,3.
Son yıllarda, 3D histoloji alanı gelişti. Burada, istenilen herhangi bir mekansal düzlemden sanal doku dilimleri erişilebilir. Bu, 3D doku mimarisi ve farklı patolojiler ile ilişkili yapısal değişiklikler daha derin bir anlayış sağlar örnek boyunca yapıların izlenmesi için izin verir. 3B hacim verilerinin üretilebilmek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Işık veya elektron mikroskobu4,5,6,7,8, episkobik 3D görüntüleme gibi blok yüz görüntüleme yöntemlerine kadar seri bölüm tabanlı yaklaşımlardan veya blok yüz tarama elektron mikroskobu7,8,9. Ancak, belirtilen tüm yöntemler, daha fazla araştırma için izin vermez tamamen örnek bölümleme veya imha içerir. Elde edilen çözünürlük, geleneksel histolojide açıklandığı gibi kesitleme işleminin eserlere yatkın olmasına son derece bağlıdır. Bu yöntemler hizalama yapıtlarından da muzdarip.
Mikroskobik ve nanoskobik bilgisayarlı tomografi (mikroCT ve nanoCT) gibi 3D X-ışını görüntüleme teknikleri doku örneğini tahrip etmeden 3D yüksek çözünürlüklü veri üretmeyi arzular. Şimdiye kadar, yumuşak doku zayıf X-Ray zayıflama kontrast ve bir laboratuvar ortamında yüksek çözünürlüklere sınırlı erişim mikroskobik doku yapılarının 3D görme için kullanımını bozulmuştur. Laboratuvar tabanlı, yüksek çözünürlüklü X-ışını CT doğru son gelişmeler 1 μm10,11,12,13altında çözünürlükler için izin verir.
Konvansiyonel zayıflama tabanlı X-ışını görüntülemesinde yumuşak dokuda kontrast eksikliği, X-ışını zayıflama kontrastını artıran boyama ajanları ile telafi edilir. Osmiyum tetroksit (OsO4),iyot potasyum iyodür (IKI) veya fosfotungstik asit (PTA) gibi diğer görüntüleme tekniklerinden bilinen boyama ajanları genellikle14,15,16,17, 18,19,20,21,22,23,24,25. (i) spesifik biyolojik hedefleme, (ii) homojen ve tam boyama, (iii) kolay işleme, (iv) difüzyon halkaları, (v) büyük ve yoğun doku boyama gibi eserler oluşturmadan dokunun hızlı penetrasyonuna izin veren boyama ajanları ve (vi) mikroskobik doku yapılarının 3Boyutlu görüntülenmesi için x-ışını BT'sini oluşturmak için histopatoloji ile tam uyumluluk gereklidir. Bu çalışmada,26'dabelirtilen gereksinimleri karşılayan eozin bazlı sitoplazmaya özgü x-ışını lekesi ile X-ışını BT görüntülemesi için yumuşak doku örneklerinin nasıl hazırlandığı gösterilmektedir.
Çok ölçekli görüntüleme yaklaşımı, genel bir mikroCT ölçümü ve daha yüksek çözünürlüklü araştırmalar için ilgi hacimlerinin (VOI) seçimi yoluyla boyama kalitesinin değerlendirilmesini sağlar. Boyama kalitesi (i) bütünlük, (ii) difüzyon halkalarının görünümü, (iii) kontrast geliştirme, (iv) çizgiler ve (v) homojenlik gibi BT yapıtlarının görünümü gibi boyama parametreleri üzerinde durularak analiz edilir. 100 nm'ye kadar çözünürlüklere ulaşmak için geometrik büyütme yi kullanan laboratuvar tabanlı nanoCT kurulumu, (alt)-hücresel seviye10,27'deyumuşak doku morfolojisini görselleştirir. NanoCT dilimlerinin histolojik ışık mikroskobu görüntüleriile karşılaştırmalı bir analizi, doku mimarisinin 2B mikroskobik düzeyde benzer ayrıntılarla çoğaltılmasını doğrulayarak dokunun histopatolojik karakterizasyonunu sağlar. Örnek. Bu ayrıntılı video protokolü farkındalığı artırmak ve zoologlar, biyologlar ve sağlık gibi geniş bir bilim topluluğunun ilgisini olan tahribatsız 3D yumuşak doku görüntüleme aracı olarak bu metodolojinin potansiyelini vurgulamak için tasarlanmıştır Profesyonel.
Protocol
Dikkat: Lütfen kullanmadan önce ilgili tüm malzeme güvenlik veri sayfalarına (MSDS) başvurun. Protokolde kullanılan kimyasalların bir çoğu akut toksik ve kanserojendir. Mühendislik kontrolleri (duman kaputu, eldiven kutusu) ve kişisel koruyucu ekipman (güvenlik gözlükleri, eldivenler, laboratuvar önlüğü, tam uzunlukta pantolon, kapalı ayak ayakkabı) kullanımı da dahil olmak üzere boyama protokolünü uygularken lütfen tüm uygun güvenlik uygulamalarını kullanın.
Kullanılan Hayvanlar:
Hayvan konutları, 2010/63 Avrupa Birliği yönergeleriuyarınca Münih Teknik Üniversitesi Klinikum rechts der Isar'da gerçekleştirilmiştir. Organ kaldırma klinikum rechts der Isar, Münih, Almanya (iç referans numarası 4-005-09) bir iç hayvan koruma komitesi nden onaylanmıştır. Tüm prosedürler ilgili yönerge ve yönetmeliklere uygun idi. Tüm laboratuvarlar, OECD'nin iyi laboratuvar uygulamaları ilkelerine uygun olarak denetlenir.
1. Eozin boyama protokolü
- Yumuşak doku örneklerini sabitlemek için, 50 mL'lik bir santrifüj tüpünü %4 (v/v) formaldehit çözeltisi (FA) ve 0,5 mL buzul asetik asit (AA) içeren bir fiksatif solüsyonla doldurun.
NOT: FA çözeltisini yaklaşık %10 metanol ile stabilize edilmiş %37 asitsiz FA çözeltisinden yeni hazırlayın. Dulbecco fosfat tamponlu salin (DPBS) ile FA çözeltisini daha da seyreltin. Kalsiyum ve magnezyum olmadan DPBS seçin. Seyreltik FA çözeltisini bir aydan fazla tutmayın. Asitleşme sırasında fiksatif çözeltinin pH'ı nötrden yaklaşık 3'e değişmektedir.
DİkKAT: FA akut organ toksik, aşındırıcı ve kanserojen olduğu için, duman başlığı kullanımı zorunludur ve uygun koruyucu kişisel ekipman kullanılmalıdır.- 50 mL santrifüj tüpüne yeni çıkarılan yumuşak doku örneğini ekleyin ve 50 mL santrifüj tüpünü 24-72 h soğutun.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir. - Yumuşak doku örneğini DPBS çözeltisi ile 1 saat yıkayın.
- 50 mL santrifüj tüpüne yeni çıkarılan yumuşak doku örneğini ekleyin ve 50 mL santrifüj tüpünü 24-72 h soğutun.
- Sabitlenmiş yumuşak doku örneğini (örn. bütün fare böbreği) lekelemek için, yumuşak dokuyu 2 mL eozin Y-boyama çözeltisine yerleştirin ve numuneyi 24 saat boyunca kuluçkaya yatırın. Işlem.
NOT: Eozin Y-boyama çözeltisi distile suda %30 (w/v) konsantrasyona sahiptir. Boyama çözeltisinin hacmini, numunenin tamamen boyama çözeltisi ile kaplayacak şekilde seçin ve numunenin numune kabı içinde serbestçe hareket etmesini bekleyin. Kuluçka süresi diğer numuneler için farklılık gösterebilir ve buna göre ayarlanmalıdır. - Boyama sonra, örnek kabından dikkatlice yumuşak doku örneği çıkarın.
- Dikkatle selüloz doku kağıt ile boyama maddesi fazlalığı kaldırın.
- Yumuşak doku örneğini, depolama ve daha fazla kullanım için etanol buharı fazının üzerinde konik bir numune kabına yerleştirin.
NOT: Konik numune kabı, yumuşak doku örneğini nemli tutmak ve objeleri önlemek için tüpün alt kısmında her zaman %70 (v/v) etanol içeren birkaç damla içermelidir.
2. X-ışını mikroCT görüntüleme
NOT: X-ışını mikroCT ölçümleri, genel bt ölçümleri (görüntü alanı içindeki numunenin tamamını niçin görüntülenebilme (FOV)) ve yüksek çözünürlüklü CT ölçümlerinin performansı (odaklama yeteneği) sunan bir mikroCT tarayıcısı ile yapılmıştır. aynı numunenin istenilen bir ilgi hacminde (VOI) 1 μm'ye kadar iner.
- Yumuşak doku örneğini uygun bir numune tutucuya monte edin. X-ışını BT ölçümleri sırasında numunenin hareket etmesini önlemek için numunenin numune tutucuya sıkıca oturmasını sağlayın.
- Lekeli fare böbreği durumunda: Bir tüpün alt kesilir, iki santrifüj tüpleri ile bir örnek tutucu hazırlayın. İki santrifüj tüpünü iki bileşenli yapıştırıcı kullanarak yapıştırın. Santrifüj tüplerinin dönüş ekseni etrafında düz bir hizalanmasını sağlayın. Yapıştırıcının sertleşmesini bekleyin.
- Numune tutucu kullanıma hazır olduğunda, fare böbreğini tüpün alt kısmında %70 (v/v) etanol içeren sağlam santrifüj tüpüne aktarın.
NOT: Numunenin stabilitesi çok önemlidir. X-ışını BT ölçümleri için numunehazırlamak için zaman ayırın. Yumuşak doku örneği, X-ışını BT ölçümleri sırasında numuneyi nemli tutmak ve yumuşak doku örneğinin büzülmesini ve diğer objeleri önlemek için bir etanol buharı fazı üzerinde tutulur. Yumuşak doku örneği, x-ışını BT ölçümü sırasında numunenin etrafında solvent birikimini gizlemek için çözücü ile temas etmemelidir, bu da ölçüm sırasında numune hareketine yol açabilir veya rekonstrüksiyon sırasında sorunlara neden olabilir. Numune tutucu nun alt tabakada çözücü tutmasına izin vermiyorsa, %70 (v/v) etanol ile nemlendirilmiş bir selüloz kağıdı numune tutucuya yerleştirilebilir. Bu solvent etanol nedeniyle büzülme eserler gözlenmedi unutulmamalıdır.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir.
- Örneğin dikkatli hizalanmasından sonra, en iyi görüntü kalitesi için edinme parametrelerini seçin. Sunulan mikroCT verilerinin sunulması durumunda, 360°'nin üzerinde eşit olarak dağıtılan 1601 projeksiyonu kullanarak 3,5 W'lık bir akım olan 50 kV'luk bir maksimum voltajda tazyiciyi elde edin.
NOT: En iyi görüntü kalitesi için genel bakış CT taraması için kazanım parametreleri seçilmiştir. Bu nedenle 0.39x kamera hedefi görüş alanı (FOV) içinde tüm örnek kapsayacak şekilde seçildi. Bu da 12 μm'lik etkili bir piksel boyutuna yol açtı. Projeksiyon başına 2 s pozlama süresi gürültü oranına iyi bir sinyal sağladı. Yüksek çözünürlüklü CT taraması için YG genel bakış taramasından mikroCT verileri kullanılarak tanımlanmıştı. MicroCT tarayıcılar genellikle belirlenen yatırım getirisi kesin seçimi için izin veren entegre bir yazılım aracı içerir. Yüksek çözünürlüklü CT verileri için 4x kamera hedefi 3,3 m etkili bir piksel boyutu ile elde seçildi. Burada, projeksiyon başına 15 s bir pozlama süresi gerekli ydi.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir. - X-ışını BT verilerinin elde edilmesinden sonra, 3B hacmin yeniden inşası için projeksiyonları buna göre işle. Sunulan mikroCT verilerinde: X-ışını CT verilerini entegre yazılımla yeniden oluşturun.
NOT: Şekil 1 ve Şekil 2'de gösterilen mikroCT verilerinin hacim oluşturmaları bir görselleştirme yazılımı kullanılarak oluşturulmuştur.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir.
3. X-ışını nanoCT görüntüleme
NOT: X-ışını nanoCT tarayıcısı şirket içinde geliştirilmiştir. Lenssiz cihaz nanofocus X-Ray kaynağı ve tek foton sayma dedektörü ile donatılmıştır. 100 nm'ye kadar çözünürlüğe sahip 3B veriler10oluşturulabilir. Genellikle, X-ışını optik olanlar da dahil olmak üzere nanoCT sistemleri ticari olarak mevcuttur ve açıklanan nanoCT tarayıcı ile sınırlı değildir.
- NanoCT numune hazırlama
- Yumuşak doku örneğinin VOI'larını hazırlayın. Yumuşak dokuyu neşter ve stereomikroskop kullanarak yaklaşık 0,5 mm kenar uzunluğunda çok küçük parçalara kesin. Fare böbreği durumunda: Fare böbreğini en uzun eksen boyunca iki yarıya bölün. Fare böbreğinin yarısını alın ve renal korteks ve renal medulla gibi farklı anatomik bölgeler hazırlayın.
NOT: Fare böbreğinin diğer yarısı histopatolojiye aktarıldı ve burada örnek parafinin içine gömülü olarak işlendi ve Şekil 3c ve Şekil 3d'de görüldüğü gibi tipik histolojik kesitleri verim olarak işlendi. . - İlk dehidratasyon adımından önce küçük parçaları yeni bir Petri kabına aktarın ve bundan sonraki tüm adımlariçin burada kalırlar.
- 50, 60, 70, 80, 90, 96 ve 100 etanol distile su ile dengelenmiş konsantrasyonları (tüm v/v) kullanarak numuneleri dehydrate. Her bir dehidratasyon adımLarını 1 saat yapın.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Bir gecede% 100 etanol küçük doku parçaları tutun. - Kritik nokta kuru (CPD) küçük doku parçaları.
NOT: CPD uygulaması, çözücünün (burada etanol) kurutma maddesi (burada CO2)ile değiş tokuş ederek doku örneğinin tamamen dehidratasyonunu sağlar. Bu, numunenin nanoCT'un numune tutucularına monte edilebilmesini, ölçüm sırasında hareket etmediğini ve en iyi geometrik büyütme için X-ışını kaynağına çok yakın konumlandırılabilmesi için gerekli olmuştur. NanoCT kurulumu sadece geometrik büyütmeye dayanır ve büyütme faktörü kaynaktan numuneye uzaklık üzerinden kaynaktan dedektöre uzaklık olarak tanımlanır. Kurutma tekniği ilk olarak Anderson tarafından elektron mikroskobu için biyolojik örneklerin 3Boyutlu yapısını korumak için tanıtıldı28. Tekniğin genel bir bakış Bray29tarafından sağlanmaktadır.- Vakum odasını %100 etanolle önceden doldurun. Küçük doku parçalarını mikro gözenekli bir kapsüle aktarın ve CPD'nin vakum odasına yerleştirin.
NOT: Yüksek basınç CPD işlemine dahil olduğundan, CPD'nin tüm parçalarının, özellikle bağlantı parçalarının sağlam olduğundan ve sistemin düzgün bir şekilde kapalı olduğundan emin olun. - Hazneyi 6-8°C'ye kadar soğutun ve sıvı CO2ile doldurun.
- Karıştırırken, iki bileşenin düzgün karıştırılması için 3 dk bekleyin. Odayı dikkatlice boşaltın. Numune tutucunun hala çözücü ile kaplı olduğundan emin olun. Örnek içinde CO2 ile etanol ün tam olarak değiştirilmesine izin vermek için bu adımı on kez tekrarlayın.
- Odanın CO2ile son dolumundan sonra makineyi CO2 (31 °C ve 73,8bar) kritik noktasına ısıtın ve ardından 30 dk'lık bir süre içinde gaz halindeki CO2'nin çok yavaş salınımı devam edin.
NOT: Gazın salınımı çok yavaş yapılmalıdır, aksi takdirde numune üzerinde yoğunlaştırıcı su oluşabilir. Sıcaklığın kritik CO2noktasının altına düşmediğinden emin olun. CpD makinesini yalnızca sistemden tüm basınç serbest bırakıldığında açın. - CPD doku parçalarını makineden hızlıbir şekilde çıkarın ve daha fazla kullanımdan önce bir kurutucuda saklanan yeni bir Petri kabında saklayın.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir.
- Vakum odasını %100 etanolle önceden doldurun. Küçük doku parçalarını mikro gözenekli bir kapsüle aktarın ve CPD'nin vakum odasına yerleştirin.
- Yumuşak doku örneğinin VOI'larını hazırlayın. Yumuşak dokuyu neşter ve stereomikroskop kullanarak yaklaşık 0,5 mm kenar uzunluğunda çok küçük parçalara kesin. Fare böbreği durumunda: Fare böbreğini en uzun eksen boyunca iki yarıya bölün. Fare böbreğinin yarısını alın ve renal korteks ve renal medulla gibi farklı anatomik bölgeler hazırlayın.
- CPD doku parçalarını uygun bir numune tutucuya monte edin. CT ölçümleri sırasında numunenin hareket etmesini önlemek için numunenin numune tutucuya sıkıca oturmasını sağlayın. CPD fare böbrek dokusu parçaları durumunda: Bir örnek tutucuya yapıştırıcı ile doku parçaları yapıştırın.
NOT: CT ölçümleri sırasında numunenin istenmeyen herhangi bir hareketi hacim rekonstrüksiyonu sırasında sorunlara neden olabilir - özellikle nanometre voxel boyutunda bir veri seti elde ederken.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir. - Örneğin dikkatli hizalanmasından sonra, en iyi görüntü kalitesi için edinme parametrelerini seçin. Sunulan nanoCT verilerinde: 360° üzerinde eşit olarak dağıtılan 1599 projeksiyonve yaklaşık 400 nm voxel boyutuyla 60 kV'luk en yüksek gerilimde projeksiyonlar edinin.
NOT: 400 nm voxel boyutunda elde edilen tek bir CT ölçümü, dönüş ekseni (dikey) yönünde 75 μm ve dönüş eksenine (yatay) dik yönde yaklaşık 560 m fov'a sahiptir. Daha büyük hacimleri araştırmak için, FOV'un dönüş ekseni boyunca bir uzantısı, farklı dikey konumlarda birden fazla tarama birleştirilerek elde edilebilir. Ayrıca, küresel bir CT taramasının FOV'u tarafından verilenden daha büyük bir numune çapı rotasyon eksenine dik olan numuneleri ölçmek için lokal tomografi taramaları yapılabilir. NanoCT verileri projeksiyon başına 4 s pozlama süresi ile elde edildi. Bu nedenle veri kümesi başına toplam edinme süresi yaklaşık 3,5 saat idi.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir. - CT verilerinin elde edilmesinden sonra, 3B hacminin yeniden inşası için projeksiyonları buna göre işle.
- Sunulan nanoCT verileri durumunda, kazanılmış projeksiyonları düz alan görüntüleriyle normalleştirin. Richardson-Lucy deconvolution algoritması kullanarak projeksiyonların netliğini artırmak30,31. Deconvolution çekirdeği olarak bir piksel standart bir sapma ile bir rotasyonel simetrik Gaussian işlevi kullanın.
- Yumuşak doku kontrastını artırmak için Paganin'in faz alma algoritmasını keskinleştirilmiş görüntülere uygulayın. Görüntü kalitesini optimize etmek için algoritmanın parametrelerini ayarlayın32. Önceden işlenmiş projeksiyonları son teknoloji filtreli arka projeksiyon algoritmasıyla yeniden oluşturun.
NOT: Şekil 3 elde edilen nanoCT verilerini yaklaşık 7 μm kalınlığında histolojik kesitlerle değerlendirir. Bu nedenle, yaklaşık 7 μm sanal kalınlığı ile 18 bitişik nanoCT dilimleri minimum yoğunluklu projeksiyon dilimleri ilgili dilimlerde her piksel için minimum değer hesaplanması yoluyla oluşturuldu. Şekil 4'tegörüntülenen nanoCT verilerinin hacmini işlemek için bir görselleştirme yazılımı kullanılmıştır.
Representative Results
Şekil 1, tombullama sonrası kontrast geliştirmesini vurgulayan düşük çözünürlüklü mikroCT verilerinin CT dilimlerini ve ses oluşturma yı gösterir. Şekil 2, tüm fare böbreğinin yerel tomografisinden elde edilen yüksek çözünürlüklü mikroCT verilerinin CT dilimlerini ve ses oluşturmasını gösterir. Şekil 3, ilgili histolojik kesitlere göre nanoCT verilerinin CT dilimlerini gösterir. Şekil 4, hücresel düzeyde yapısal ayrıntıları vurgulayan nanoCT verilerinin CT dilimini ve hacim oluşturmayı gösterir. Düşük çözünürlüklü mikroCT ölçümü tüm organın genel bir bakış sağlar ve yüksek çözünürlüklü mikroCT ölçümü için ilgi hacimleri (VOI) belirlemek için yardımcı olur. Bu çok ölçekli yaklaşım sayesinde, nanoCT için VOI belirlenir. NanoCT hücresel düzeyde yumuşak doku örneğinin çok ayrıntılı bir görünümünü sağlar. Karşılık gelen histolojik bölüm ile karşılaştırmalı çalışma histopatoloji ile tam uyumluluk vurgulamaktadır. Burada multimodal görüntüleme yaklaşımı her iki yöntemle elde edilen sonuçları doğrular.
Şekil 1. CT dilimleri ve düşük çözünürlüklü mikroCT verilerinin ses işleme. (a,b) Aynı fare böbreğinin sırasıyla boyama dan önce ve sonra genel görüntüleri, eozin bazlı boyama protokolünün uygulanmasından sonra elde edilen kontrast geliştirmesini vurgular. Her iki mikroCT veri seti de özdeş kazanım parametreleri kullanılarak elde edildi. Her iki veri kümesindeki voxel boyutu 12 μm'dir. (b)'de elde edilen kontrast geliştirme aşağıdaki anatomik yapısal bölgelerin tanımlanmasını sağlar: Dış medullanın dış çizgilerinde daha fazla ayrım ile Korteks (I), dış medulla (IIa) ve dış medullanın iç çizgileri (IIb), iç medulla (III), papilla (IV) ve renal pelvis (V). (c) Tüm fare böbreği boyunca sanal bir sagital kesiti gösteren mikroCT verilerinin hacim işlemesi. Bu rakam Busse ve Müller ve ark.26'dandeğiştirilmiştir.
Şekil 2. Geliştirilen ozin tabanlı boyama protokolünün uygulanmasından sonra aynı fare böbreğinden elde edilen yüksek çözünürlüklü mikroCT verilerinin CT dilimi ve hacim işlemesi. (a)Sol köşede, görüntülenen yüksek çözünürlüklü görüntü için YG 'yi (mavi kutu) vurgulayan genel microCT görüntüsü gösterilir. Aşağıdaki anatomik yapısal bölgeler tanımlanabilir: Korteks (I), dış medulla (IIa) dış şeritler ve dış medulla iç şeritler daha fazla ayrım ile (IIa), iç medulla (III), küçük kaliks (IV) ve damarlar (V ve VI). (b) Voxel boyutu 3,3 m ile elde edilen yüksek çözünürlüklü mikroCT verilerinin faiz hacmi. Medulla bölgesi ve tüm böbreğin lokal tomografisinden elde edilen bir damar aracılığıyla sanal bir bölüm gösterilmiştir. Bu rakam Busse ve Müller ve ark.26'dandeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Geliştirilen eozin bazlı boyama protokolünün uygulanmasından sonra aynı fare böbreğinden elde edilen histolojik kesitlere (c,d) göre nanoCT verilerinin CT dilimleri (a,b). (a) Boyama, diseksiyon ve CPD sonrası aynı fare böbrek örneğinin nanoCT görüntüsü Şekil 1 ve Şekil 2'degörülen bölgenin (IIb) ayrıntılı yapılarını göstermektedir. Bu Henle döngü kalın yükselen uzuvlar olarak bilinir. (b) Hücre çekirdeğinin net bir şekilde görüntülenmesiiçin yaklaşık 7 m sanal dilim kalınlığıile(a)gösterilen aynı nanoCT veri kümesinden elde edilen minimum yoğunluklu projeksiyon dilimi. (c) Hücre çekirdeklerinin ve fırça sınırının net görselleştirmesi ile Henle'nin halkasının kalın yükselen uzuvlarını gösteren temsili histolojik bölüm. Histolojik bölüm yaklaşık 7 μm kalınlığa sahiptir ve parafin bloğuna uygulanan eozin bazlı boyama ve katıştırma sonrasında aynı fare böbrek örneğinden elde edilmiştir. (d) Mor hücre çekirdeklerini vurgulayan sayaç lekesi hematoksilin uygulaması ile temsil histolojik bölümü. (c)bendinde gösterilen bölüme yakın histolojik bölümün yaklaşık 7 μm kalınlığında hazırlanması. Bu rakam Busse ve Müller ve ark.26'dandeğiştirilmiştir.
Şekil 4. NANOCT verilerinin CT dilimi ve hacim işlemesi. (a) Henle'in halkasının kalın yükselen uzuvları olarak bilinen yapıları gösteren aynı fare böbrek örneğinin nanoCT görüntüsü. Bu, Şekil 1 ve Şekil 2'de görülen ve yaklaşık 400 nm voxel boyutuna sahip küçük bir böbreğin küçük bir parçasından elde edilen bölgenin (IIb) ayrıntılı bir görünümüdür. Örneğin hazırlanması boyama, diseksiyon ve CPD. (b) Henle döngülerinin kalın artan uzuvlarının 3Boyutlu yapısını görselleştiren nanoCT verilerinin hacim işlemesini içeriyordu. Bu rakam Busse ve Müller ve ark.26'dandeğiştirilmiştir.
Discussion
Şu anda, eozin hücre sitoplazması etiketlemek için standart histolojik protokol olarak kullanılır. Boyama maddesi yumuşak doku mikroskobik dilimlerine %0,1 (w/v) sulu çözelti olarak uygulanır (genellikle 2-10 μm kalınlığında kesilmiş)33. Bu standart histolojik protokolün tüm fare böbreği gibi 3D doku örneklerine uygulanması zayıflama kontrastı gelişmiş BT görüntüsüne neden olmaz. Bir yandan, bu laboratuvar tabanlı mikroCT sistemlerinin tipik kullanılan X-ışını enerjileri için yumuşak dokunun düşük içsel zayıflama özellikleri atfedilebilir. Genellikle, yumuşak doku ağırlıklı olarak karbon oluşur, hidrojen, oksijen ve azot34, ve bu nedenle, kontrast geliştirme neden olmaz. Öte yandan, boyama için kullanılan eozin düşük konsantrasyonu sınırlayıcı faktör oldu. Bir eozin molekülü dört bromür atomu (Z = 3534ile yüksek atom numarası elemanı brom) barındırsa da, X-ışını BT görüntülemesi için gerekli duyarlılık düzeyleri karşılanmadı.
Düşük zayıflama kontrastı bu meydan okuma aşmak için, eozin çeşitli konsantrasyonları araştırıldı. Bir sınırlama burada sulu bir çözeltide% 30 (w / v) suda eozin maksimum çözünürlüğü vardır. Yumuşak doku içinde en iyi zayıflama kontrast geliştirme Lambert-Bira Kanunu'na göre beklenen en yüksek eozin konsantrasyonu ile gözlendi. Bu nedenle son boyama protokolü en yüksek konsantrasyonla gerçekleştirilmiştir.
Kontrast geliştirmeyi daha da iyileştirmek için yumuşak dokunun moleküler düzeyde en iyi şekilde nasıl hazırlanacağı sorusu pH ayarı ile yanıtlandı. Burada, fiksasyon sırasında veya boyama dan önce yumuşak doku örneğinin asitlenmesi çok önemli bulunmuştur. Bu da Hong ve ark.35tarafından gösterilmiştir. Asit tarafından hücre sitoplazması içinde boyama ajanının daha yüksek birikimi, hücre sitoplazmasında bulunan protein ve peptidlerin amino asit yan zincirlerinin protonlanması sonucu oluşan gelişmiş iyonik etkileşimler ile elde edilmiştir. Lekesiz bir yumuşak doku örneğine kıyasla kontrast geliştirmesini vurgulayan temsili bir sonuç Şekil 1a,b'degösterilmiştir. Burada korteks, medulla, papilla ve renal pelvis gibi önemli anatomik bölgeleri görselleştiren bir fare böbreğinin yapısal bir genel görünümü elde edilmiştir.
Sunulan boyama protokolü uygulamak kolaydır ve yalnızca üç adım içerir. Gerekli reaktifler kolayca erişilebilir. 24 saatlik genel boyama süresi, bir laboratuvar ortamında yumuşak doku örneklerinin(Şekil 1c, Şekil 2b ve Şekil 4b) 3Boyutlu görüntülemesini sağlayan bir bütün organ boyama için hızlıdır. hücresel seviyeye kadar birden fazla ölçekler. Gerekli boyama çözeltisinin genel boyama süresi ve hacmi, numunenin yapısına bağlı olarak bazı adaptasyonlar gerektirebilir unutulmamalıdır. Bununla birlikte, eozin bazlı boyama protokolü tüm organ boyama için uygundur, bu da tüm organların yüksek çözünürlüklü mikroCT görüntülemesini sağlar. MikroCT ölçümleri sırasında numunenin nemli tutulmasında kullanılan çözücü etanol nedeniyle büzülme objeleri gözlenmemiştir. Orijinal örnekten alınan küçük doku parçalarının araştırılmasına olanak tanıyan nanoCT görüntüleme için ek hazırlık adımları gereklidir. Gelecekteki histopatolojik uygulamalara ilişkin olarak, genel bakış taramaları şekil 2a'da gösterildiği gibi ROI'ların belirlenmesine olanak sağlayan değiştirilmiş anatomik bölgeler ve yapılar hakkında değerli bilgiler sağlayacaktır. Bunlar mikroCT(Şekil 1c ve Şekil 2b)veya nanoCT (Şekil 4b) ile 3Boyutlu olarak incelenebilir ve histoloji ile 2B olarak değerlendirilebilir (Şekil 3).
Protokolün bir diğer gücü de H&E boyama prosedürüne göre histopatolojiile tam uyumluluk ta görülmektedir. Uygulanan eozin konsantrasyonu histolojik boyama çözeltisine göre çok daha yüksek olmasına rağmen, eozin bazlı boyama işleminin toplu numunelere uygulanması daha fazla histolojik araştırmayı engellemez(Şekil 3). Yaklaşık 400 nm(Şekil 3a)sanal kalınlığı olan nanoCT dilimi, ilgili yumuşak doku örneğinden elde edilen histolojik kesitle(Şekil 3c)zaten çok iyi karşılaştırır. 7-10 μm'lik histolojik bir bölümün yaklaşık kalınlığı göz önüne alındığında, yaklaşık 7 μm'lik sanal kalınlığa karşılık gelen nanoCT verilerinin minimum yoğunluklu projeksiyon dilimlerinin(Şekil 3b)üretilmesi, histolojik bölümle daha iyi karşılaştırma(Şekil 3c). Burada, hücre çekirdekleri açıkça eozin özellikle hücre sitoplazmasında protein ve peptidler lekeler olarak non-zayıflatma alanı olarak ortaya33.
Standart histolojik boyama prosedürüne göre boyama sırası tersine çevrilmiş olsa da, standart histolojik yöntemlerle daha fazla karşı boyama uygulaması mümkündür. Bt için geliştirilen eozin bazlı boyama protokolü ile ilk başlayarak, ardından hematoksilin ile bu eozin bazlı histolojik kesitlerin karşı boyama, tam uyumluluk sağlar ve beklenen formu gösteren yüksek kaliteli boyama sonuçları görünüm. Mayer'ın ekşi hematoksin ile hücre çekirdeğine özgü boyama mor hücre çekirdeklerini vurgulayan histolojik bölüme uygulandı(Şekil 3d). Histolojik sayaç boyama uygulaması şu anda H-lekesi ile sınırlıdır. Periyodik asit Schiff'in tabanı, Elastica van Gieson veya Gomori gümüşü gibi diğer standart histolojik sayaç boyamalarının yanı sıra immünohistolojik tekniklerle uyumluluğun da test edilmesi gerekmektedir.
Eozin bazlı boyama protokolü (i) hücre sitoplazmasına özgü hedefleme, (ii) homojen ve tam boyama, (iii) kolay uygulama, (iv) difüzyon halkaları gibi eserler oluşturmadan dokunun hızlı penetrasyonu, (v) büyük ve yoğun yumuşak doku örnekleri ve (vi) H&E lekesi açısından histopatoloji ile tam uyumluluk. Bu gereksinimler, yumuşak dokunun hücresel düzeye kadar yüksek çözünürlüklü X-ışını BT görselleştirmesi için önemlidir. Son zamanlarda geliştirilen nanoCT cihazları ile birlikte12,36,37, kontrast ve geleneksel histolojik verilere çözünürlük karşılaştırılabilir sanal histolojik dilimlerin zararsız nesil mümkün hale getirilir. Bu kombine yaklaşım mikroskobik doku yapılarının 3Boyutlu görselleştirme için değerli bir araç olarak X-Ray BT kurulmasını sağlayacaktır.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Dr. Enken Drecoll'a histolojik tartışmalar ve Excillum AB, İsveç'teki son derece yardımsever ekibi için teşekkür ederiz. DFG Mükemmellik Kümesi Münih Gelişmiş Fotonik Merkezi (MAP) ve DFG Gottfried Wilhelm Leibniz Programı aracılığıyla finansal desteği kabul ediyoruz. Ayrıca, bu araştırma projesi Marie Skłodowska-Curie Hibe Anlaşması No altında Avrupa Birliği Horizon 2020 araştırma ve yenilik programından fon almıştır. H2020-MSCA-IF-2015-703745-CONSALT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50-ml centrifuge tube by Falcon | VWR | 734-0453 | |
| Formaldehyde solution, 37% | Carl Roth | CP10.2 | acid-free, stabilized with ~10% MeOH |
| Glacial acetic acid | Alfa Aesar | 36289.AP | |
| Eosin Y disodium salt | Sigma-Aldrich | E4382 | certified by Biological Stain Commission |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | L1825 | Dulbecco's formualtion, w/o calcium and magnesium |
| Sample Tubes by Nalgene | Carl Roth | ATK5.1 | |
| Rocking Shaker ST5 | CAT | 60281-0000 | |
| Cellulose tissue paper | VWR | 115-0600 | |
| Forceps, by USBECK Laborgeräte | VWR | 232-0096 | |
| Microcentrifuge tubes by Eppendorf | VWR | 211-2120 | safe-lock, 2.0 ml |
| Ethanol absolute by Baker Analyzed | VWR | 80252500 | |
| Disposable safety scalpel by Aesculap | VWR | AESCBA210 | |
| Petri dish by Sterilin | VWR | 391-2019 | |
| Plastic pasteur pipette | Carl Roth | EA68.1 | graduated, 1 ml |
| Desiccator by Duran | VWR | SCOT247826954 | |
| Silicone grease by Bayer | Sigma-Aldrich | 85404 | high-vacuum |
| Carbon dioxide cylinder with standpipe | Linde | 3700113 | 10 kg, short |
| micro-porous treatment capsule | PLANO GmbH | 4614 | pore size 78 µm (B) |
| Bal-Tec CPD 030 | Bal-Tec AG | CO2 as drying agent | |
| Stemi 2000-C stereomicroscope with KL 1500 LCD | Zeiss | this stereomicroscope has been updated(1) | |
| Zeiss Xradia Versa 500 | Zeiss | this microCT scanner has been updated(2) | |
| Avizo Fire 8.1 | Thermo Fisher Scientific | ||
| PILATUS detector as part of the nanoCT scanner | Dectris | single-photon counting detector(4,5); there are commercially availble nanoCT systems available (6,7) | |
| nanofocus X-ray source as part of the nanoCT scanner | Excillum | high-flux nanofocus X-ray transmission tube(3); there are commercially availble nanoCT systems available(6,7) | |
| (1) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS stereomicroscopes https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/Stereomikroskope/1006> (September 06, 2019). | |||
| (2) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS Xradia 510 Versa https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/zeiss-xradia-510-versa.html> (April 10, 2019). | |||
| (3) Nachtrab, F. et al. Development of a Timepix based detector for the NanoXCT project. Journal of Instrumentation 10 (11), C11009, (2015). | |||
| (4) Kraft, P. et al. Performance of single-photon-counting PILATUS detector modules. Journal of Synchrotron Radiation 16 (3), 368-375, (2009). | |||
| (5) Kraft, P. et al. Characterization and calibration of PILATUS detectors. IEEE Transactions on Nuclear Science 56 (3), 758-764, (2009). | |||
| (6) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS Xradia 810 Ultra https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/xradia-810-ultra.html> (April 9 2019). | |||
| (7) Company, G. E. GE product information: Phoenix nanotom m, https://www.gemeasurement.com/sites/gemc.dev/files/geit-31344en_nanotom_m_0517.pdf> (April 10, 2019). |
References
- Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. Theory and Practice of Histological Techniques. 7th edn. , Churchill Livingstone Elsevier. (2013).
- Chatterjee, S. Artefacts in histopathology. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 18 (4), 111-116 (2014).
- McInnes, E. Artefacts in histopathology. Comparative Clinical Pathology. 13 (3), 100-108 (2005).
- Andreasen, A., Drewes, A., Assentoft, J., Larsen, N. Computer-assisted alignment of standard serial sections without use of artificial land-marks. A practical approach to the utilization of incomplete information in 3-d reconstruction of the hippocampal region. Journal of Neuroscience Methods. 45 (3), 199-207 (1992).
- Braverman, M. S., Braverman, I. M. Three-dimensional reconstructions of objects from serial sections using a microcomputer graphics system. Journal of Investigative Dermatology. 86 (3), 290-294 (1986).
- Denk, W., Hortsmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).
- Mohun, T. J., Weninger, J. W. Imaging heart development using high-resolution episcopic microscopy. Current Opinion in Genetics and Development. 21, 573-578 (2011).
- Weninger, J. W., Meng, S., Streicher, J., Müller, G. B. A new episcopic method for rapid 3-d reconstruction: applications in anatomy and embryology. Anatomy and Embryology. 197 (5), 341-348 (1998).
- Odgaard, A., Andersen, K., Melsen, F., Gundersen, H. J. G. A Direct Method for Fast 3-Dimensional Serial Reconstruction. Journal of Microscopy. 159, 335-342 (1990).
- Müller, M., et al. Myoanatomy of the velevt worm leg revealed by labratory-based nanofocus X-ray source tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12378-12383 (2017).
- Salomon, M., Hanke, R., Krüger, P., Uhlmann, N., Voland, V. Realization of a computed tomography setup to achieve resolutions below 1 µm. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A. 591, 50-53 (2008).
- Tkachuk, A., et al. X-ray computed tomography in Zernike phase contrast mode at 8 keV with 50-nm resolution using Cu rotating anode X-ray source. Zeitschrift für Kristallographie. 222, 650-655 (2007).
- Withers, P. J. X-ray nanotomography. Materials Today. 10, 26-34 (2007).
- Jahn, H., et al. Evaluation of contrasting techniques for X-ray imaging of velvet worms (Onychophora). Journal of Microscopy. 270 (3), 343-358 (2018).
- Martins de S. e Silva, J., et al. Three-dimensional non-destructive soft-tissue visualization with X-ray staining micro-tomography. Scientific Reports. 5, 14088 (2015).
- Metscher, B. D. MicroCT for Developmental Biology: A Versatile Tool for High-Contrast 3D Imaging at Histological Resolutions. Developmental Dynamics. 238, 632-640 (2009).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
- Mitzutani, R., et al. X-Ray Microtomographic Imaging of Three-Dimensional Structure of Soft Tissues. Tissue Engineering Part C: Methods. 14 (4), 359-363 (2008).
- Pauwels, E., Loo, D. v, Cornillie, P., Brabant, L., Hoorebeke, L. v An exploratory study of contrast agents for soft tissue visualization by means of high resolution X-ray computed tomography imaging. Journal of Microscopy. 250, 21-31 (2013).
- Degenhardt, K., Wright, A. C., Horng, D., Padmanabhan, A., Epstein, J. A. Rapid 3D phenotyping of cardiovascular development in mouse embryos by micro-CT with iodine staining. Circulation: Cardiovascular Imaging. 3 (3), 314-322 (2010).
- Dullin, C., et al. μCT of ex-vivo stained mouse hearts and embryos enables a precise match between 3D virtual histology, classical histology and immunochemistry. PLOS ONE. 12 (2), 0170597 (2017).
- Jeffrey, N. S., Stephenson, R. S., Gallagher, J. A., Cox, P. Micro-computed tomography with iodine staining resolves the arrangement of muscle fibres. Journal of Biomechanics. 44, 189-192 (2011).
- Johnson, J. T., et al. Virtual Histology of Transgenic Mouse Embryos for High-Throughput Phenotyping. PLOS Genetics. 2, 61 (2006).
- Leszczyński, B., et al. Visualization and Quantitative 3D Analysis of Intraocular Melanoma and Its Vascularization in a Hamster Eye. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 332 (2018).
- Mizutani, R., Suzuki, Y. X-ray microtomography in biology. Mircon. 43, 104-115 (2012).
- Busse, M., et al. Three-dimensional virtual histology enabled through cytoplasm-specific X-ray stain for microscopic and nanoscopic computed tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2293-2298 (2018).
- Müller, M., et al. Non-destructive high-resolution 3D virtual histology enabled through a cell nucleus-specific stain for X-ray computed tomography. Scientific Reports. 8, 17855 (2018).
- Anderson, T. F. Techniques for the preservation of three-dimensional structure in preparing specimens for the electron microscope. Transactions of the New York Academy of Sciences. 13 (4), Series II 130-134 (1951).
- Bray, D. Supercritical Fluid Methods and Protocols. Methods in Biotechnology. Williams, J. R., Clifford, A. A. 13, Humana Press. 235-243 (2000).
- Lucy, L. B. An iterative technique for the rectification of observed distributions. The Astronomical Journal. 79, 745-765 (1974).
- Richardson, W. H. Bayesian-Based Iterative Method of Image Restoration. The Journal of the Optical Society of America. 62 (1), 55-59 (1972).
- Paganin, F., Mayo, S. C., Gureyev, T. E., Miller, P. R., Wilkins, S. W. Simultaneous phase and amplitude extraction from a single defocused image of a homogeneous object. Journal of Microscopy. 206, 33-40 (2002).
- Riedelsheimer, B., Büchl-Zimmermann, S. Mikroskopische Technik. Mulisch, M., Welsch, U. , Spektrum-Verlag GmbH. Berlin Heidelberg. Ch. 10 193-194 (2015).
- Hubbell, J. H., Seltzer, S. M. Tables of Xray mass attenuation coefficients and mass energy-absorption coefficients from 1 keV to 92 keV and 48 additional substances of dosimetric interest, Table 3. National Institute of Standards and Technology. , (1995).
- Hong, H. Y., Yoo, G. S., Choi, J. K. An Eosin Y Method for Protein Determination in Solution. Analytical Letters. 32 (12), 2427-2442 (1999).
- Dierick, M., et al. Recent Micro-CT Scanner Developments at UGCT. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B. 324, 35-40 (2014).
- Kastner, J., Plank, B., Heinzl, C. Advanced X computed tomography methods: High resolution CT, quantitative CT, 4DCT and phase contrast CT. Proceedings of Digital Industrial Radiology and Computed Tomography. , 120-132 (2015).
