Summary
Представлен протокол 3D визуализации микроскопических структур тканей с помощью рентгеновского специфического метода окрашивания, предназначенного для рентгеновской компьютерной томографии.
Abstract
Мы демонстрируем лабораторный метод, сочетающий рентгеновский микроКТ и наноКТ с конкретным рентгеновским пятном, которое нацелено на цитоплазму клеток. Описанный протокол прост в применении, быстр и подходит для больших образцов мягких тканей. Представленная методология позволяет охарактеризовать важнейшие структуры тканей в трех измерениях и демонстрируется на целой почки мыши. Многомасштабный подход позволяет изобразить всю почку мыши и поддерживает выбор дополнительных объемов интереса, которые приобретаются с более высоким разрешением в диапазоне нанометров. Таким образом, морфология мягких тканей с аналогичным уровнем детализации, как соответствующие гистологические световые микроскопические изображения воспроизводится. Более глубокое понимание 3D-конфигурации структур тканей достигается без ущерба для дальнейших исследований с помощью гистологических методов.
Introduction
Полная характеристика образцов мягких тканей требует информации о микроструктуре 3D-ткани. Текущий золотой стандарт для анализа образцов мягких тканей – гистопатология. Ткань и клеточная морфология образца исследуются в 2D в пределах отдельных областей, представляющих интерес (ROIs) с помощью оптической микроскопии1. Этот метод, однако, имеет несколько недостатков. Подготовка образца занимает много времени, сложна, разрушительна и подвержена артефактам. Произведенные микроскопические слайды предоставляют только 2D-информацию параллельно плоскости секции. Часто количество гистологических разделов, которые исследуются, ограничено из-за временных ограничений2,3.
В последние годы область 3D гистологии развивалась. Здесь доступны виртуальные фрагменты тканей из любой желаемой пространственной плоскости. Это позволяет отслеживать структуры во всем образце, что приводит к более глубокому пониманию архитектуры 3D тканей и структурных изменений, связанных с различными патологиями. Разработаны различные методы для получения данных 3D-объема. Они варьируются от серийных подходов, основанных на секциях, которые используют либо световую или электроннуюмикроскопию4,5,6,7,до методов визуализации блочной визуализации, таких как епископская 3D-изображение или блок-лицо сканирования электронной микроскопии7,8,9. Однако все упомянутые методы включают либо разделив, либо полностью уничтожают образец, что не позволяет провести дальнейшие исследования. Полученное разрешение в большой степени зависит от процесса секционирования, подверженного артефактам, как описано в обычной гистологии. Эти методы страдают также от артефактов выравнивания.
3D-методы рентгенографии, такие как микроскопическая и наноскопическая компьютерная томография (microCT и nanoCT), стремятся генерировать данные 3D высокого разрешения без разрушения образца ткани. До сих пор слабый контраст рентгеновского затмения мягких тканей и ограниченный доступ к высоким разрешениям в лабораторных условиях нарушали их использование для 3D визуализации микроскопических структур тканей. Последние достижения в направлении лабораторной, высокого разрешения рентгеновского КТ позволяют резолюции значительно ниже 1 мкм10,11,12,13.
Отсутствие контраста в мягких тканях в обычных рентгеновских рентгеновских снимках на основе затухания компенсируется окрашиванием, которые усиливают контраст с затуханием рентгеновских лучей. Окраженное агентов, известных из других методов визуализации, таких как тетроксид осмия (OsO4), йодный йотический йосийй (IKI) или фосхотунгстовой кислоты (ПТА) часто используются14,15,16,17, 18,19,20,21,22,23,24,25. Окрашивающие вещества, позволяющие (i) специфическое биологическое таргетирование, (ii) однородное и полное окрашивание, (iii) легкая обработка, (iv) быстрое проникновение ткани без создания артефактов, таких как диффузионные кольца, (v) большое и плотное окрашивание тканей, и (vi) Полная совместимость с гистопатологией необходимы для создания рентгеновской КТ в качестве инструмента для 3D визуализации микроскопических структур ткани. В этой работе мы показываем, как образцы мягких тканей готовятся для рентгеновской КТ с цитоплазмой конкретных рентгеновских пятен на основе эозина, который выполняет требования, указанные выше26.
Многомасштабный подход к визуализации обеспечивает оценку качества окрашивания с помощью измерения микроквт обзора и выбора объемов интереса (VOI) для дальнейших исследований высокого разрешения. Качество окрашивания анализируется с упором на такие параметры окрашивания, как (i) полнота, (ii) появление диффузионных колец, (iii) повышение контрастности, (iv) появление артефактов КТ, таких как полосы и (v) однородность. Лабораторная установка nanoCT, которая использует геометрическое увеличение для достижения разрешений до 100 нм, визуализирует морфологию мягких тканей на (суб)-клеточном уровне10,27. Сравнительный анализ наноктических ломтиков с соответствующими изображениями гистологической световой микроскопии подтверждает размножение архитектуры тканей с аналогичной детализацией на микроскопическом уровне в 2D, что позволяет гистопатологическую характеристику ткани Образец. Этот подробный видеопротокол предназначен для повышения осведомленности и подчеркнуть потенциал этой методологии как неразрушающего 3D мягких тканей изображений инструмент, представляющий интерес для широкого научного сообщества, таких как зоологи, биологи и здравоохранения Профессионалов.
Protocol
Внимание: Пожалуйста, проконсультируйтесь со всеми соответствующими листами данных о безопасности материалов (MSDS) перед использованием. Некоторые из химических веществ, используемых в протоколе, являются остро токсичными и канцерогенными. Пожалуйста, используйте все соответствующие методы безопасности при выполнении протокола окрашивания, включая использование инженерных элементов управления (пух капот, перчаточный ящик) и средств индивидуальной защиты (защитные очки, перчатки, лабораторное пальто, брюки полной длины, обувь с закрытыми носами).
Используемые животные:
В соответствии с руководящими принципами Европейского союза 2010/63 было проведено строительство жилья для животных в клиникумском рехт-дер-Исаре, В Мюнхенском техническом университете. Удаление органов было одобрено внутренним комитетом по защите животных Klinikum rechts der Isar, Мюнхен, Германия (внутренний номер ссылки 4-005-09). Все процедуры соответствуют соответствующим руководящим принципам и положениям. Все лаборатории проверяются в соответствии с принципами передовой лабораторной практики ОЭСР.
1. Протокол окрашивания эосина
- Чтобы зафиксировать образцы мягких тканей, заполните 50-мл центрифуги с фиксаторным раствором, содержащим 9,5 мл 4% (v/v) раствор формальдегида (FA) и 0,5 мл ледниковой уксусной кислоты (AA).
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка раствора FA только что из 37% кислоты свободной РАСТВОР FA стабилизировалась с приблизительной 10% метанола. Разбавить раствор FA дальше с фосфатным сольников dulbecco (DPBS). Выберите DPBS без кальция и магния. Держите разбавленный раствор FA не более одного месяца. Во время подкисления рН фиксаторного раствора меняется с нейтрального примерно до 3.
ВНИМАНИЕ: Поскольку FA является острым органом токсичных, коррозионных и канцерогенных, использование дыма капот является обязательным и соответствующее защитное личное оборудование должно быть использовано.- Добавьте свежеудаленный образец мягкой ткани в 50-мл центрифуги трубки и охладите 50-мл центрифуги трубки для 24-72h.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь. - Вымойте образец мягкой ткани с помощью dPBS раствор для 1h.
- Добавьте свежеудаленный образец мягкой ткани в 50-мл центрифуги трубки и охладите 50-мл центрифуги трубки для 24-72h.
- Чтобы ощутить фиксированный образец мягкой ткани (например, целую почку мыши), поместите мягкую ткань в 2 мл эозина Y-окрашивающего раствора и инкубация образец для 24 ч. Держите образец на горизонтальной встряхивания пластины для плавного качания (около 60 об/ ч) во время инкубационного раствора Процесс.
ПРИМЕЧАНИЕ: Eosin Y-окрашивание раствор имеет концентрацию 30% (w/v) в дистиллированной воде. Выберите объем окрашивающего раствора таким образом, чтобы образец был полностью покрыт раствором окрашивания и позволял образцу свободно перемещаться в контейнере образца. Время инкубации может отличаться для других образцов и должно быть соответствующим образом скорректировано. - После окрашивания, удалить мягкий образец ткани тщательно из образца контейнера.
- Тщательно удалите избыток окрашивающего агента с помощью целлюлозной бумаги.
- Поместите образец мягких тканей в конический контейнер образца выше фазы пара этанола для хранения и дальнейшего использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Контейнер конического образца должен всегда содержать несколько капель 70% (v/v) этанола в нижней части трубки, чтобы сохранить образец мягкой ткани влажным и предотвратить артефакты.
2. Рентгеновская микроктвальное изображение
ПРИМЕЧАНИЕ: Рентгеновские измерения микроКТ были выполнены с помощью микрокт-сканера, который предлагает обзорные измерения КТ (возможность изображения всего образца в поле зрения (FOV)) и производительность измерений КТ с высоким разрешением (способность фокусироваться на на один желаемый объем интереса (VOI) той же выборки до 1 мкм.
- Установите образец мягкой ткани к соответствующему держателю образца. Убедитесь в плотной пригонке образца на держатель образца, чтобы предотвратить перемещение образца во время измерений рентгеновской КТ.
- В случае запятнанной почки мыши: Подготовьте держатель образца с 2 центрифугами пробками, whereby дно одной пробки cut off. Склейте две центрифуги трубки вместе с помощью двухкомпонентного клея. Обеспечить прямое выравнивание центрифуговых труб вокруг оси вращения. Подождите, пока клей затвердеет.
- Как только держатель образца готов к использованию, перенесите почку мыши в нетронутую центрифугу трубки, которая содержит несколько капель 70% (v/v) этанола в нижней части трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стабильность образца имеет решающее значение. Наймите время, чтобы подготовить образец для рентгеновских измерений КТ. Образец мягких тканей хранится в фазе пара этанола, чтобы сохранить образец влажным во время рентгеновских измерений КТ и предотвратить усадку мягких тканей и другие артефакты. Образец мягких тканей не должен находиться в контакте с растворителем, чтобы избежать накопления растворителя вокруг образца во время измерения рентгеновской КТ, что может привести к движению образца во время измерения или может вызвать проблемы во время реконструкции. Если держатель образца не позволяет удерживать растворитель на дне, в держатель образца может быть помещена целлюлоза, смоченная с помощью 70% (v/v) этанола. Следует отметить, что артефакты усадки из-за растворителя этанола не наблюдались.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь.
- После тщательного выравнивания образца выберите параметры приобретения для наилучшего качества изображения. В случае представленных данных микроКТ, получить сканирование при пиковом напряжении 50 кВ, ток 3,5 Вт с использованием 1601 проекции равномерно распределены более 360 ".
ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры приобретения для обзора КТ были выбраны для лучшего качества изображения. Таким образом, цель камеры 0.39x была выбрана для охвата всей выборки в поле зрения (FOV). Это привело к эффективному размеру пикселей 12 мкм. Время экспозиции 2 с на проекцию обеспечивало хорошее соотношение сигнала к шуму. Рентабельность инвестиций для КТ с высоким разрешением была идентифицирована с помощью данных микрокТ, полученных в ходе сканирования обзора. Сканеры MicroCT часто включают в себя интегрированный программный инструмент, который позволяет точно подбирать определенную рентабельность инвестиций. Для данных СНВ с высоким разрешением была выбрана цель 4x камеры, в результате чего размер пикселя составил 3,3 мкм. Здесь требовалось время экспозиции 15 с на проекцию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь. - После получения данных рентгеновского КТ обработайте прогнозы соответствующим образом для реконструкции 3D-тома. В случае представленных данных микрокТ: Реконструкция рентгеновских КТ данных с интегрированным программным обеспечением.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объемвизуализации данных микроКТ, показанных на рисунке 1 и рисунке 2, были созданы с помощью программного обеспечения визуализации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь.
3. Рентгеновская нанокт-изображение
ПРИМЕЧАНИЕ: Рентгеновский нанокт сканер был разработан inhouse. Прибор без объектива оснащен нанофокусным рентгеновским источником и однофотональным детектором для подсчета. 3D-данные с разрешениями до 100 нм могут быть сгенерированы10. Как правило, нанокомпьютерные системы, в том числе с рентгеновской оптикой, доступны на коммерческой основе и не ограничиваются описанным сканером nanoCT.
- Подготовка образца NanoCT
- Подготовка VOIs образца мягкой ткани. Разрежьте мягкую ткань на очень маленькие кусочки длиной около 0,5 мм с помощью скальпеля и стереомикроскопа. В случае мышиной почки: Разрежьте почку мыши на две половинки вдоль самой длинной оси. Возьмите половину мышиной почки и подготовьте различные анатомические области, такие как почечная кора и почечная медулла.
ПРИМЕЧАНИЕ: Другая половина мыши почки была перенесена в гистопатологию, где образец был встроен в парафин и обработан соответственно, чтобы дать типичные гистологические разделы, как видно на рисунке 3c и Рисунок 3d . - Перенесите мелкие кусочки перед первым шагом обезвоживания в новое блюдо Петри, где они остаются для всех последующих шагов.
- Обезвоживать пробы с использованием концентраций (все v/v) в %: 50, 60, 70, 80, 90, 96 и 100 этанола, уравновешенных дистиллированной водой. Выполните каждый шаг обезвоживания в течение 1 ч каждый.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь. Храните мелкие кусочки ткани в 100% этанола на ночь. - Критическая точка сухая (CPD) мелкие кусочки ткани.
ПРИМЕЧАНИЕ: Применение CPD позволяет полное обезвоживание образца ткани путем обмена растворителя (здесь этанол) с сухим агентом (здесь CO2). Это было необходимо для обеспечения того, чтобы образец может быть установлен на образцы держателей nanoCT, не движется во время измерения и может быть расположен очень близко к источнику рентгеновского, чтобы обеспечить лучшее геометрическое увеличение. Установка nanoCT основана на простом геометрическом увеличении, при этом коэффициент увеличения определяется как расстояние от источника к детектору над расстоянием между исходом к образцу. Техника сушки была впервые введена Андерсоном для сохранения 3D-структуры биологических образцов для электронной микроскопии28. Обзор техники обеспечивается Bray29.- Заполните вакуумную камеру 100% этанолом. Перенесите мелкие кусочки ткани в микропористые капсулы и поместите ее в вакуумную камеру CPD. Закройте систему.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку высокое давление участвует в процессе CPD, убедитесь, что все части CPD, в частности фитинги, нетронутыми и система должным образом закрыта. - Охладите камеру до 6-8 градусов и заполните жидким CO2.
- При помешивании, подождите 3 минуты, чтобы обеспечить надлежащее смешивание двух компонентов. Аккуратно слейте камеру. Убедитесь, что держатель образца по-прежнему покрыт растворителем. Повторите этот шаг десять раз, чтобы позволить полную замену этанола с CO2 в образце.
- После окончательного заполнения камеры CO2,тепла машины до критической точки CO2 (31 C и 73.8bar), а затем очень медленное освобождение газоемких CO2 в течение времени 30 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выпуск газа должен осуществляться очень медленно, так как в противном случае на образце может образовываться конденсированная вода. Убедитесь, что температура не опускается ниже критической точки CO2. Откройте машину CPD только тогда, когда все давление было выпущено из системы. - Удалите кусочки ткани CPD быстро из машины и держать их в новой чашке Петри хранится в desiccator до дальнейшего использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь.
- Заполните вакуумную камеру 100% этанолом. Перенесите мелкие кусочки ткани в микропористые капсулы и поместите ее в вакуумную камеру CPD. Закройте систему.
- Подготовка VOIs образца мягкой ткани. Разрежьте мягкую ткань на очень маленькие кусочки длиной около 0,5 мм с помощью скальпеля и стереомикроскопа. В случае мышиной почки: Разрежьте почку мыши на две половинки вдоль самой длинной оси. Возьмите половину мышиной почки и подготовьте различные анатомические области, такие как почечная кора и почечная медулла.
- Установите кусочки ткани CPD к соответствующему держателю образца. Убедитесь в плотной пригонке образца на держатель образца, чтобы предотвратить перемещение образца во время измерений КТ. В случае CPD мыши ткани почки частей: Клей ткани кусочки с суперклеем к образцу держателя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Любое нежелательное движение образца во время измерений КТ может вызвать проблемы во время реконструкции объема - особенно при приобретении набора данных с размером вокселя нанометра.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь. - После тщательного выравнивания образца выберите параметры приобретения для наилучшего качества изображения. В случае представленных данных nanoCT: Приобрести прогнозы при пиковом напряжении 60 кВ с 1599 проекциями, равномерно распределенными более чем на 360 "и вокселя размером примерно 400 нм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Одно измерение КТ, приобретенное при размере вокселя 400 нм, имеет FOV 75 мкм в направлении оси вращения (вертикального) и приблизительно 560 мкм в направлении перпендикулярно оси вращения (горизонтальная). Для исследования больших объемов расширение FOV вдоль оси вращения может быть достигнуто путем объединения нескольких сканирований в разных вертикальных положениях. Кроме того, локальная томография может быть выполнена для измерения образцов с большим диаметром образца перпендикулярно оси вращения, чем дано FOV глобальной КТ. Данные наноКТ были получены со временем экспозиции 4 с на проекцию. Таким образом, общее время приобретения на набор данных составило примерно 3,5 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь. - После получения данных КТ обработайте прогнозы соответствующим образом для реконструкции 3D тома.
- В случае представленных данных nanoCT нормализуют приобретенные проекции с плоскими изображениями. Увеличьте резкость проекций с помощью алгоритма деконволюции Ричардсона-Люси30,31. Используйте вращательно симметричную гауссовскую функцию со стандартным отклонением одного пикселя в качестве ядра деконволюции.
- Примените алгоритм фазового поиска Паганина на заточенные изображения, чтобы увеличить контраст мягких тканей. Установите параметры алгоритма для оптимизации качества изображения32. Реконструкция предварительно обработанных проекций с помощью современного алгоритма фильтрации обратной проекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рисунок 3 оценивает полученные данные наноКТ с соответствующими гистологическими секциями, толщина которых составляла около 7 мкм. Таким образом, минимальная интенсивность проекции ломтики 18 смежных наноCT ломтики с виртуальной толщиной около 7 мкм были созданы путем расчета минимального значения для каждого пикселя в соответствующих ломтиков. Для визуализации был использовано программное обеспечение для визуализации объема данных nanoCT, которые отображаются на рисунке 4.
Representative Results
На рисунке 1 показаны срезы КТ и объемная визуализация данных микроКТ с низким разрешением, подчеркивающие повышение контрастности после окрашивания. На рисунке 2 показаны фрагменты КТ и объемная визуализация данных микрокТ высокого разрешения, полученных из местной томографии всей мышиной почки. На рисунке 3 показаны фрагменты данных наноКТ по сравнению с соответствующими гистологическими секциями. На рисунке 4 показана кТ-срез и объемная визуализация данных nanoCT, подчеркивающих структурные детали на клеточном уровне. Измерение микроКТ с низким разрешением позволяет провести обзор всего органа и помогает определить объемы, представляющие интерес (VOI) для измерения микроКТ с высоким разрешением. Благодаря этому многомасштабному подходу определяется VOI для nanoCT. НаноКТ позволяет очень детально просматривать образец мягких тканей на клеточном уровне. Сравнительное исследование с соответствующим гистологическим разделом подчеркивает полную совместимость с гистопатологией. В данном отношении мультимодальный подход к визуализации подтверждает результаты, полученные с помощью обоих условий.
Рисунок 1. Срезы КТ и объемная визуализация данных микроКТ с низким разрешением. (a,b) Обзор изображения той же мышиной почки до и после окрашивания, соответственно, подчеркивая повышение контраста, полученное после применения эозина на основе протокола окрашивания. Оба набора данных microCT были приобретены с использованием одинаковых параметров приобретения. Размер вокселя в обоих наборах данных составляет 12 мкм. Усиление контраста, достигнутое в(b) позволяет идентифицировать следующие анатомические структурные области: Cortex (I), внешнюю медулу (II) с дальнейшим отличием во внешних полосах внешней медуллы (IIa) и внутренних полос наружной медуллы (IIb), внутренняя медулла (III), сосочка (IV) и почечный таз (V). (c) Объем рендеринга данных microCT, показывающих виртуальный сечение sagittal через всю почку мыши. Эта цифра была изменена от Busse и Мюллер и др.26Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2. Срез КТ и объемная визуализация данных микроКТ высокого разрешения, полученных из одной и той же мышиной почки после применения разработанного протокола окрашивания на основе эосина. ()В левом углу показан обзор microCT изображения подчеркнув рентабельность инвестиций (синий ящик) для отображаемого изображения с высоким разрешением. Идентифицируются следующие анатомические структурные области: Кортекс (I), внешняя медулла (II) с дальнейшим отличием во внешних полосах внешней медуллы (IIa) и внутренних полос внешней медуллы (IIb), внутренней медуллы (III), незначительной каликсе (IV) и сосудах (V и VI). (b)Объем процентной визуализации данных микрокТ высокого разрешения, полученных с размером вокселя 3,3 мкм. Показана область медуллы и виртуальная секция через сосуд, полученный из местной томографии всей почки. Эта цифра была изменена от Busse и Мюллер и др.26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3. КТ-ломтики нанокт-данных (a,b) по сравнению с гистологическими секциями (c,d), полученными из одной и той же мышиной почки после применения разработанного протокола окрашивания на основе эозина. () Нано-изображение того же образца мыши почки после окрашивания, вскрытия и CPD показывает подробные структуры региона (IIb) видели на рисунке 1 и рисунке 2. Они известны как толстые восходящие конечности петли Хенле. (b)Минимальная интенсивность проекции ломтик, полученный из того же набора данных nanoCT показано в() с виртуальной толщиной ломтик атлет примерно 7 мкм, что позволяет четковизуем ядер клетки. (c)Представитель гистологический раздел отображения толстых восходящих конечностей петли Хенле с четкой визуализацией ядер клеток и кисти границы. Гистологический сечение имеет приблизительную толщину 7 мкм и было получено из того же образца мышиной почки после нанесения эросинового окрашивания и встраивания в парафин-блок. (d)Представитель гистологический раздел с применением счетчика пятен гематоксилин подчеркнув ядра клетки в фиолетовый. Подготовка гистологического участка рядом с разделом, показанным в(c)с приблизительной толщиной 7 мкм. Эта цифра была изменена от Busse и Мюллер и др.26Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4. Срез КТ и объемная визуализация данных наноCt. () Нано-изображение того же образца мыши почки, показывающие структуры, известные как толстые восходящие конечности петли Хенле. Это детальное представление региона (IIb), увиденного на рисунке 1 и рисунке 2, полученном из небольшого куска почки с размером вокселя около 400 нм. Подготовка образца включала окрашивание, вскрытие и CPD. (b) Объемная визуализация данных nanoCT, визуализирующих 3D-структуру толстых восходящих конечностей петель Хенле. Эта цифра была изменена от Busse и Мюллер и др.26Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Discussion
В настоящее время эозин используется в качестве стандартного гистологического протокола для обозначения цитоплазмы клеток. Окрашивающий агент применяется в виде 0,1% (w/v) водиного раствора к микроскопическим ломтикам мягких тканей (обычно вырезанным с толщиной 2-10 мкм)33. Применение этого стандартизированного гистологического протокола к 3D-образцам тканей, таким как целая почка мыши, не приводит к ослаблению контраста, улучшенного КТ-изображения. С одной стороны, это можно объяснить низкими свойствами затухания мягких тканей для обычно используемых рентгеновских энергий лабораторных микрокт-систем. Как правило, мягкая ткань состоит в основном из углерода, водорода, кислорода и азота34, и, следовательно, не приводит к повышению контраста. С другой стороны, низкая концентрация эозина, используемого для окрашивания, является ограничивающим фактором. Несмотря на то, что одна молекула эозина содержит четыре атома брома брома брома с высоким атомным числом (высокое атомное число брома с бромом 3534евро), уровни чувствительности, необходимые для рентгеновской КТ,изображения, не были выполнены.
Для преодоления этой проблемы низкого контраста затухания было исследовано несколько концентраций эозина. Ограничение здесь максимальная растворимость эосина в воде, которая составляет 30% (w/v) в водном растворе. Лучшее повышение контрастности в мягких тканях наблюдалось с самой высокой концентрацией эосина, которая ожидалась в соответствии с Законом Ламберта-Пива. Поэтому протокол окончательного окрашивания был выполнен с наивысшей концентрацией.
На вопрос о том, как оптимально подготовить мягкую ткань на молекулярном уровне для процедуры окрашивания для дальнейшего улучшения контрастности, был дан ответ корректировкой рН. Здесь было установлено, что подкисление образца мягких тканей во время фиксации или перед окрашиванием имеет решающее значение. Это было также показано Hong et al.35. Более высокое накопление окрашивающего агента в клеточной цитоплазме кислотой было достигнуто за счет улучшения ионных взаимодействий, которые были результатом протонации аминокислотных боковых цепей белков и пептидов, присутствующих в цитоплазме клетки. Репрезентативный результат, подчеркивающий повышение контраста по сравнению с неокрашенным образцом мягкой ткани, показан на рисунке 1a,b. Здесь был достигнут структурный обзор целой мышиной почки, визуализирующей важнейшие анатомические области, такие как кора головного мозга, медулла, сосочка и почечный таз.
Представленный протокол окрашивания прост в применении и содержит только три шага. Необходимые реагенты легко доступны. Общее время окрашивания 24 часов быстро для всего органа окрашивания, что позволяет 3D визуализации мягких тканей образцов(Рисунок 1c, Рисунок 2b и Рисунок 4b) в лабораторной среде на множественных масштабов до клеточного уровня. Следует отметить, что общее время окрашивания и объем необходимого решения для окрашивания может потребовать некоторых приспособлений в зависимости от характера образца. Тем не менее, протокол окрашивания на основе эозина подходит для окрашивания цельноорганов, что позволяет затем микрокТ изображения целых органов с высоким разрешением. Усадочные артефакты из-за растворителя этанола, который использовался для поддержания влажного образца во время измерений микроКТ, не наблюдались. Дополнительные шаги подготовки необходимы для нано-изображения, что позволяет для исследования мелких частей ткани, извлеченных из первоначального образца. Что касается будущих гистопатологических приложений, обзор сканирования даст ценную информацию об измененных анатомических регионах и структурах, которые позволяют определение ROIs, как показано на рисунке 2a. Они могут быть изучены в 3D по microCT(Рисунок 1c и Рисунок 2b) или nanoCT(Рисунок 4b) и оценены в 2D с гистологией(рисунок 3).
Еще одна сила протокола проявляется в полной совместимости с гистопатологией в отношении процедуры окрашивания Н И Е. Применение процедуры окрашивания на основе эозина на массовые пробы не препятствует дальнейшим гистологическим исследованиям(рисунок 3),даже несмотря на то, что прикладная концентрация эозина намного выше по сравнению с гистологическим раствором окрашивания. Наноct с виртуальной толщиной около 400 нм(рисунок 3а)сравнивает уже очень хорошо с гистологическим сечением(рисунок 3c),который был получен из соответствующего образца мягких тканей. Учитывая приблизительную толщину гистологического участка с 7-10 мкм, генерация срезов проекции минимальной интенсивности данных nanoCT(рисунок 3b),которые соответствуют виртуальной толщине около 7 мкм, позволяет лучшее сравнение с гистологическим разделом(рисунок 3c). Здесь, ядра клетки ясно показаны как non-attenuation зона по мере того как eosin специфически пятна протеины и пептиды в цитоплазме клетки33.
Возможно применение дальнейшего противокосяния с помощью стандартных гистологических методов, даже несмотря на то, что порядок окрашивания по сравнению со стандартной процедурой гистологического окрашивания был обращен вспять. Начиная сначала с разработанного эозина на основе окрашивания протокол для КТ, а затем счетчик окрашивания этих эозина основе гистологических разделов с гематоксилином, позволяет полную совместимость и приводит к высококачественной окрашивания отображения ожидаемой форме внешнего вида. Клеточные ядра-специфические окрашивания с кисло-гематоксилин Майер был применен к гистологической секции подчеркнув ядра клетки в фиолетовый (Рисунок 3d). Применение гистологического противокосяния в настоящее время ограничивается H-пятно. Другие стандартные гистологические противогарые окрашивания, такие как база периодической кислоты Шиффа, Elastica ван Gieson или Гомори серебро должны быть оценены, а также совместимость с иммуногистологических методов должны быть проверены.
Протокол окрашивания на основе эосина позволяет (i) клеточной цитоплазмы конкретных ориентации, (ii) однородной и полной окрашивания, (iii) легкой реализации, (iv) быстрое проникновение ткани без создания артефактов, таких как диффузионные кольца, (v) окрашивание большие и плотные образцы мягких тканей, и (vi) полная совместимость с гистопатологией в отношении пятна Н и E. Эти требования важны для того, чтобы с высоким разрешением рентгеновская КТ визуализация мягких тканей вплоть до клеточного уровня. В сочетании с недавно разработанными устройствами nanoCT12,36,37, неразрушающее поколение виртуальных гистологических ломтиков, которые сопоставимы по контрасту и разрешению с обычными гистологическими данными становится возможным. Этот комбинированный подход позволит создать рентгеновскую КТ как ценный инструмент для 3D визуализации микроскопических структур тканей.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим д-ра Энкена Дреколла за гистологические дискуссии и чрезвычайно полезную команду в Excillum AB, Швеция. Мы признаем финансовую поддержку через DFG Кластер передового опыта Мюнхен центр передовой фотоники (MAP) и DFG Готфрид Вильгельм Лейбниц программы. Кроме того, этот исследовательский проект получил финансирование от европейского союза Horizon 2020 научно-исследовательской и инновационной программы в соответствии с Марий Склодовска-Кюри Грант Соглашение No. H2020-MSCA-IF-2015-703745-CONSALT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50-ml centrifuge tube by Falcon | VWR | 734-0453 | |
| Formaldehyde solution, 37% | Carl Roth | CP10.2 | acid-free, stabilized with ~10% MeOH |
| Glacial acetic acid | Alfa Aesar | 36289.AP | |
| Eosin Y disodium salt | Sigma-Aldrich | E4382 | certified by Biological Stain Commission |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | L1825 | Dulbecco's formualtion, w/o calcium and magnesium |
| Sample Tubes by Nalgene | Carl Roth | ATK5.1 | |
| Rocking Shaker ST5 | CAT | 60281-0000 | |
| Cellulose tissue paper | VWR | 115-0600 | |
| Forceps, by USBECK Laborgeräte | VWR | 232-0096 | |
| Microcentrifuge tubes by Eppendorf | VWR | 211-2120 | safe-lock, 2.0 ml |
| Ethanol absolute by Baker Analyzed | VWR | 80252500 | |
| Disposable safety scalpel by Aesculap | VWR | AESCBA210 | |
| Petri dish by Sterilin | VWR | 391-2019 | |
| Plastic pasteur pipette | Carl Roth | EA68.1 | graduated, 1 ml |
| Desiccator by Duran | VWR | SCOT247826954 | |
| Silicone grease by Bayer | Sigma-Aldrich | 85404 | high-vacuum |
| Carbon dioxide cylinder with standpipe | Linde | 3700113 | 10 kg, short |
| micro-porous treatment capsule | PLANO GmbH | 4614 | pore size 78 µm (B) |
| Bal-Tec CPD 030 | Bal-Tec AG | CO2 as drying agent | |
| Stemi 2000-C stereomicroscope with KL 1500 LCD | Zeiss | this stereomicroscope has been updated(1) | |
| Zeiss Xradia Versa 500 | Zeiss | this microCT scanner has been updated(2) | |
| Avizo Fire 8.1 | Thermo Fisher Scientific | ||
| PILATUS detector as part of the nanoCT scanner | Dectris | single-photon counting detector(4,5); there are commercially availble nanoCT systems available (6,7) | |
| nanofocus X-ray source as part of the nanoCT scanner | Excillum | high-flux nanofocus X-ray transmission tube(3); there are commercially availble nanoCT systems available(6,7) | |
| (1) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS stereomicroscopes https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/Stereomikroskope/1006> (September 06, 2019). | |||
| (2) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS Xradia 510 Versa https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/zeiss-xradia-510-versa.html> (April 10, 2019). | |||
| (3) Nachtrab, F. et al. Development of a Timepix based detector for the NanoXCT project. Journal of Instrumentation 10 (11), C11009, (2015). | |||
| (4) Kraft, P. et al. Performance of single-photon-counting PILATUS detector modules. Journal of Synchrotron Radiation 16 (3), 368-375, (2009). | |||
| (5) Kraft, P. et al. Characterization and calibration of PILATUS detectors. IEEE Transactions on Nuclear Science 56 (3), 758-764, (2009). | |||
| (6) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS Xradia 810 Ultra https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/xradia-810-ultra.html> (April 9 2019). | |||
| (7) Company, G. E. GE product information: Phoenix nanotom m, https://www.gemeasurement.com/sites/gemc.dev/files/geit-31344en_nanotom_m_0517.pdf> (April 10, 2019). |
References
- Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. Theory and Practice of Histological Techniques. 7th edn. , Churchill Livingstone Elsevier. (2013).
- Chatterjee, S. Artefacts in histopathology. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 18 (4), 111-116 (2014).
- McInnes, E. Artefacts in histopathology. Comparative Clinical Pathology. 13 (3), 100-108 (2005).
- Andreasen, A., Drewes, A., Assentoft, J., Larsen, N. Computer-assisted alignment of standard serial sections without use of artificial land-marks. A practical approach to the utilization of incomplete information in 3-d reconstruction of the hippocampal region. Journal of Neuroscience Methods. 45 (3), 199-207 (1992).
- Braverman, M. S., Braverman, I. M. Three-dimensional reconstructions of objects from serial sections using a microcomputer graphics system. Journal of Investigative Dermatology. 86 (3), 290-294 (1986).
- Denk, W., Hortsmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).
- Mohun, T. J., Weninger, J. W. Imaging heart development using high-resolution episcopic microscopy. Current Opinion in Genetics and Development. 21, 573-578 (2011).
- Weninger, J. W., Meng, S., Streicher, J., Müller, G. B. A new episcopic method for rapid 3-d reconstruction: applications in anatomy and embryology. Anatomy and Embryology. 197 (5), 341-348 (1998).
- Odgaard, A., Andersen, K., Melsen, F., Gundersen, H. J. G. A Direct Method for Fast 3-Dimensional Serial Reconstruction. Journal of Microscopy. 159, 335-342 (1990).
- Müller, M., et al. Myoanatomy of the velevt worm leg revealed by labratory-based nanofocus X-ray source tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12378-12383 (2017).
- Salomon, M., Hanke, R., Krüger, P., Uhlmann, N., Voland, V. Realization of a computed tomography setup to achieve resolutions below 1 µm. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A. 591, 50-53 (2008).
- Tkachuk, A., et al. X-ray computed tomography in Zernike phase contrast mode at 8 keV with 50-nm resolution using Cu rotating anode X-ray source. Zeitschrift für Kristallographie. 222, 650-655 (2007).
- Withers, P. J. X-ray nanotomography. Materials Today. 10, 26-34 (2007).
- Jahn, H., et al. Evaluation of contrasting techniques for X-ray imaging of velvet worms (Onychophora). Journal of Microscopy. 270 (3), 343-358 (2018).
- Martins de S. e Silva, J., et al. Three-dimensional non-destructive soft-tissue visualization with X-ray staining micro-tomography. Scientific Reports. 5, 14088 (2015).
- Metscher, B. D. MicroCT for Developmental Biology: A Versatile Tool for High-Contrast 3D Imaging at Histological Resolutions. Developmental Dynamics. 238, 632-640 (2009).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
- Mitzutani, R., et al. X-Ray Microtomographic Imaging of Three-Dimensional Structure of Soft Tissues. Tissue Engineering Part C: Methods. 14 (4), 359-363 (2008).
- Pauwels, E., Loo, D. v, Cornillie, P., Brabant, L., Hoorebeke, L. v An exploratory study of contrast agents for soft tissue visualization by means of high resolution X-ray computed tomography imaging. Journal of Microscopy. 250, 21-31 (2013).
- Degenhardt, K., Wright, A. C., Horng, D., Padmanabhan, A., Epstein, J. A. Rapid 3D phenotyping of cardiovascular development in mouse embryos by micro-CT with iodine staining. Circulation: Cardiovascular Imaging. 3 (3), 314-322 (2010).
- Dullin, C., et al. μCT of ex-vivo stained mouse hearts and embryos enables a precise match between 3D virtual histology, classical histology and immunochemistry. PLOS ONE. 12 (2), 0170597 (2017).
- Jeffrey, N. S., Stephenson, R. S., Gallagher, J. A., Cox, P. Micro-computed tomography with iodine staining resolves the arrangement of muscle fibres. Journal of Biomechanics. 44, 189-192 (2011).
- Johnson, J. T., et al. Virtual Histology of Transgenic Mouse Embryos for High-Throughput Phenotyping. PLOS Genetics. 2, 61 (2006).
- Leszczyński, B., et al. Visualization and Quantitative 3D Analysis of Intraocular Melanoma and Its Vascularization in a Hamster Eye. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 332 (2018).
- Mizutani, R., Suzuki, Y. X-ray microtomography in biology. Mircon. 43, 104-115 (2012).
- Busse, M., et al. Three-dimensional virtual histology enabled through cytoplasm-specific X-ray stain for microscopic and nanoscopic computed tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2293-2298 (2018).
- Müller, M., et al. Non-destructive high-resolution 3D virtual histology enabled through a cell nucleus-specific stain for X-ray computed tomography. Scientific Reports. 8, 17855 (2018).
- Anderson, T. F. Techniques for the preservation of three-dimensional structure in preparing specimens for the electron microscope. Transactions of the New York Academy of Sciences. 13 (4), Series II 130-134 (1951).
- Bray, D. Supercritical Fluid Methods and Protocols. Methods in Biotechnology. Williams, J. R., Clifford, A. A. 13, Humana Press. 235-243 (2000).
- Lucy, L. B. An iterative technique for the rectification of observed distributions. The Astronomical Journal. 79, 745-765 (1974).
- Richardson, W. H. Bayesian-Based Iterative Method of Image Restoration. The Journal of the Optical Society of America. 62 (1), 55-59 (1972).
- Paganin, F., Mayo, S. C., Gureyev, T. E., Miller, P. R., Wilkins, S. W. Simultaneous phase and amplitude extraction from a single defocused image of a homogeneous object. Journal of Microscopy. 206, 33-40 (2002).
- Riedelsheimer, B., Büchl-Zimmermann, S. Mikroskopische Technik. Mulisch, M., Welsch, U. , Spektrum-Verlag GmbH. Berlin Heidelberg. Ch. 10 193-194 (2015).
- Hubbell, J. H., Seltzer, S. M. Tables of Xray mass attenuation coefficients and mass energy-absorption coefficients from 1 keV to 92 keV and 48 additional substances of dosimetric interest, Table 3. National Institute of Standards and Technology. , (1995).
- Hong, H. Y., Yoo, G. S., Choi, J. K. An Eosin Y Method for Protein Determination in Solution. Analytical Letters. 32 (12), 2427-2442 (1999).
- Dierick, M., et al. Recent Micro-CT Scanner Developments at UGCT. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B. 324, 35-40 (2014).
- Kastner, J., Plank, B., Heinzl, C. Advanced X computed tomography methods: High resolution CT, quantitative CT, 4DCT and phase contrast CT. Proceedings of Digital Industrial Radiology and Computed Tomography. , 120-132 (2015).
