Visualisering av Candida albicans i murine mage-tarmkanalen ved hjelp av fluorescerende in situ hybridisering

Denne protokollen har gitt noen av de beste innsiktene vi har så langt inn i hvordan Candida albicans bor i pattedyr mage-tarmkanalen. For eksempel, inntil nylig, visste vi egentlig ikke hvor Candida er lokalisert i tarmen eller hvilke av de mange morfologiske formene det forutsetter innenfor denne nisjen. Den største fordelen med denne teknikken er at den gjør det mulig å visualisere Candida i sitt naturlige miljø uten å forstyrre de tredimensjonale interaksjonene soppen har med vertsstrukturer eller med bakterier i mikrobiotaen.

Fordi tarmen er et komplekst miljø, er det svært vanskelig å modellere i laboratoriet, og derfor har det vært veldig tilfredsstillende å finne en måte å sonde Candida biologi direkte i en vertsmodell. Visse komponenter i tarmmikrobiota inkludert Candida albicans mistenkes for å spille roller i sykdommer som inflammatorisk tarmsykdom. Denne teknikken kan potensielt brukes til å diagnostisere tilstedeværelsen av spesifikke mikroorganismer i biopsiprøver hentet fra pasienter.

Mestring av gavage teknikken og evnen til å dissekere gastrointestinale segmenter uten å rive organene er viktig for å oppnå optimale resultater. For å starte, gavage hvert dyr med beregnet volum av en gitt inoculum. Fest en autoklavet dyrefôrpinne til en en milliliter sprøyte og fyll sprøyten med ett gavagevolum, og sørg for å fjerne alle bobler.

Plasser sprøyten på et sterilt underlag. For å sikre dyret, hold det ved foten av halen med den dominerende hånden og skyv den ikke-dominerende hånden opp dyrets rygg til den løse huden like bak ørene. Samle scruff sammen tett med tommelen og pekefingeren.

Plukk opp dyret ved scruff, snu den over og loop den lille fingeren av samme hånd rundt halen for å immobilisere dyret mot håndflaten. Trekk forsiktig dyrets hode slik at det er i en rett linje med kroppen. Plukk deretter opp sprøyten med den dominerende hånden og hold den vinkelrett på dyret med den buede nålen pekende ned.

Bruk nålens ball til å forsiktig hekte et indre hjørne av munnen og gå nålen langs siden av munnen til baksiden av halsen, og flytt deretter nålen til midten. Når nålens ball er på baksiden av dyrets hals, vipp nålen opp slik at den er parallell med dyrets kroppslinje og la den gli jevnt nedover halsen. Hvis nålen ikke glir jevnt ned i halsen, kan det hende at kanylen ikke plasseres riktig og trekkes tilbake for å flytte og prøve igjen.

Før nålen jevnt slik at dyret kan svelge nålen til bare noen få millimeter forblir synlige. Test at nålens ball er i magen ved å forsiktig fremme stempelet, og hvis det ikke er motstand, fortsett å levere inokulen. Trekk langsomt kanylen langsomt tilbake når inokulen er administrert og plasser dyret i buret.

Fortsett å overvåke dyret i fem til 10 minutter for tegn på arbeidsavstemt pusting eller nød, og kontroller at det gjenopptar normal aktivitet kort tid etter gavage. Hvis samme inokuleum skal brukes til neste dyr, rengjør nålen med en alkoholserviett. Hvis en annen inokuleum vil bli brukt, skift ut nålen.

Bruk stumpe tang for å klemme en del av bukhuden og insink huden og den underliggende fascia nær bunnen av bekkenet ved hjelp av saks. Utvid snittet i en U-form langs hver side av bukhulen og opp til brystkassen, og løft deretter huden ut av veien. Bruk sløve pinsett for å forsiktig trekke ut cecum fra bukhulen ved hjelp av saks for å bryte forbindelsene mellom cecum og tynn og tykktarmen.

Plasser hele cecum i en histologikassett slik at den ikke er ttwisted og legger seg flatt. Plasser den andre skumputen på toppen og lukk kassetten. Plasser deretter kassetten i en skrukorkrukke som inneholder metak.

Avgiftsdirektoratet den delen av tykktarmen som inneholder en til to fekal pellets og har en lengde mindre enn kassetten. Plasser vevet i kassetten og hold det flatt og uhåndtert. Overlegg den med den andre skumputen, lukk kassetten og legg den i melastalæren.

For hver del av tynntarmen som skal prøves, forbruker et en til to centimeter segment som inneholder noe fordøyelsesmateriale. Legg vevet i kassetten, overlegg med den andre skumputen, lukk kassetten og legg den inn i methacarn. Når du renser magen, bryte forbindelsene til spiserøret og tynntarmen.

Plasser vevet i kassetten og plasser kassetten i methacarn. La kassettene stå i eamalærløsningen ved romtemperatur i minst tre timer, men mindre enn to uker. Etter fiksering, fjern skumputene og returner hver intakte vevsdel i kassetten.

Vask deretter vevet to ganger i 35 minutter i 100% metanol, to ganger i 25 minutter i 100% etanol, og to ganger i 20 minutter i xylen. Klapp kassettene tørre på et papirhåndkle og legg dem i en ferdigsmeltet parafinvoks i to timer ved 70 grader Celsius i en hybridiseringsovn. Fjern deretter kassettene fra voksen, la overflødig voks renne og lagre dem ved romtemperatur til de er innebygd i voksblokker.

De-voks parafin innebygd histologiske seksjoner ved å sette lysbildene inn i en forvarmet krukke fylt med xylen. La krukken stå på 60 grader Celsius i 10 minutter, og kast deretter xylenvasken. Hell frisk romtemperatur xylen i krukken og gjenta inkubasjonen.

Fyll deretter krukken med 100% etanol og inkuber den ved romtemperatur i fem minutter. Etter inkubasjonen, fjern lysbildene fra krukken og lufttørk dem. For å flekke C.albicans med en fiskesonde, start med å tegne en sirkel rundt vevsdelen ved hjelp av en Pat Pen.

Pipette 50 mikroliter av sonde som inneholder hybridiseringsløsning på det faste vevet og spre det forsiktig med pipettespissen. Overlegg væsken med en hybridisering dekslerslip sørge for å hindre bobler. Deretter forsegler du lysbildene i et vanntett hybridiseringskammer og inkubere seksjonene i tre timer ved 50 grader Celsius i en hybridiseringsovn i mørket.

Etter inkubasjonen, legg vaskeoppløsningen til en Coplin-krukke. Fjern forsiktig dekkslippen fra lysbildet med tang og plasser lysbildet i vaskeløsningen. Dekk krukken med aluminiumsfolie og inkuber den ved 50 grader Celsius i 20 minutter.

Vask deretter lysbildene ved å helle av vaskeoppløsningen og fylle på krukken med PBS. Hell straks av og fyll på med fersk PBS som gjentar prosessen for totalt to vasker. Vek bort PBS med en delikat oppgavesletting og sirkle tarmvevsdelen med en Pat Pen.

Plasser lysbildene i en ugjennomsiktig plastbeholder og tilsett 50 mikroliter av mucinkjerners fargingsløsning til vevseksjonen. Dekk beholderen med aluminiumsfolie og inkuber den ved fire grader Celsius i 45 minutter. Etter inkubasjonen legger du lysbildene i en Coplin-krukke og vasker dem to ganger med PBS.

Trykk bort overflødig PBS på et papirhåndkle og vek deretter bort de siste dråpene med et vev. Legg en dråpe monteringsmedium på hver seksjon og legg den over med en glassdekslerslip som sørger for å forhindre bobler. La monteringsmediet spre seg under hele dekkslippen.

Forankre dekkslipsen på plass med neglelakk i hjørnene og bilde lysbildene ved hjelp av et fluorescerende mikroskop. Denne protokollen kan brukes til å fluorescerende merke C.albicans in vitro og i vertsvev. In vitro forplantet hyphae, runde gjærceller, tarmceller og ugjennomsiktige celler ble faste, gjennomsyret og preget av fluorescens og fasekontrastmikroskopi.

Rund gjær og svært langstrakt hyphae ble avbildet i musen tykktarmen. Vertsvev ble farget med C.albicans spesifikk sonde eller panfungal sonden. C.albicans ble merket rød, vert celle kjerner blå, og slimlaget grønt.

C.albicans ble oppdaget i forskjellige segmenter av murine GI-kanalen, inkludert regionene umiddelbart ved siden av vertsslimhinnen og mer sentrale regioner i tarmlumen. For forskere som ikke tidligere har utført gavage teknikken, er det viktig å få spesialisert opplæring før du prøver denne metoden. Etter fiskefarging kan immunofluorescerende teknikker brukes til å flekke flere funksjoner i vertsslimhinnen.

Dette kan tillate karakterisering av vevsskade eller immunresponser fra verten. Denne teknikken har gjort det mulig for oss å karakterisere forholdet mellom soppcellemorfologi av Candida albicans mutanter og overlevelse i verten som videreforekter vår forståelse av Candida albicans biologi som kan utnyttes når du utvikler terapier.