Abbiategrasso Brain Bank Protocol for innsamling, behandling og karakterisering av aldrende hjerner

Summary

Denne protokollen beskriver en metode for å spore individuelle hjernealdringsbaner gjennom et hjernedonasjonsprogram og riktig karakterisering av hjernen. Hjernedonorer er involvert i en langsiktig langtidsstudie, inkludert serielle flerdimensjonale vurderinger. Protokollen inneholder en detaljert beskrivelse av hjernebehandling og en nøyaktig diagnostisk metodikk.

Abstract

I en stadig aldrende befolkning forventes forekomsten av nevrodegenerative lidelser å stige. Å forstå sykdomsmekanismer er nøkkelen til å finne forebyggende og kurative tiltak. Den mest effektive måten å oppnå dette på er gjennom direkte undersøkelse av sykt og sunt hjernevev. Forfatterne presenterer en protokoll for å oppnå, behandle, karakterisere og lagre hjernevev av god kvalitet donert av personer registrert i et antemortem hjernedonasjonsprogram. Donasjonsprogrammet inkluderer en ansikt-til-ansikt empatisk tilnærming til mennesker, en samling av komplementær klinisk, biologisk, sosial og livsstilsinformasjon og serielle flerdimensjonale vurderinger over tid for å spore individuelle baner av normal aldring og kognitiv nedgang. Siden mange nevrologiske sykdommer er asymmetriske, tilbyr hjernebanken vår en unik protokoll for å kutte ferske prøver. Hjernedeler av begge halvkuler er vekselvis frosset (ved -80 °C) eller fast i formalin; et fast stykke på den ene halvkule tilsvarer en frossen på den andre halvkule. Med denne tilnærmingen kan en fullstendig histologisk karakterisering av alt frossent materiale oppnås, og omics-studier kan utføres på histologisk veldefinerte vev fra begge halvkuler og dermed tilby en mer fullstendig vurdering av nevrodegenerative sykdomsmekanismer. Korrekt og bestemt diagnose av disse sykdommene kan bare oppnås ved å kombinere det kliniske syndromet med nevropatologisk evaluering, noe som ofte legger til viktige etiologiske ledetråder som er nødvendige for å tolke patogenesen. Denne metoden kan være tidkrevende, dyrt og begrenset som det bare dekker et begrenset geografisk område. Uavhengig av begrensningene kan den høye graden av karakterisering det gir være givende. Vårt endelige mål er å etablere den første italienske hjernebanken, samtidig som vi understreker viktigheten av nevropatologisk verifiserte epidemiologiske studier.

Introduction

Ifølge WHO lider om lag 50 millioner mennesker for tiden av demens, et tall som forventes å tredobles innen 2050. Alzheimers sykdom er den viktigste årsaken til demens, etterfulgt av cerebrovaskulær sykdom og andre aldersrelaterte nevrodegenerative lidelser. I 2017 utviklet WHO Global Dementia Observatory for å øke bevisstheten om demens og oppmuntre til en global handlingsplan mot det¹. Hver enkelt har sin egen hjerne aldring bane, derfor kan søket etter kur være utfordrende på grunn av kompleksiteten i patogenesen av nevrodegenerative sykdommer. Kanskje har hver person sin egen patogenese skrevet i hjernevevet som krever en personlig tilnærming. Dermed vil studiet av hjernevev være nøkkelen til å forstå mekanismene for nevrodegenerasjon.

Når vi ser tilbake på nevrovitenskapens historie, innser vi at de mest imponerende og banebrytende funnene aldri kunne ha skjedd uten direkte undersøkelse av den menneskelige hjerne. Gjennom tiden har kilden til hjernevev som skal studeres endret seg fra rå disseksjoner, tilfeldige "tilfeldige "tilfeldige møter" og i noen tilfeller ulovlig handel, til organiserte hjernesamlinger og strategiske moderne hjernebanker. Vurderingen av mange etiske aspekter er en av de viktigste faktorene som differensierer moderne hjernebanker fra fortidens hjernesamlinger. Den første virkelige moderne Brain Banks (BBs) ble innført i^th andre halvdel av 1900-tallet. Nicholas Corsellis og Wallace Tourtelotte kan betraktes som pionerer innen moderne hjernebank. I Storbritannia samlet Corsellis en samling som holder over 1000 veldokumenterte hjerner påvirket av ulike psykiske og nevrologiske lidelser². Videre bidro Corsellis til å avsløre behovet for å bevare friskt hjernevev i is på grunn av biokjemiske tester³. I mellomtiden i USA introduserte Wallace Tourtelotte antemortem hjernedonasjonsprogrammer for å lette oppfordringen til potensielle hjernedonorer og sikre at hjernene som samles inn, ledsages av en komplett medisinsk og nevrologisk historie^4,5. For en historisk oversikt over hjernesamlinger og moderne BBs, se Carlos et al. ⁶.

Så hvorfor trenger vi fortsatt menneskelige hjerner? Hjernesykdommer kan bare gis en klar diagnose etter nevropatologisk undersøkelse. Nevropatologi utfordrer den kliniske diagnosen, og er nøkkelen til en korrekt tolkning av de kliniske symptomene og oppdagelsen av de histologiske basene til nye syndromiske varianter. Faktisk kan diagnosen omdefineres basert på det patologiske bildet. Likevel har obduksjonsraten gått ned de siste tiårene på grunn av nylig utvikling av innovative neuroimaging teknikker. Gjennom hjerneavbildning kan de morfologiske, funksjonelle og metabolske endringene i hjernen, samt omfanget av protein misfolding, vurderes in vivo. In vivo neuroimaging og andre biomarkørstudier kan imidlertid bare gi et "estimat" av det patologiske bildet, da de ikke klarer å oppdage subtile cellulære og molekylære endringer. Fremskritt innen molekylær avbildning og oppdagelsen av nye biomarkører, målmolekyler og tracers⁷ (f.eks. amyloid, TAU, mikrogliale sporstoffer) gjør den menneskelige hjernen enda mer uunnværlig for tolkning av data hentet fra kliniske evalueringer og biomarkørtesting. Videre omics teknologier (genomikk, epigenomi, transkripsjonsmikromikk, metabolomics, proteomics, lipidomics, etc.), utført på frisk og frossen hjernevev, åpnet opp nye muligheter for å forstå sykdomsmekanismer og oppdage risikogener, nye diagnostiske og prognostiske markører, og potensielle narkotika mål^8,9,10,11,^{12,13,14,15,16,17,18,19,20,,21,22,23}.

For disse formålene arkiverer moderne BBs godt karakteriserte hjernevev av høy kvalitet, noe som gjør dem tilgjengelige for det vitenskapelige^{samfunnet 3,24}. Hjernene levert av BBs bør ledsages av en fullstendig klinisk historie. Aktiviteten til en BB inkluderer følgende: (1) Anerkjennelse og rekruttering av syke og friske individer til hjernedonasjonsprogrammer; den ideelle betingelsen ville være å oppnå en tverrfaglig oppfølging av givere gjennom hele livet for å oppnå en komplett klinisk, livsstil og sosial historie, og biomarkør profiler; faktisk, kognitiv reserve og hjernestruktur avhenger av livsstil og sosio-pedagogiske^{faktorer 25,26}, så denne informasjonen beriker de totale dataene for hånden. (2) Oppkjøp av hjernen (bestående av cerebrum, lillehjernen og hjernestammen) og relaterte vev (f.eks. ryggmarg, kranialnerver og ganglia osv.) etter donorens død, samtidig som standardiserte juridiske og etiske forskrifter overholdes. (3) Riktig behandling (disseksjon, fiksering, frysing) av hjernen, som definert i en standardisert operativ protokoll, for å oppnå høy kvalitet vev og for å tillate fremtidig bruk i tverrfaglig forskning. (4) Detaljert nevropatologisk karakterisering som gir en endelig bestemt diagnose. (5) Lagring og distribusjon av vevsmateriale til forskningsmiljøet^27,,28.

Alle BBs lagrer både frosne og formalin-fast-parafin innebygd vev. Hver BB har sin egen protokoll. Bortsett fra spesielle studier, som den bihemisfæriske kutteprotokollen til Biomedical Research Institute (New Jersey)²⁹ og Deramecourt's studie av cerebrovaskulær patologi^30,kuttet de største BBs i verden bare cerebrum, lillehjernen og hjernestammen langs midtlinjen (skyttenplan). Den ene halvdelen dissekeres frisk og deretter frosset for biokjemiske studier, mens den andre er fast i formalin for histopatologisk vurdering. Så utføres biokjemiske og histopatologiske analyser separat på hver halvkule. Beslutningen om hvilken side som er fast eller frosset (lateralitet), avhenger av entall bank^{31,32,33,34,35}. Så mange nevrologiske sykdommer er asymmetriske, tilbyr vår BB en unik protokoll for kutting av friske hjerner: tilstøtende deler av hjernestammen og hver halvkule er vekselvis faste og frosne; et fast stykke på den ene halvkule tilsvarer en frossen på den andre halvkule. Gjennom denne metoden er bruk av hjernevev optimalisert, og en fullstendig histologisk karakterisering av alt frossent materiale kan oppnås med mulighet for å oppnå og sammenligne histologiske og biokjemiske opplysninger fra alle områder av begge halvkuler.

Rammen av vårt hjernebankprosjekt er byen Abbiategrasso. Abbiategrasso er en liten by ca 22 km sørvest for byen Milano, i Nord-Italia. Den har en befolkning på ca 32.600 mennesker. Det er hjem til Golgi-Cenci (GC) Foundation. GC Foundation er en del av et stort rehabiliterings geriatrisk sykehus (ASP Golgi-Redaelli), og er et institutt med fokus på forskning om aldring og eldreomsorg. Spesielt fokuserer det på å studere mental aldring, de sosiale og atferdsmessige faktorene som påvirker det, og biologien og patologien underliggende aldersavhengige nevrokognitive lidelser (NCDs). I 2009 lanserte GC Foundation en ny langsgående studie med 1321 deltakere (av 1644 kvalifiserte fag: innledende responsrate på 80,3 %) født mellom 1935 og 1939 (mellom 70 og 75 år), av kaukasisk etnisitet, som bor i det samme lille geografiske området. Studien ble kalt InveCe.Ab (Invecchiamento Cerebrale Abbiategrasso; på engelsk: Brain Aging Abbiategrasso, ClinicalTrials.gov, NCT01345110) og er for tiden pågående. InveCe.Ab er planlagt å få en kohort med maksimal homogenitet og minst variasjon for å vurdere forekomsten, forekomsten og naturlig historie med demens, sammen med mulige risiko- eller beskyttelsesfaktorer, inkludert atferdsmessige, psykososiale, kliniske og biologiske variabler³⁶. Kohortens egenskaper er vist i figur 1 og tabell 1. De epidemiologiske dataene er i samsvar med demenstrenden i den^{europeiske befolkningen 37,,38} og InveCe.Ab-deltakerne har homogene genetiske og miljømessige egenskaper, noe som representerer en god modell for å studere banen fra normal aldring til nevrokognitive lidelser. Faktisk krever homogene populasjoner færre forsøkspersoner for å nå tilstrekkelig statistisk kraft. InveCe.Ab-metoden er allerede rapportert andre^{steder 36,} men det er viktig å understreke sin flerdimensjonale tilnærming gjennom periodiske kontroller (hvert 2-3 år) ved hjelp av samme sett med evalueringer, inkludert: blodprøvetaking (metabolsk panel, homocystein og vitaminer, DNA-ekstraksjon for å profilere Apolipoprotein E (APOE) og andre genetiske polymorfimer relatert til kognisjon og aldring), antropometriske målinger (vekt, høyde og midje), Talking While Walking Test (dual task test), et intervju for å vurdere livsstil (Middelhavet diett overholdelse, nivåer av fysisk aktivitet og kognitivt engasjement) og sosiale faktorer (sosialt engasjement, ensomhet), en nevropsykologisk evaluering og en klinisk generell undersøkelse. Å sammenligne slike langsgående data med postmortem nevropatologiske data ville være avgjørende for forskning. Derfor unnfanget vårt team og spesielt Dr. Michela Mangieri den nevropatologiske tilnærmingen nevnt ovenfor. Siden 2014 og under den andre oppfølgingen ble InveCe.Ab-deltakerne bedt om å donere hjernen sin, og dermed føre til fødselen av Abbiategrasso Brain Bank (ABB). Kjernegiverne til ABB er InveCe.Ab-deltakerne, men ABB er nå åpen for andre frivillige givere. De er pasienter fra ASP Golgi-Redaelli, hjem til flere pasienter som er rammet av ulike nevrologiske sykdommer eller voksne frivillige som lærer om ABB-prosjektet og tilhører det samme geografiske området (Abbiategrasso og omgivelser). Alle givere gjennomgår samme evalueringsprotokoll.

Forfatterne foreslår en metode for å spore individuelle baner av normal aldring og mulig progresjon til NCDs, og å nøyaktig administrere, behandle og karakterisere hjerner ervervet fra slike givere fulgt langsgående. Videre er vårt mål å møte og engasjere enkeltpersoner i periodiske nevrologiske vurderinger, seminarer og pedagogiske aktiviteter om hjernens velvære og å øke deres bevissthet om hjernedonasjon til forskningsformål.

Protocol

I tråd med institusjonens Human Research Ethics Committee og BNE Code of Conduct utfører ABB sin virksomhet etter etiske standarder^39,,40. Hjernehøstingsprosedyren ble sendt til og godkjent av etikkkomiteen ved Universitetet i Pavia i sammenheng med InveCe.Ab-studien³⁶. Studieprosedyrene var i samsvar med prinsippene som er skissert i Helsingfors-erklæringen i 1964 og følgende endringer. Samtykkeskjemaet er fullstendig og lett forståelig. Å bli med i donasjonsprogrammet er en personlig beslutning, og fullstendig bevissthet er nødvendig. Dersom en person ikke anses kompetent til å signere samtykkeskjemaet, er fullmakt fra verge eller pårørende (NOK). Tabell 2 rapporterer inklusjons- og ekskluderingskriterier for hjernedonasjon. Forskningen ble utført under tilsyn av Federazione Alzheimer Italia.

1. Rekruttering til hjernen donasjon program

1. Innkalle fagene som hadde uttrykt interesse for hjernedonasjon og deres NOK og/eller verge for å presentere prosjektet (omfanget av donasjonsprogrammet; prosessen med fjerning av hjernen, bevaring, bruk og distribusjon), retten til å trekke seg fra programmet til enhver tid, beskyttelse av anonymitet og oppfølgingsstrategier. Diskuter muligheten for ytterligere biomarkørundersøkelser og genetiske tester. Legg merke til ønskene til den potensielle giveren eller hans NOK for å bli informert om resultatene.
2. Forklar alle de økonomiske aspektene, inkludert mangelen på økonomisk gevinst for både stiftelsen og giveren (hjernen doneres og distribueres altruistically). Informer dem om at ABB dekker kostnadene for kroppstransport, mens familien dekker de av begravelse, begravelse eller kremering.
3. Ved aksept, få signaturen av samtykket til å delta i donasjonsprogrammet. Gi giveren en individuell numerisk kode for å garantere anonymitet. Skriv ned identifikasjonsnummeret til de som deltar i den langsgående studien og gi en annen kode for hjernebanken for å enkelt skille de to undergruppene av givere (deltakere eller ikke-deltakere i den langsgående studien; se tabell 3).
4. Gi giveren et identifikasjonskort som erklærer sin status som donor og viser telefonnummeret (tilgjengelig 24/7) for å varsle Brain Bank om hans død.

2. Donorevaluering og seriell oppfølging

MERK: Det er mulig å gi samtykke bare for noen, og ikke alle, av de nedenfor nevnte undersøkelsene. Alle kliniske vurderinger utføres av samme team, inkludert en nevrolog, en geriatrician med ekspertise innen nevrologi og 3 psykologer. Hvis nye symptomer utvikler seg eller den kognitive nedgangen utvikler seg, kan tidsintervallet mellom oppfølging forkortes.

1. Som i tilfelle av InveCe.Ab studien, få en livsstil-sosial spørreskjema, inkludert grad av autonomi (ADL, IADL), personlige vaner, sosiale og livsstil faktorer som kan påvirke mentale funksjoner. Samle familie, medisinsk og nevrologisk historie med informasjon om genetiske, infeksiøs, toksiske, metabolske, autoimmune, kardiovaskulære, traumatiske, degenerative, neoplastiske og nevrologiske sykdommer. Samle tidligere kliniske eksamener og liste farmakologiske behandlinger.
2. Utfør en omfattende nevromotorisk evaluering, inkludert testing for kranial nervefunksjon, fundus oculi, synsfelt, muskelstyrke og tone, sensibilities, senereflekser, exteroceptive og primitive reflekser, meningeal tegn, holdning, gangart, bevegelser, koordinering, sphincteric funksjoner, og enhver tilstedeværelse av fokal eller Babinski tegn. Evaluer språk, mental status og eventuelle endringer i atferd.
3. Utfør en omfattende nevrokognitiv evaluering, inkludert global kognisjon og en fullstendig nevropsykologisk vurdering av spesifikke kognitive domener: verbalt og visuelt minne, oppmerksomhet, psykomotorisk hastighet, språk, semantisk minne, utøvende funksjoner og visuospatiale evner (Tabell 4 for detaljer). Vurder tilstedeværelsen av depresjon (CES-D skala).
4. Få blodprøve som brukes til både blodkjemianalyse (tabell 5) og isolasjon og lagring av DNA, plasma og perifere blodmonukleære celler (PBMC). Bestem APOE genotyping (rs429358 og rs7412) (en mer omfattende genetisk profilering er bestemt hos InveCe.Ab deltakere; se tabell 6). Registrer et EKG (hjerteendringer, atrieflimmer) og en hviletilstand Elektroencefalogram for kvantitativ analyse (QEEG).
5. Vurder valgfri biomarkørtesting, inkludert cerebrospinalvæske (CSF) TAU, fosfo-TAU og β-amyloid, og hjerneavbildning (MR for å oppdage in vivo degenerasjon, iskemi eller betennelse; FDG-PET å oppdage metabolsk svikt; PIB-PET å oppdage hjernen amyloidose relatert til Alzheimers patofysiologi).
6. Planlegg hjernedonorens påfølgende kontrollprogram. Definer tidsintervallene i henhold til ulike aldersgrupper (opptil 64 år: hvert 10. år, 65–74 år: hvert tredje år, fra 75 år og utover: hvert 2. år).
7. Tilordne en klinisk diagnose og/eller en nevrokognitiv diagnose i henhold til DSM-V. Klassifiser klinisk demensoppsetning med CDR-score (Clinical Dementia Rating). Oppdater CDR i den siste perioden før døden.
8. Klargjør en database grafisk lik papiret. Sett inn alle innsamlede data i Brain Bank-databasen. Planlegg en revisjon av en annen kontorist for å se etter eventuelle feil.

3. Tidspunktet for død og fjerning av hjernen

MERK: Den italienske loven fastslår at asystole må vare lenger enn 20 min for å bekrefte døden. Registrering av et flatt elektrokardiogram (EKG) i minst 20 min (navngitt thanatografi) gjør det mulig å obdusere innen 24 timer av død (DPR 285/90 kunst. 8 og lov n. 578 29. desember 1993). En postmortem tid på <24 h er et godt mål for å bevare den generelle vevskvaliteten. Ved postmortemtid >30 timer avbrytes obduksjonen (se tabell 2). Obduksjonsteamet består av en patolog, en nevrolog og / eller en nevrobiolog, en sykepleier, en anatomisk romtekniker og eventuelle traineestudenter; de to første teammedlemmene utfører også den nevropatologiske diagnosen. Under håndtering og disseksjon av er bruk av passende klær (frakk, hansker, briller og hårnett) obligatorisk. I denne delen beskriver vi de viktigste verktøyene og utstyret som vanligvis brukes i laboratoriet vårt. Leserne kan velge instrumentene som skal brukes etter eget skjønn. For en detaljert beskrivelse av materialene her benyttes, vennligst se Materials tabell.

1. Sørg for at begravelsesbyrået valgt av familien bringer kroppen til ABB-fasilitetene. Utfør thanatografien der hjerteaktiviteten må være fraværende. I så fall signerer du en dødsattest og begynner obduksjonsprosedyrene.
2. Transporter til obduksjonsrommet. Mål omkretsen av skallen på nivået av den bredeste delen av hodet. Mål fra nasion til inion for å oppnå anteroposterior diameter (APD), mens avstanden fra det ene øret til det andre gir tverrgående diameter (TD). Beregn cephalic indeksen (CI) ved hjelp av formelen: CI = TD / APD x 100.
3. Ved hjelp av en skarp skalpell, gjør et hodebunnssnitt på koronarplanet, fra spissen av mastoidprosessen på den ene siden til den andre, som passerer over toppunktet. Klipp gjennom hår, hud og subkutant vev og skille de to brettene i hodebunnen forsiktig fra underskallen. Utfør snittet til det gule supraorbitale fettet blir synlig og reflektere hodebunnen fremre. Trekk den andre delen bakre.
4. Bruk skalpell og tang, ta en liten prøve av den timelige muskelen på hver side, legg en i 4% formaldehyd og frys den andre (se avsnitt 7).
5. Kutt skallen ved hjelp av en elektrisk sag etter en V-kutt på forsiden. Fjern hodeskallen og kutt meningene. Prøvebiter av dura er både fast i 4% formaldehyd og frosset (se avsnitt 7).
6. Få ca 10 ml CSF ved å sette inn en 20 G 3,5 i. nål gjennom corpus callosum for å nå den tredje ventrikkelen. Vurder utseendet, fargen og turbiditeten til CSF og mål pH-en. Deretter gjør 10 aliquots av ca 1 ml hver og lagre dem ved -80 ° C.
7. Løft opp hjernen delikat trekke på både frontallappene og kutte både optiske nerver infundibulum, de indre halspulsårene (ICA) og den tredje, fjerde, femte og sjette kranial nerver. Klipp tentorium for å nå bakre fossa og kutte vertebrale arterier og lavere kraniale nerver. Sett skalpellen så dypt som mulig gjennom foramen magnum, for å kutte den mest kaudale delen av medulla. På dette punktet fjerner du hele hjernen forsiktig.
8. Med skalpell, pierce beinet over Meckel hule og få gasserian ganglion fra begge sider. Løs en ganglion i 4% formaldehyd og frys den andre (se avsnitt 7). Brudd benete sella turcica ved hjelp av en kirurgisk klubbe og meisel for å fjerne hypofysen og deretter fikse den i 4% formaldehyd.
9. Inspiser skallen og hele hjernen for makroskopiske endringer og vaskulære endringer. Med et målebånd måler du hjernen som oppnår de tverrgående og anteroposterior diameterne. Hent forsiktig sirkelen av Willis og vurdere det makrooskopisk (Figur 2E) for tilstedeværelse av anatomiske varianter, lesjoner eller karstenose.
10. Ta 1–2 stykker leptomeninger på 2–4 cm² fra konveksiteten og behold dem i fullstendig høyt glukose Dulbeccos modifiserte Eagle media (DMEM) kulturmedium ved 4 °C som inneholder 20 % fosterbovinserum (FBS), 1 % penn/strep, 1% glutamin og 1% ikke-essensielle aminoacids (som tidligere publisert, med noen modifikasjoner)⁴¹.
    1. For å oppnå fibroblaster kulturer, plasser leptomeningene på en 10 cm petriskål og vask to ganger med fosfatbuffer saltvann (PBS), hver gang du kaster væsken.
    2. Bruk en skalpell og en pipettespiss, skjær leptomeningene i små biter på ca. 2 eller 3 mm, frø 3-4 stykker i hver brønn av en 6-brønns plate som tidligere var belagt med gelatin på 0,5% og fyll hver brønn med 2 ml komplett medium supplert med 1% av amfotericin B (utfør behandlingen i et biosikkerhetsskap for å garantere steriliteten til kulturen).
    3. Plasser platen i en 37 °C,₂ 5 % CO 2-inkubator i minst én uke og bytt medium hver 3–4. Trypsinize celler med sterile 1x trypsin når brønnen er på ca 70% av samløpet. Legg leptomeningeal fibroblaster i en T75 kolbe og fyll den med 12 ml komplett medium. Etter 5 dager trypsinize og bevare dem i 900 μL av FBS og 100 μL dimetylsulfoksid (DMSO).
11. Separer og inspiser cerebrum, lillehjernen og hjernestammen og vekt dem individuelt. Ta av pinealkjertelen og fikse den i 4% formaldehyd. Fjern olfaktoriske pærer og optiske nerver, og fest eller frys et av hvert par, uavhengig av siden. Hold lillebrum, lillehjernen og hjernestammen i is ved 4 °C i minst 2–4 timer til den er klar for disseksjon for å minimere vevsforstyrrelser og redusere vevsmykheten.
12. Etter høsting, vær oppmerksom og ta vare på. Fest beinet igjen ved hjelp av et superlimlim, og sy tilbake hodebunnen ved hjelp av en kirurgisk nål og ikke-absorberbare suturer.
13. Vis respekt og takknemlighet til den avdøde ved å behandle forsiktig. Rengjør og barber ansiktet, og vask og tørk håret, fordi vil bli satt i en åpen kiste synlig for kjære.
    MERK: En teknikers omplassering av. Protokollen kan settes på pause her.

4. ABB disseksjonsprotokoll

MERK: Den samme patologen og/eller nevrologen skjærer hjernestammen, lillehjernen og cerebrum under en røykhette. En nevrobiolog ordner skivene etter snitting. En trainee som ikke håndterer hjerneseksjoner dokumenterer hele prosedyren med bilder som skal lastes opp til databasen for å tjene som veiledning i de påfølgende vevsbehandlingsfasene.

1. Ved hjelp av en disseksjonskniv, kutt hjernestammen aksialt og gjør det første kuttet på nivået av rostral midbrain, gjennom den overlegne colliculus, for å få to skiver som eksponerer substantia nigra (SN).
2. Gjør resten av kuttene for å skaffe 8 mm hjernestamme skiver for å oppnå ca 10 seksjoner. Vær forsiktig med å inkludere kutt som passerer gjennom rostralponniene nær de overlegne margene på den fjerde ventrikkelen for å observere locus coeruleus (LC) og gjennom medulla oblongata dårligere enn akustisk striae like over den dårligere toppen av fjerde ventrikkel for å ha skiver, inkludert den dorsale motorkjernen i vagus (DMNV).
3. Navngi alle skiver i en rostrocaudal forstand som BS (brainstem) etterfulgt av arabiske tall for å identifisere seksjonene. Etter siste hjernestammeksjon, bruk betegnelsen SC (ryggmargen) etterfulgt av tallene 1-n. Omtrent 2–4 SC-skiver oppnås avhengig av antall ryggmetabler fjernet (figur 2H–I).
4. Merk alle delene som skal fikses eller fryses vekselvis og ta et bilde for fotoarkivet (figur 2). Deretter kan du reparere og fryse alle skiver som beskrevet nedenfor (trinn 4.7 og 4.8).
5. Klipp lillehjernen på sagittalplanet for å skille de to lillehjernen halvkuler på nivået av vermis. Utfør sagittalseksjon for å få 5 skiver fra hver halvkule (figur 2F–G).
6. Navngi alle skiver fra vermis som CBR eller CBL (for henholdsvis høyre og venstre lillehjernen) og bruk arabiske tall til å identifisere seksjonene. Merk alle seksjoner som skal festes eller fryses vekselvis, og ta et bilde for arkivet (figur 2). Deretter fikser og fryser du alle skiver som beskrevet nedenfor.
7. Skill de to halvkulene i cerebrum gjennom corpus callosum (Figur 2A-B) og skjær dem entall på koronarplanet. Gjør det første kuttet i et plan som passerer mellom optisk chiasm og mammillary organer, gjennom frontallappen, temporal stang, fremre cingulate, fremre commissure, kjernen av Meynert og basal ganglia.
8. Utfør det andre kuttet ca 1 cm bakre passerer gjennom mammillary organer og utsette basal ganglia, fremre thalamus, subthalamus og amygdala. Fortsett å kutte for å dissekere de fremre og bakre regionene for å skaffe 1 cm skiver for å få 15 til 20 seksjoner for hver halvkule.
9. Sett skivene på et flatt underlag. Legg dem etter sin opprinnelige posisjon i anteroposterior retning, fra frontal til occipital pol, med den delen kontinuerlig med den forrige skiven vendt oppover.
10. Ved å sammenligne seksjonene fra begge halvkuler, velg alternative seksjoner fra hver halvkule som skal beholdes som fast eller frosset materiale. Gjenkjenne de viktigste delene som skal fikses og behandles for histopatologi inkludert frontal og temporal lobes, cingulate, basal ganglia, kjerne basalis av Meynert, amygdala, thalamus, hippocampus og entorhinal cortex, occipito-temporal gyrus, parietal og occipital lobes.
11. Gi alle stykker navn i anteroposterior-forstand som L (venstre) eller R (høyre) etterfulgt av arabiske tall, og legg en etikett som angir om stykket skal festes eller fryses (figur 2A–D). Hvis du vil identifisere delene, tar du et bilde for fotoarkivet. Deretter fikser og fryser du alle skiver som beskrevet i avsnitt 7 og 8.

5. Hjerne- og karinspeksjon og makroskopisk patologisk vurdering (med det blotte øye)

1. Utfør en generell makroskopisk undersøkelse med tanke på meningeal endringer, diffus eller lokalisert kortikal atrofi, hippocampal atrofi, ventrikulær utvidelse, lillehjernen atrofi, hjernestamme atrofi, substantia nigra blekhet, hvite materie endringer (angi type og plassering).
2. Undersøk sirkelen av Willis vurderer aterosklerose og okklusjon. Tilordne score = 1 i nærvær av aterom uten stenose på mer enn 50%, score = 2 hvis minst en arterie er 50% eller mer okkludert, score = 3 hvis to eller flere arterier er 50% eller mer okkludert⁴². Evaluer tilstedeværelsen eller fraværet av patologi i andre intrakranielle kar.
3. For å oppdage parenchymale vaskulære lesjoner, undersøk hjernehalvkuler, lillehjernen og hjernestammen. Vurder lakunarlesjoner (diameter < 10 mm), iskemiske eller hemorragiske infarkter og blødninger (diameter > 10 mm). Hvis det finnes, angir du størrelse i millimeter, antall og plassering. Vurder også tilstedeværelsen eller fraværet av subaraknoid blødning.

6. Kontroll av vevskvalitet

MERK: AfS (Agonal factor score) varierer mellom 0 og 2 og er viktig i evalueringen av vevskvalitet. For å bestemme AFS bør du vurdere kliniske tilstander som oppstår rundt dødstidspunktet (spesielt tilstander som bestemmer hjerneacidose) og varigheten av smertetilstand (plutselig død eller langvarig smerte). Hvis AFS > 1, kan hjernevevet ikke være av optimal kvalitet⁴³. Også vurdere hjernen og CSF pH; hvis pH < 6, kan hjernevevet ikke være av optimal kvalitet^43,44.

1. Kontroller om dødsfallet er forårsaket av tilstander som kan skade hjernevev, inkludert hypoksi, langvarig acidose, mekanisk ventilasjon, multiorgansvikt, høy feber, alvorlig kranialtraume, inntak av nevrotoksiske stoffer, alvorlig dehydrering, alvorlig hypoglykemi, epileptisk tilstand og langvarig koma. Hvis en av disse betingelsene finnes, tilordner du 1 punkt.
2. Kontroller varigheten av smertetilstand (rask hvis døden oppstår innen 1 time, mellomliggende hvis døden oppstår mellom 1 og 24 h, sakte hvis smertetilstanden varer mer enn 1 dag). Hvis en mellomliggende eller langsom død skjer, tilordne 1 punkt.
3. Beregn AFS-poengsum, og mål CSF pH med en elektrode pH-nål og vevpH med en overflatepH-måler på en hjerneskive fra hver flik og på en lillehjernseksjon.

7. Vev frysing

1. Hold at alle vev fryses i is ved 4 °C. Deretter fryser du dem raskt. Plasser dem på et prefrozen aluminiumsbrett. Dekk med en forrigling aluminiumplate for å holde dem flate. Sett dem i flytende nitrogen ved -120 °C i 3 min.
2. Plasser skivene i en plastpose merket med tilsvarende identifikasjonskode og skivenummer. Del plastposene i tre kryogene bokser (for høyre halvkule, venstre halvkule og hjernestamme) og oppbevar ved -80 °C.

8. Vev fiksering

1. Pakk skivene i gasbind en etter en, og legg skivene i 10% fosfat bufret formalinløsning. Etter 1 dag erstatter du formalinløsningen med en frisk løsning. La dem stå i ca 5 dager i et kaldt rom ved 4 °C.
2. Hold alle skiver som helhet og del bare skiver som inneholder hippocampus og amygdala i to deler (figur 3). Den øvre delen av begge skivene vil inneholde frontallappen (R10a–L9a i figur 3); de nedre delene vil inneholde henholdsvis: (1) amygdala, temporal lobe og basalganglia (L9b i figur 3B), og (2) hippocampus og en del av tinninglappen (R10b i figur 3A). Dette er gjort for å opprettholde forholdet mellom de ulike strukturene.
3. Sett alle seksjoner i fosfatbuffer i minst 2 dager for å vaske ut og fjerne krysskoblingsprodukter.
   MERK: Protokollen kan settes på pause her.

9. Dehydrering, rydding, parafin innebygging og lysbilde forberedelse

1. Forbered økende konsentrasjoner av etylalkohol fra 70% til 100%, xylen og to sett med smeltet parafinvoks. Plasser hjerneseksjonene i den automatiske prosessoren for dehydrering, clearingprosedyre og parafininfiltrasjon (bruk to forskjellige vevsbehandlingsprotokoller for makro (cerebrum og lillehjernenskiver) og mikroprøver (hjernestammeskiver og de andre små prøvene); Tabell 7). Bygg inn vevet i parafinvoks på en metall- eller plastform.
2. Velg delene som skal skjæres for å evaluere alle interesseområdene ved å bruke Montines indeks for nevropatologisk karakterisering⁴⁵ (tabell 8). Deretter deler du de valgte delene.
3. Bruk en kjelkemikrotom for makroseksjoner og en roterende mikrotom for små seksjoner. Skjær 5 μm skiver for Hematoksylin og Eosin (H&E) farging og 8 μm skiver for de andre flekker og immunohistochemistry. Sett skivene på tre forskjellige typer histologiske lysbilder: 8,5 cm x 11 cm for største skiver, 5 cm x 7,5 cm for mellomstore skiver og den klassiske 2,5 cm x 7,5 cm for de minste.
   MERK: Protokollen kan settes på pause her.

10. Deparaffinisering, histologisk farging og immunohistokjemi (IHC)

1. Utfør deparaffinisering for å muliggjøre reaksjon med vandige fargestoffløsninger. Utfør den med xylen og redusere alkoholkonsentrasjon (5 min for hvert trinn). Rehydrere i 5 min med destillert vann.
2. Bruk følgende histologiske flekker for å evaluere arkitektoniske og strukturelle vevsavvik, og cellulær morfologi: H&E (for vaskulære mikroskopiske lesjoner og betennelse), Cresyl Violet (NISSL; for nevronal tap), Luxol Fast Blue (LFB; for demyelination), Gallyas (for nevropiltråder).
3. Bruk immunohistochemistry (IHC) for å markere tilstedeværelsen av spesifikke målstrukturer. Anti-NeuN og anti-GFAP brukes til å identifisere nevronale og glial rom; 4G8, AT8, α-SYN og TDP-43 brukes til å identifisere proteiner som aggregerer i nevrodegenerative sykdommer (Materialtabell).
   1. Forbehandle avsagte seksjoner med 3 % H₂O₂ i 10 min skyll deretter i PBS. Utfør gjenfinningsbehandling med citratbuffer 0,01 M pH 6 (mikrobølget seriell i 2, 1 og 2 min) for 4G8,α-SYN, TDP-43 og NeuN-antigener; bruke 70 % maursyre for 4G8 og α-SYN. Forskuddsdebatt i 30 min i 5% normalt geiteserum.
   2. Inkuber over natten ved 4 °C med det primære antistoffet. Dagen etter skylles seksjonene i PBS før inkubasjon med det sekundære antistoffet (Envision+ System-HRP merket Polymer) ved en fortynning på 1:2 i PBS i 1 time ved romtemperatur.
   3. Vask flere ganger i PBS og inkuber i kromogensystemet med diaminobenzidin (Flytende DAB+substratkromoogensystem) som ser på reaksjonsutvikling under mikroskopet (forstørrelse 4–10x). Vask til slutt seksjonene i PBS. Motvirke seksjonene i hematoksylin, dehydrere og dekklips med DPX montering.
      MERK: Tabell 8 oppsummerer standardprotokollen. Utfør H&E-farging på alle seksjoner, mens spesielle/spesifikke flekker og reaksjoner brukes på utvalgte seksjoner. Utvalgte tilfeller krever flere områder eller reaksjoner. Materialtabell viser detaljer om antistoffer som brukes til IHC.

11. Grunnleggende nevropatologisk karakterisering

MERK: Ikke-spesifikke endringer i hjernevev, vaskulær patologi, Alzheimers sykdom (AD)-patologi, ikke-AD TAUopatier, synucleinopatier, TAR DNA-bindende protein (TDP-43) patologi og hippocampallesjoner studeres. Et optisk mikroskop koblet til et kamera brukes til å oppdage parenchymale mikroskopiske lesjoner. Den histologiske vurderingen utføres av samme team av opplært personell i nevropatologi, inkludert professor i nevrologi, en nevrolog og en patolog. Den er basert på en modifisert Montines tilnærming⁴⁵ (Tabell 8) også inkludert: (1) Heterogene ikke-AD TAUopathies som utgjør det patologiske kjennetegnet til Fronto-Temporal Lobe Degeneration (FTLD) relatert til TAU-innskudd: Pick sykdom, ikke-flytende Primær Progressiv Afasi (TAU-nfPPA), Progressive Supranuclear Palsy (PSP)^46,,47 og Kortiko-Basal Degenerasjon (CBD)⁴⁸. I tillegg inkluderer ikke-AD TAUopathies forhold knyttet til aldring og uten klar klinisk betydning som primær aldersrelatert TAUopati (PART)⁴⁹, Aldersrelatert TAU Astro-Gliopati (ARTAG)⁵⁰, argyrofil kornsykdom⁴⁸. (2) Lewy Type Synucleinopathy (LTS) som er relatert til Parkinsons sykdom (PD) og Lewy Bodies Demens (LBD). Hvis du vil søke etter LTS, bruker du følgende hierarkiske trinn: først olfaktorisk pære, hjernestamme, amygdala/temporal cortex; hvis de tidligere områdene er positive, legg til limbiske strukturer (hippocampal dannelse, entorhinal cortex, fremre cingulate), midtfrontal gyrus, dårligere parietal lobule og occipital cortex⁴⁵. Hvis kliniske trekk ved kortikal LBD finnes (det vil si svingninger og/eller hallusinasjoner), bør du vurdere limbiske strukturer og isocortex for det første trinnet. (3) TDP-43 innskudd, det patologiske kjennetegnet til FTLD relatert til TDP-43 innskudd: atferdsvariant av Fronto-Temporal Demens (bvFTD), semantisk demens (SD eller svFTD), TDP-nfPPA og FTD-Motor Neuron Disease (FTD-MND). IHC for TDP-43 utføres på følgende avsnitt: amygdala, hippocampus, entorhinal cortex og midtfrontal gyrus; i tilfeller med mistanke om klinisk FTLD, bør du vurdere å undersøke andre avsnitt⁵¹.

1. Evaluer ikke-spesifikke endringer i hjernevev i utvalgte avsnitt ved hjelp av H&E, NISSL, LFB og IHC for GFAP og NeuN. Vurder nevronal sjeldenfaction, ballongerte nevroner, svampose, gliose, myelintap, tilstedeværelse eller fravær av inflammatoriske eller tumorinfiltrater. Angi den utbredte plasseringen av disse endringene.
2. For å oppdage mikroskopiske vaskulære lesjoner, undersøk H&E og LFB-lysbilder, inkludert minst to hemisfæriske makroseksjoner (den første som passerer gjennom mammillary kroppene (Charcot cut) med frontale og temporale fliker, basale ganglia, fremre thalamus, amygdala, og den andre passerer gjennom occipital lobe), "geniculate" delen av hippocampal formasjon, en lillehjernen delen, og alle tre viktigste delene av hjernestammen (gjennom substantia nigra, locus coeruleus og DMNV).
   1. Påvis småkarsykdom inkludert arteriolosklerose, lipohyalinose, perivascular romdilatasjon, tap av hvit materie, leptomeningeal og/eller parenchymal og/eller kapillær cerebral amyloid angiopati. Angi vurdering (0–3) og utbredt plassering^42,52. Vurder tilstedeværelse eller fravær av hemosiderinlekkasje, mikroblede og mikroinfarkter.
   2. Evaluer bidraget av vaskulær skade på kognitiv svekkelse ved hjelp av hierarkiske Deramecourt's ordning (karveggendringer-små fartøysykdom-makroskopiske infarkter). For denne evalueringen vurdere en frontal og temporal lobe seksjon, basal ganglia og hippocampus (score 0-20)³⁰. Også anslå sannsynligheten for at cerebral vaskulær sykdom bidro til kognitiv svekkelse ved hjelp av VCING score (lav-middels høy), oppnådd ved å vurdere hemisfæriske makroskopiske infarkter og små fartøy sykdom i occipital lobe inkludert moderat til alvorlig arteriolosklerose og amyloid angiopati⁵³.
3. Evaluer AD-patologi ved hjelp av IHC (4G8) for amyloid spredning. Definer Thals etapper (1–5)⁵⁴, samlet Amyloid-scoring (0–3)⁴⁵og morfologi per sted (diffus, fokal, kjernet).
   1. Evaluer AD Tau-patologi ved hjelp av IHC (AT8) og beskriv den utbredte morfologien per sted (nevrofibrille floker, nevropiltråder, nevritatiske plakk). Definer Braaks stadium (I–VI +; positivt tegn indikerer tilstedeværelsen av flere områder av hyperfosforylert Tau-patologi som ikke følger Braaks^{hierarki) 55} og samlet poengsum (0–3)⁴⁵.
   2. Evaluer neuritiske plakk ved hjelp av Gallyas farging og CERAD score (0-3)⁵⁶. Deretter definerer du sannsynligheten for de nevropatologiske egenskapene som tilsvarer et AD klinisk syndrom ved hjelp av Amyloid-Braak-CERAD score (ABC score 0-3): ingen-lav-middels høy⁴⁵.
4. Bruk AT8 IHC til å legge merke til tilstedeværelsen eller fraværet av ikke-AD TAU-patologi som spesifiserer utbredt plassering og særegen morfologisk bilde. Vurder nevronale inneslutninger som flammeformede eller globose floker, sfæriske-kuledeslutninger (det vil vil vil at Pick's organer)⁵⁷, neuropil tråder, dystrofiske neurites, argyrophilic korn; og glial inneslutninger som tufted astrocytter, tornete astrocytter, astrocytiske plakk, kveilet organer, kulede inneslutninger^58,59.
5. Bruk α-syn IHC til å oppdage LTS (Lewy-legemer, bleke kropper og Lewy-neuritter) på områdene i notatet ovenfor. Ved positivitet, bruk McKeiths gradering (0–4) for å evaluere alvorlighetsgraden av lesjonene^60; deretter, bruk Beach stadier (I-IV) for topografisk distribusjon (olfactory pære, brainstem dominerende, limbic dominerende, neokortikale)⁶¹. Sammenlign Beach og Braak stadier for å definere forholdet mellom LBD og AD patologi^60,61,62.
6. Vurder tilstedeværelsen eller fraværet av Glial Cytoplasmic Inclusions (GCI; ikke Lewy-type glial synucleinopathy) som er det patologiske kjennetegnet til Multiple System Atrophy (MSA) og spesifisere deres utbredte^{plassering 63}.
7. Bruk TDP-43 IHC til å oppdage TDP-43 innskudd på områdene i notatet ovenfor. Identifiser den utbredte morfologien per sted: Nevronale cytoplasmatiske inneslutninger (NCIer), distrofile nevrittinkludering (DNer), kjernefysiske inneslutninger (NIIer). Definer mønsteret: A (dominerende NCIer og DNer: bvFTD og nfPPA); B (dominerende NCIer: FTD-MND); C (dominerende lange DNs: svPPA og bvFTD)^51,64. Bruk Nelsons plan for å definere tilstedeværelsen av TDP-43 i^{AD-tilfeller 65,66}.
8. Evaluer hippocampus fra subiculum og Sommer sektor (CA1). Bruk Rauramaas poengsum (0–4): 1–2 for henholdsvis mikroinfarkter og makroinfarkter; 3–4 tilsvarende moderat og alvorlig nevronalt tap, henholdsvis hippocampal atrofi (hippocampal sklerose: HS). Påkår tilstedeværelse eller fravær av patologiske proteinavleiringer (i synkende rekkefølge av frekvens: pTAU, TDP-43, α-syn)⁶⁷.
9. Definer nevropatologisk diagnose og skriv inn alle patologiske data i databasen.
   MERK: Rommene der de biologiske materialene og fornuftige dataene til donorene lagres, er alltid låst, og bare det autoriserte personellet har lov til å gå inn, for å garantere både sikkerhet og personvern. Det frosne biologiske materialet lagres i låste frysere ved -80 °C, mens formalin-fast parafin-innebygd vev lagres i låste skap ved romtemperatur. Doble motor frysere brukes og en back-up fryser er også til stede. Videre, for å sikre at fryserne alltid fungerer, får de et 24/7 overvåkingssystem som slår av en alarm. En nødgenerator er også til stede, i tilfelle strømbrudd. Deltakerne anonymiseres med en numerisk kode for å sikre deres privatliv; Det er ikke mulig for ikke-autorisert personell å gå tilbake til identiteten til givere og deres fornuftige data. All informasjon samles inn i en passordbeskyttet database; på samme måte holdes en papirkopi av disse dataene i låste arkiver.

Representative Results

Hjernedonorer og hjernehøstingsdata
I 2014 begynte donorrekruttering under den andre InveCe.Ab-oppfølgingen, som involverte 1010 av 1061 kvalifiserte (responsrate: 93%; Figur 1). I forhold til inveCe.Ab-langsgående studie, var 290 av 1010 deltakere (28,7 %) enige om å registrere seg som givere (160 allerede registrert og 130 som uttrykte sin intensjon om å registrere seg). Utdanningsnivået er høyere hos givere enn hos ikke-givere (66% av våre givere har et middels høyt utdanningsnivå: 8 eller flere år på skolen), noe som indikerer viktigheten av kultur og utdanning. Mange "sunne" individer viste også interesse for hjernedonasjonsprogrammet. De fleste av våre "kontroller" tilstår at de kan sympatisere med de syke og deres slektninger, og ønsker å bidra på en eller annen måte til forskning som fører til en bedre forståelse av nevrologiske sykdommer. Uselviske mennesker som regelmessig engasjerer seg i blod eller marg donasjon programmer i løpet av livet er mer åpne for ideen om hjernedonasjon, som er folk som allerede har avtalt å donere organer etter døden. De er klar over det faktum at selv om det ikke ville være en levende mottaker, ville deres donasjon være av stor betydning for forskning. En annen faktor som bidrar til hjernedonasjon er preferansen som skal kremeres. For tiden omfatter ABB donorpopulasjonen totalt 427 personer (290 InveCe.Ab-deltakere + 137 frivillige eller pasienter fra ASP Golgi-Redaelli Geriatric Hospital), hvorav 75 % er 70 år eller eldre. Det er en klar overvekt av kvinner (64%) og mentalt intakte eldre (ca. 85 %). Så langt har 27 hjerner blitt høstet ut av 40 avdøde givere (67% obduksjonsrate); 13 personer har ikke blitt obdusert av ulike grunner, inkludert unnlatelse av å rapportere død til ABB, alvorlige skader som fører til hjerneødeleggelse, farlige infeksiøs sykdommer og 1 CJD-tilfelle; 4 personer har tilbakekalt sitt samtykke. Frem til nå fikk 24 av de 27 hjernene som høstes, en fullstendig nevropatologisk karakterisering med en bestemt klinisk patologisk diagnose, mens de resterende 3 hjernene fortsatt er under undersøkelse (tabell 3). Ytterligere hjernehøstingsdata fra ABB inkluderer: gjennomsnittsalder ved døden (81 år); gjennomsnittlig postmortemintervall (10,37 timer); gjennomsnittlig CSF pH (6,64); gjennomsnittlig vev pH (6,07); gjennomsnittlig hjernevekt (1012,86 gr); AFS var 1 av 90 % av avdøde forsøkspersoner.

Nevrofysiologiske biomarkører (QEEG)
QEEG er en del av den flerdimensjonale tilnærmingen. Det er en enkel, ikke-invasiv og billig metode, med et sannsynlig potensial til å oppdage konvertering fra mild neuro-kognitiv lidelse (mild-NCD eller MCI) til store neuro-kognitiv lidelse (major-NCD eller demens). Gjennom vår flerdimensjonale tilnærming utføres en vanlig QEEG-undersøkelse og dens mulige rolle som biomarkør for demens testes. Våre data om en foreløpig serie på 36 hjernedonorer (18 normale eldre (NOLD), 11 mild-NCD og 7 major-NCD; hvorav 9 med en klar nevropatologisk diagnose) indikerer at gjennomsnittlig alfarytmeprosent var betydelig lavere i major-NCD sammenlignet med mild-NCD (p: 0002) og NOLD (p: 0,033). Derimot var langsommere EEG-frekvenser (theta/deltaet) signifikant høyere i hoved-NCD enn i NOLD/mild-NCD (se eksempeltilfellene i figur 4). I vår serie kan EEG rytmefordeling skille NOLD/mild-NCD-pasienter fra store NDC-pasienter uavhengig av den etiologiske diagnosen, noe som tyder på at hjernens rytmer påvirkes av byrden av degenerative lesjoner uavhengig av lesjonstype. Faktisk viser 7 av 9 undersøkte hjerner demens på grunn av blandede patologier. Spesifisiteten om arten av patologien synes å være lav og hjernens elektriske rytmer synes å være påvirket mer av byrden og topografien av lesjonene enn av deres molekylære natur (Poloni, et al. saksbehandling av AD / PD 2019, Lisboa, data upublisert).

Symbolske tilfeller
ABB-protokollen kan være nyttig og nødvendig i noen tilfeller og betingelser. Et eksempel er tilstedeværelsen av en asymmetrisk patologi (figur 5). Vår protokoll er svært egnet for identifisering og riktig karakterisering av denne typen patologi. Så langt har vi undersøkt 4 hjerner med asymmetrisk engasjement, hvorav noen er vist i figur 5. Makrooskopisk er høyre sideatrofi (figur 5A) til stede i ett tilfelle med alvorlig ventrikulær dilatasjon i høyre koronarseksjon ( figur 5C)sammenlignetmed venstre side ( figur5B). Et annet tilfelle viser infarkt av høyre halvkule (Figur 5D) og en annen viser en klar atrofi av høyre mammillary kroppen ( Figur5E). På mikroskopisk nivå viser et tilfelle av FTLD en asymmetrisk TDP-43 positivitet som er mer intens i høyre frontal side sammenlignet med venstre (Figur 5F, G).

Makroseksjoner (figur 6A,C) brukes til å få en samlet visning. LFB farging bidrar til å identifisere myelin tap (Figur 6D) og IHC for både 4G8 og AT8 (Figur 6B) gjør det mulig å evaluere fordelingen av immunoreaktivitet på halvkule med det blotte øye. I ABB-serien er hjernen til relaterte individer tilgjengelig for sammenligning.

I figur 7plasseres mikroskopiske bilder av seksjoner fra hjernen til homozygøse tvillinger side om side for enklere sammenligning (tvilling 1 (BB137): Figur 7A,C,E,G,I,K versus twin 2 (BB138: Figur 7B,D,F,H,J,L). Som i en lignende tidligere studie⁶⁸ble begge tvillingene sammenlignet med kliniske og nevropatologiske vurderinger. Tvillingene rapporterte samme diagnose av major-NCD på grunn av flere etiologier, men de døde to år fra hverandre, i en alder av 83 (demens-utbruddet på 72 år) og 85 (demens-utbruddet på 76 år), henholdsvis. Hjernen har et svært lignende nevropatologisk bilde, med høy AD-patologi forbundet med amyloid angiopati. 4G8 immunoreaktivitet er diffust gjennom cortex (figur 7A, B) og basal ganglia ( figur7C, D) med diffuse, tette og kjernede plakk. Det er også tydelig påvist i både parenchymale og leptomeningeal fartøy av cortex og lillehjernen (Figur 7A, B, G-J). Ved høyere forstørrelse er capCAA tydelig (figur 7G, H). AT8 immunpositive plakk, floker og tråder er diffuse i parietal korti tices av begge hjerner (Figur 7E, F, L). Når det gjelder amyloid og NFT patologi byrde, twin 1 regnes som en Thal stage 3 (montine A2) og en Braak stage 5 (montine B3), mens twin 2 regnes som en Thal stadium 5 (montine A3) og en Braak stage 6 (montine B3). De hadde de samme årene med utdanning og lignende livsstil; Den ene (BB137) var imidlertid gift og ble enke kort tid etter, mens den andre var singel (BB138). De viste forskjellige grader av clinico-patologisk variasjon med samme begynnelse og samme sykdomsforløpet, men i forskjellige tidsrammer. Dette bekrefter det faktum at selv om den genetiske komponenten spiller en nøkkelrolle i utviklingen av sykdommen, er den epigenetiske og miljømessige komponenten grunnleggende for å bestemme litt forskjellige manifestasjoner.

I noen tilfeller samsvarer det kliniske bildet ikke med de nevropatologiske egenskapene. I figur 8 bleto forskjellige tilfeller klinisk definert som AD-tilfeller; nevropatologiske analyser viser, i tillegg til en mellomliggende AD-patologi, en diffus positivitet for α-syn. I det første tilfellet viser et alvorlig LTS (Beach IV) bilde Lewy organer homogent funnet i hele gyrus cingoli (Figur 8A) og i SN som cytoplasmatiske inneslutninger omgitt av neuromelanin ( Figur8B, C). I det andre tilfellet er Lewy-legemer forbundet med Lewy-neurittene diffust fordelt i amygdala (figur 8D,E) og i Meynerts kjerne (figur 8F,G) som antyder en limbisk LTS-diagnose. Faktisk produserer topografien av lesjoner i stedet for deres molekylære natur de kliniske manifestasjonene.

Figur 1: Flytskjema for Inve.Ce.Ab-studien. Ved baseline var den totale forekomsten av demens 3 %. I løpet av oppfølgingen var prevalensen: 4,4 % (1^st.)⁶⁹, 7,1 % (2.), 10,9 %^nd(3.^rd Den åtteårige insidenssraten var 15 p/1000/år (95 % KI: 13–18 s/1000/år). Rekrutteringen av givere startet i 2014 (under den andre oppfølgingen). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Disseksjonsprotokollen for cerebrum (A), lillehjernen (F) og hjernestamme (H). Circle of Willis og enkelt halvkule er vist i (E) og (B). Koronale kutt på høyre (C) og venstre side (D) er nummerert og alternativt faste ("F") og frosne ("C"). Sagittal cerebellum seksjoner (G) og brainstem aksiale seksjoner (I) vises. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Koronale skiver av fast høyre (A) og venstre (B) fronto-temporal lobe vises.
Hippocampus og temporal lobe (A, R10b) er delt fra frontallappen (A, R10a) på høyre skive. På motsatt skive er amygdala og basal ganglia (B, L9b) delt fra frontallappen (B, L9a). Skala bar: 1,7 cm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Relativ spektral kraftfordeling i NOLD- og hoved-NCD-forsøkspersoner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5: Representative bilder av asymmetriske patologier. (A)Første tilfelle: hjerne med høyre atrofi. Koronale skiver (B) og (C) viser høyresidig ventrikkelutvidelse spesielt tydelig i avsnitt 10-12 (C, piler). I seksjoner (B) og (C) står "F" for fast og "C" for frossen (på italiensk: congelato). (D)Andre tilfelle: alvorlig infarkt på høyre halvkule. (E) Tredje tilfelle: atrofi av høyre mammillary kropp (pil). (F, G) Fjerde tilfelle: mikroskopiske bilder viser en mer intens TDP-43 immunoreaktivitet i frontal høyre cortex (G) sammenlignet med den venstre (F) i tilfelle av frontotemporal demens. Vektstenger: 183 μm (F, G). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 6: Makroseksjoner. (A, C) Koronale skiver av fast fronto-temporal lobe (A) og fersk parietal lobe (C). (B)Histologisk fronto-temporal seksjon immunolabeled med AT8 antistoff. Immunoreaktivitet er tydelig fordelt over hele cortex, men mer intens i tinninglappen. (D)Histologisk parietalseksjon farget med LFB. Pilen indikerer et område med demyelinasjon av den hvite saken. Vekt bar: 1,55 cm (B, D). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 7: Tvillinger. Sammenligning mellom hjernen til to homozygous tvillinger: BB137 (A, C, E, G, I, K) og BB138 (B, D, F, H, J, L). De nevropatologiske bildene er svært like. (A) og (B) viser diffus 4G8 positivitet i occipital lobe med amyloid plakk, leptomeningeal (piler) og parenchymale (pilspisser) fartøy. Kapillær amyloid angiopati (stjerner) er godt anerkjent ved høyere forstørrelser (G) og (H). 4G8 er diffust fordelt over basalganglia(C, D) og rundt leptomeningeal fartøy av lillehjernen (I, J: piler). AT8 immunoreaktivitet identifisere floker, tråder og plakk (piler) i parietal cortex (E, F). Gallyas farging (K) avslører neuritiske plakk som AT8 antistoff (L) gjør. Vektstenger: 470 μm (A–F; I-J); 90 μm (G–H; K–L). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 8: Klinisk versus nevropatologisk diagnose. I dette tallet rapporteres to forskjellige tilfeller der den nevropatologiske diagnosen er forskjellig fra den kliniske diagnosen. Immunoreaktivitet for α-syn er et uventet resultat. (A-C) Første tilfelle: Gyrus cingoli (A) viser homogen fordeling av Lewy-legemer i SN (B-piler). I et nevron av SN vises en dobbel Lewy-kropp omgitt av nevromelanin (C). (D-G) Andre tilfelle: En diffus positivitet for α-syn kan påvises i amygdala (D, E) og Meynert kjerne (F, G). Cellulære kropper og Lewy neuritt (stjerne) er godt merket. Vektstenger: 154 μm (A, D, F); 37 μm (B, E, G); 20 μm (C). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 9: Mal for overføringsavtale. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

		N	%
Kjønn	Menn	607	45.9
	Kvinner	714	54.1
Fødselskohort	1935	236	17.8
	1936	219	16.6
	1937	264	20.0
	1938	305	23.1
	1939	297	22.5
Sivilstand	Gift	872	66.1
	Samboere	13	1.0
	Separert/skilt	29	2.2
	Enke	325	24.6
	Enkelt	80	6.1
Yrke for primært liv	Arbeidere med blå krage	666	50.6
	Arbeidere med hvit krage	459	34.9
	Husmor	191	14.5
År med utdanning	≤5 år	754	57.2
	>5 år	565	42.8

Tabell 1: Sosiodemografiske trekk ved InveCe.Ab-studiedeltakerne.

INKLUSJONSKRITERIER	EKSKLUDERINGSKRITERIER
Alle personer over 18 år	Personer som åpenlyst nekter donasjon
Folk som bor innenfor territoriet til Abbiategrasso	Folk som bor utenfor Lombardia-regionen
Frivillige som gir samtykke på egen hånd	Avvik mellom potensielle donor- og NOKs ønsker om hjernedonasjon
Fagene kan ikke bestemme med NOK tillatelse	Situasjoner som i stor grad ødelegger konsistensen av hjernen
Død av en naturlig årsak	Klinisk forløp på <2 år med mindre muligheten for prionsykdom er utelukket
	Død forårsaket av drap eller selvmord, med behov for en rettsmedisiner rapport
	Post mortem intervall > 30 timer

Tabell 2: Kriterier for hjernedonasjon.

I 1999 ble det	sex	KODE BB	KODE InveCe	Alder	edu (år)	Klinisk diagnose			Cdr	Afs	Pm (timer)	pH vev	pH brennevin	nevropatologisk diagnose
1	F	37 år gammel		87	5	Major-NCD på grunn av AD (BPSD)			5	2	29	Nd	Nd	Høy AD-patologi, moderat SVD, TDP43+, ctx LTS, HS
2	F	105 år gammel: 105 000 0		94	5	Major-NCD på grunn av AD			5	1	5	5.72	6.78	Høy AD-patologi, mild SVD, HS
3	F	137 år gammel		83	3	Major-NCD på grunn av flere etiologier (AD-VaD)			5	1	16	Nd	Nd	Høy AD-patologi, moderat SVD, occipital infarkt, CAA-capCAA
4	M	181 år gammel: 181 181		71	13	Major-NCD på grunn av AD (BPSD)			5	2	3	Nd	Nd	Alvorlig LTS (Strand IV), mellomliggende AD-patologi, mildSVD, mCAA
5	M	115 år gammel	Jeg 636	78	18	Major-NCD på grunn av AD			5	1	6	Nd	Nd	Mellomliggende AD, moderat SVD, betennelse, ILBD (Strand IIa), HS
6	F	Bb 23 Leilighet	Jeg 65	79	3	Major-NCD på grunn av vaskulær sykdom			5	1	14	Nd	Nd	Alvorlig og utbredt CAA, mellomliggende AD-patologi
7	M	102 102 000 000	Jeg 412	79	8	Major-NCD på grunn av vaskulær sykdom			3	1	8	Nd	Nd	Vaskulær demens, ILBD
8	M	224 224 2000- 20	Jeg 16	80	3	Major-NCD på grunn av flere etiologier			5	1	11	Nd	5.99	Moderat SVD, lav AD-patologi, ILBD (Beach IIa), HS
9	F	100 000 000 0		78	5	Major-NCD til flere etiologier (LBD-VaD BPSD)			5	0	8	Nd	Nd	Høy AD patologi, BG TAU patologi, ARTAG, mild SVD, HS
10	F	153 år gammel	Jeg 965	79	5	Mild-NCD (død på grunn av tykktarmskreft med utbredt metastase)			0.5	1	8	Nd	6.73	Lav AD-patologi, moderat BG-SVD
11	M	118 år gammel: 118 118	I 1211	79	13	NOLD (død på grunn av leverkreft)			0	2	3	Nd	6.51	Moderat SVD
12	M	236 2000- 2009:	Jeg 521	80	3	Major-NCD på grunn av AD (BPSD)			4	1	15	Nd	6.15	Høy AD-patologi, Alvorlig BG-SVD (flere mikroblyd), HS
13	F	138 år gammel		85	3	Major-NCD på grunn av flere etiologier (AD-VaD BPSD)			4	0	15	Nd	6.75	Høy AD-patologi, moderat SVD, CAA, limbisk TDP43
14	M	109 år gammel: 109 000 0	Jeg 876	79	8	NOLD (død på grunn av hjernesvulst - GBL)			0	1	16	Nd	6.4	Lav AD patologi, ILBD (Beach IIa), mild SVD
15	F	271 271 271 2000		84	8	Major-NCD på grunn av AD (BPSD)			4	1	2	Nd	6.7	Mellomliggende AD, limbisk LTS, moderat BG-SVD, mCAA, TDP
16	F	71 000 000 00	I 1080	79	8	NOLD (død på grunn av hjertesvikt)			0	0	6	Nd	6.26	Moderat BG-SVD, ILBD, amy TDP, lav AD
17	F	189 år gammel: 189 år gammel	Jeg 858	80	5	Major-NCD på grunn av AD (BPSD)			3	0	20	Nd	6.42	Mellomliggende AD, CAA-capCAA, TDP43, moderat BG-SVD, HS
18	F	278 278 278 2000	Jeg 924	80	5	Major-NCD på grunn av LBD (BPSD)			3	1	5	6.02	7.05	Mellomliggende AD, limbisk LTS (Strand IV), limbisk TDP, HS
19	F	247 247 Leilighet		104	8	Major-NCD på grunn av flere etiologier (sannsynligvis blandet patologi)			3	0	6	6.48	7.22	TAU patologi (PART-ARTAG), HS
20	M	100 000 000 0	Jeg 19	83	10	Major-NCD på grunn av LBD (BPSD)			3	1	9	6.26	7.3	Alvorlig limbisk LTS, mellomliggende AD, Moderat SVD, alvorlig CAA-capCAA, HS
21	F	14 14 år gammel	Jeg 222	82	8	Major-NCD på grunn av flere etiologier (AD-VaD)			2	1	11	5.59	6.4	Mellomliggende AD-patologi, Moderat SVD
22	F	282 282 Leilighet		76	8	Major Frontotemporal NCD (nfPPA BPSD)			3	1	10	6.07	6.39	TDP (type A), ILBD, moderat SVD, lav AD, HS
23	F	154 år gammel	Jeg 1079	80	5	NOLD (død på grunn av kreft med utbredt metastase)			0	1	5	6.49	6.9	moderat SVD, CAA, lav AD, limbisk encefalitt
24	F	290 290- og 290-tallet		65	13	hoved Frontotemporal NCD (bvFTD BPSD)			5	1	12	5.73	6.42	TDP (type A)
25	F	210 210: 100 000		89	8	Major-NCD på grunn av AD (BPSD)			5	1	15	5.94	6.4	pågår
26	M	293– 293: 2000-		75	18	Major Frontotemporal NCD (bvFTD BPSD)			5	1	8	6.14	6.83	pågår
27	F	1000 000 000	Jeg 1370	79	9	NOLD (død på grunn av septisk sjokk)			0	2	14	6.3	7.12	pågår
	M/F			Mener	Mener				Mener	Mener	Mener	Mener	Mener
	0.5			81	7.7				3.2	1.0	10.4	6.1	6.6

Tabell 3: Klinisk/nevropatologisk diagnose av ABB-serien. BB: Hjernebank; edu (år): utdanningsår; CDR: Klinisk demensvurdering (0 = ingen demens; 0,5 = mild kognitiv svekkelse; 1 = mild demens; 2 = moderat demens; 3 = alvorlig demens; 4 = svært alvorlig demens; 5 = terminal demens); AFS: Agonal faktor score; PM (timer): Post Mortem timer; nd: ikke ferdig; M/F: Menn/kvinner; BPSD: Atferdsmessige og psykologiske symptomer på demens; VaD: Vaskulær demens; NOLD: Normale eldre; GBL: Glioblastom; nfPPA: ikke flytende primær progressiv afasi; bvFTD: atferdsvariant av Frontotemporal Demens; SVD: Liten fartøy sykdom; LTS: Lewy Type Synucleinopathy; HS: Hippocampal sklerose; CAA: Cerebral amyloid angiopati; kapCAA: kapillær CAA; mCAA: meningeal CAA; ILBD: Tilfeldig Lewy Body Disease; BG: Basal Ganglia; ARTAG: Aldersrelatert TAU Astro-Gliopati; DEL: Primær aldersrelatert tauopati; Amy: amigdala.

Domene	Test navn
Depresjon	Senter for epidemiologiske studier depresjon skala (CES-D) [2]
Global kognisjon	Mini-mental tilstand undersøkelse (MMSE) [1]
Verbalt og visuelt minne	Gratis og cued selektiv minnetest [3]
	Corsi-testen [4]
	Rey-Osterrieth Complex Figur (ROCF) Tilbakekalling [5]
Oppmerksomhet/ psykomotorisk hastighet	Trail gjør A [6]
	Oppmerksomhetsmatriser [4]
Språk-semantisk minne	Semantisk verbal flyt (farger, dyr, frukt, byer) [4]
Utøvende funksjoner	Sti gjør B [6]
	Ravnens fargede matriser [7]
Visuospatiale evner	Test for klokketegning (CDT) [8]
	Rey-Osterrieth Kompleks Figur (ROCF) Kopier [5]

Tabell 4: Nevropsykologisk vurdering for hjernedonorer.

Metabolitter

Fullstendig blodtelling

Kolesterol HDL og LDL

Triglyserider

Glukose

Glykert hemoglobin (HbA1c)

Homocystein

Kobalamin (Vitamin B12)

Folat

Albumin

Urea

Kreatinin

Transaminaser (ALAT og ASLAT)

Gamma Glutamyl transferase

Skjoldbruskstimulerende hormon (TSH)

Vitamin D (25-hydroksy-vitamin D)

C-reaktivt protein (CRP)

Elektrolytter

Tabell 5: Metabolsk panel for hjernedonorer.

GENNAVN	2007: 100 000
Apolipoprotein E (APOE)	Rs429358 Inn
	Rs7412 Inn
Katalase (CAT)	Rs1001179 Inn
Superoksid dismutase 2 (SOD2)	Rs4880 Inn
Angiotensinogen (AGT)	Rs699 Inn
Sirtuin 2 (SIRT2)	Rs10410544
Translocase av ytre mitokondriemembran 40 (TOMM40)	Rs2075650
Bygge bro over integrator 1 (BIN1)	Rs7561528
Katekol-O-metyltransferase (COMT)	Rs4680 Inn
Metylenetrahydrofolate reduktase (MTHFR)	Rs1801133
	Rs1801131
Hjerneavledet nevrotrofisk faktor (BDNF)	Rs6265 Inn
operatørfamilie 6, medlem 4 (SLC6A4 eller 5HTT)	Hydroksytryptamintransportør genbundet polymorfe region (5-HTTLPR)
	Rs25531

Tabell 6: SNPer analysert for InveCe.Ab hjernedonorer.

Prosessen	Løsning	Varighet
		MAKROEKSEMPLER	MIKROPRØVER
Fiksering	10% BUFRET FORMALIN	8 dager ved 4 °C	8 dager ved 4 °C
Vaske	FOSFATBUFFER	2-15 dager ved romtemperatur	2-15 dager ved romtemperatur
Vaske	H2O VASK	2-3 timer, vann fra springen	2-3 timer, vann fra springen
Dehydrering	ETYLALKOHOL 70%	24 timer på h	8 timer ( 8 t )
Dehydrering	ETYLALKOHOL 80%	24 timer på h	4 timer ( 4 t )
Dehydrering	ETYLALKOHOL 90%	60 t (vanligvis i løpet av helgen)	4 timer ( 4 t )
Dehydrering	ETYLALKOHOL 95%	12 timer på h	4 timer ( 4 t )
Dehydrering	ETYLALKOHOL 95%	12 timer på h	4 timer ( 4 t )
Dehydrering	ETYLALKOHOL 100%	6 timer på h	4 timer ( 4 t )
Dehydrering	ETYLALKOHOL 100%	6 timer på h	4 timer ( 4 t )
Fjerne	XYLENE I	12 timer på h	10 t
Fjerne	XYLENE II	12 timer på h	10 t
Infiltrasjon	PARAFIN I	12 timer på h	11 timer på h
Infiltrasjon	PARAFIN II	12 timer på h	11 timer på h
Innebygging	PARAFIN VOKS

Tabell 7: ABB vev behandlingsprotokoll.

Regionen	&H&E	CRESIL FIOLETT	Lfb (andre)	GALLYAS	4G8 (andre personer)	AT8	α-SYN	TDP-43	Neun	GFAP
Hjernestammen
Medulla- Dorsal Motor Nucleus av Vagus	X					X	X
Pons - Locus Coeruleus	X					X	X
Midbrain - Substantia Nigra	X				X	X	X
Lillehjernen
Cerebellar cortex og Dentate kjerne	X	X	X		X
CEREBRUM
Midtre frontal gyrus	X	X	X		X	X	X	X
Basal Ganglia + kjernen av Meynert	X	X	X		X				X	X
Cingulate, fremre	X	X	X		X		X		X	X
Amygdala	X					X	X	X	X	X
Thalamus og Subthalamus kjerne	X					X
Overlegen og middels temporal gyri	X	X	X	X	X	X	X		X	X
Hippocampus og Entorhinal cortex	X	X	X	X	X	X	X	X	X	X
Dårligere parietal lobule	X	X	X	X	X	X	X
Occipital cortex	X		X		X	X	X
Olfaktorisk pære	X						X

Tabell 8: Vurderte regioner, farging og immunohistochemistry.

Discussion

Kritiske trinn i protokollen
Vårt mål er å oppnå, karakterisere og lagre vev av god kvalitet som kommer fra med detaljert historie avledet fra langsgående observasjon. For å nå dette målet, er det nødvendig å håndtere følgende viktige aspekter. Som beskrevet ovenfor begynner protokollen med rekruttering av givere, som er det første avgjørende trinnet. Deretter er det nødvendig at giverne fortsetter oppfølgingsprogrammet og opprettholder vedheftet til prosjektet over tid til den faktiske donasjonen av hjernen. På dødstidspunktet er det nødvendig for ABB-ansatte å bli umiddelbart varslet for å innkalle obduksjonsteamet innen 24 timer, og er viktig for tilstrekkelig vevskvalitet. Fersk skjæring av hjernehalvkulene krever en jevn hånd og en bestemt trening. For å unngå cellulære skader forårsaket av langsom frysing og oppnå skiver av god kvalitet for kryostat og omics, er det viktig at de fryses raskt. Tatt i bruk hastigheten på penetrasjon av formalinløsning (1 mm/ time), for å bevare vevantigenisitet, holdes soakingtiden til enkeltskiven på sitt minimum.

Feilsøking av metoden
For å løse de kritiske trinnene nevnt ovenfor tilbyr vi følgende tilnærming. Donorrekruttering og overholdelse av oppfølging: Det er flere faktorer som hindrer hjernedonasjon, inkludert frykt for å skade kroppens figur, renhet og integritet, eller muligheten for å føle smerte etter døden. Noen bekymrer seg til og med for at obduksjonen kan utføres mens de fortsatt er i^{live 70,71}. Bekymringer om forstyrrelse av begravelse ordninger og økonomisk byrde er også til stede⁷². Videre kan et medisinsk personells mangel på kunnskap om postmortemprosedyrer og manglende evne til å ta opp bekymringene til potensielle givere eller deres nok fraråde registrering. Alle disse faktorene kan gi et lavt bevissthetsnivå med et lavt antall registrerte deltakere og en høy mulighet for donortap over tid. Faktisk bør rekrutteringsprogrammet for givere være effektivt for å spre bevissthet, skape tillit og overbevise folk om å registrere seg og opprettholde høye oppfølgingsdeltakelser. Etter vår erfaring gjøres dette gjennom nøye utvalg av potensielle givere og grundig forklaring av BB's formål. Vi tilbyr pedagogiske aktiviteter og en empatisk tilnærming som tar for seg både friske menneskers frykt og behov og de som er rammet av nevrodegenerative sykdommer og deres familier. Vi finner at potensielle givere er mer sannsynlig å gi sitt samtykke når de nærmer seg personlig. En ansikt-til-ansikt tilnærming skaper et forhold basert på gjensidig tillit og respekt som er grunnleggende for å oppnå en høy prosentandel av registrering til hjernedonasjon og oppfølgingsvurderinger. En høyt utdannet stab med en sterk følelse av etikk først nærmer seg den potensielle donor, diskuterer muligheten for å donere hjernen etter døden, forklarer verdien av menneskelig hjernevev til nevrovitenskapelig forskning, og klargjør enhver tvil om postmortem prosedyrer. Gunstig jungeltelegrafen er like viktig. Etter hjernehøstingen gis passende oppmerksomhet og forsiktighet for å komponere på nytt. Det er viktig å vise respekt og takknemlighet til den avdøde ved å behandle forsiktig. Noen måneder etter skal et møte kommunisere resultatene av den nevropatologiske analysen når de blir bedt om av familiemedlemmer.

Dødstidspunktet og hjernehøsting: Når personen aksepterer, blir de donor og får et identifikasjonskort med et nummer for å kontakte 24 timer /dag, 7 dager /uke (mottaksnummeret til ASP Golgi-Redaelli Geriatric Hospital som er koblet til oss). Videre er det gitt en klebende tag til de pårørende som skal brukes ved sykehusinnleggelse. Begravelsesbyråene i området ble tidligere informert om å bringe liket til ABB-anleggene, hvor obduksjonsteamet er innkalt. Obduksjonsteamet består av en patolog, en nevrolog og / eller en nevrobiolog, og en anatomisk romtekniker, som er på vakt fra 06:00 til 23:00 hver dag; noen trainee studenter er også ofte til stede for å hjelpe og ta bilder.

Presisjonen og konsistensen av de friske kutteprosedyrene sikres ved involvering av de samme to operatørene (en nevrolog og en patolog) som har utviklet metoden og har flere års erfaring innen nevropatologi. Når de fryser skivene, blir de satt på et prefrozen aluminiumsbrett og dekket med en forrigling aluminiumsplate for å holde dem godt flate. Umiddelbart etter blir de satt i flytende nitrogen i 3 minutter, før de oppbevarer dem ved -80 °C. Skivene som skal festes er individuelt innpakket i gasbind, og gjennomvåt i en 10% fosfat bufret formalinløsning, som erstattes etter en dag. Deretter holdes de i formali ikke mer enn 5 ekstra dager; Men med tanke på at formalinløsningen trenger inn på 1 mm / dag, ønsker vi å forkorte ytterligere soaking tid.

Begrensninger av metoden
Forskningsmetoden som er beskrevet her dekker bare et begrenset geografisk område, og personene som er involvert i donasjonsprogrammet har egenskaper som ikke representerer befolkningen helt. Selv om det er mer enn akseptabelt, kan et postmortemintervall opptil 24 timer gi endringer i noen proteinstrukturer, enzymer og RNA av hjernevev. Fastsettelsen av AFS og pH er kanskje ikke helt tilstrekkelig for å bestemme vevskvalitet^73, og vi utvikler andre måter å autentisere vevskvalitet basert på RNA-integritet.

Når det gjelder mikrotomkuttprosedyren, selv om det er svært nyttig for å rekonstruere anatomiske relasjoner, bør det bemerkes at bruk av makroseksjoner ikke er enkel og presenterer noen tekniske vanskeligheter. Vår metode er utfordrende og tidkrevende. Kostnadene er ganske høye og finansiering er ikke alltid lett. Finansieringen kommer hovedsakelig fra offentlig (ASP Golgi-Redaelli Geriatric Hospital) og private ressurser (Golgi-Cenci Foundation), private donasjoner, ideelle organisasjoner (f.eks. "Federazione Alzheimer Italia") og gir deltakelse.

Betydningen av ABB-metoden med hensyn til eksisterende/alternative metoder
I begynnelsen målrettet vårt hjernedonasjonsprogram enkeltpersoner som deltar i InveCe.Ab-langsgående studie. Som en konsekvens er hjernen donert ledsaget av detaljert klinisk, biologisk og sosial informasjon samlet inn gjennom årene. Styrken til ABB stammer nettopp fra denne særegne opprinnelsen. Faktisk, studere en gruppe av sosialt og genetisk relaterte mennesker som deler biologiske egenskaper og miljøeksponeringer forbedrer statistisk analyse. Videre inkluderer studien følgende fordeler: 1) Ser etter og sørger for behovene til samfunnet (loven om å "gi før du spør"): folk får en gratis periodisk kontroll som fastlegen er informert, et telefonnummer til vår sekretær er gitt for konsultasjoner, og alvorlig funksjonshemmede mennesker besøkes hjemme; 2) Engasjerende deltakere, personer med offentlige roller og allmennleger i pedagogiske aktiviteter gjennom organisering av periodiske seminarer (knyttet til hjernens helse, hjernedonasjon og generell helse), og planlegging av tematiske kurs (f.eks. bruk av informasjonsteknologi enheter for eldre); 3) Møte folk og vedta en ansikt til ansikt tilnærming. Alle disse elementene utgjør styrken i ABB-prosjektet. Videre forbedrer prosjektet de kliniske evnene til involvert medisinsk personell, da de får erfaring i både antemortem vurderinger og postmortem nevropatologiske evalueringer. I denne forbindelse vil vi gjerne nevne den svært særegne opplevelsen av "The minority aging research study". Denne studien involverte et begrenset og utvalgt antall afroamerikanere bosatt i Chicago-området (784 av 1357 kvalifiserte fag: responsrate på 57%). Deltakerne ble besøkt årlig hjemme og ble bedt om å bli med i hjernen donasjon programmet. Denne studien er basert på en uvanlig tilnærming med noen likheter med vår å få høye prosentandeler av positiv respons på hjernen donasjon programmet (352 givere av 784 deltakere ble registrert: 44%), om enn obduksjonsgraden var ikke helt tilfredsstillende (53%)⁷⁴. Akkurat som i "The minority aging research study", tilbyr vi pedagogiske aktiviteter og en empatisk tilnærming, og oppnår gode resultater. Spesielt er vår svarprosent 93%, registreringsprosenten er 28,7%, og obduksjonshastigheten for øyeblikket er 67%. Disse prisene viser at prosjekter som direkte engasjerer folk har en mer betydelig prosentandel av donasjoner. Andre hjernedonasjonsprogrammer, med mindre oppmerksomhet til å bygge et forhold med potensielle givere, har generelt en lav registreringsprosent, som er rundt 10-15% eller mindre^73,,75.

Det er få tidligere kohortstudier som slutter med en nevropatologisk analyse. Videre er flertallet av hjernebanker og repositorier sykdomsditorier sykdomsditorier, og det er en knapphet på "kontroll" hjerner fra friske givere sammenlignet med antall "syke" hjerner. Bare et begrenset antall BB er basert på befolkningsstudier som involverer både syke og normale forsøkspersoner for å studere^{aldringsbaner 73,74,,76,,77,,78,,79,,80}.^, Noen studier som "The minority aging research study" i USA⁷⁴ og "The Vantaa 85+ studien" i Finland⁷⁶ ligner vår, men de har en tendens til å løpe ut med avslutningen av kohorten. I stedet er ABBs donasjonsprogram tenkt å fortsette i lang tid i fremtiden, verve potensielle givere og planlegge oppfølginger selv etter slutten av InveCe.Ab longitudinal studien. Denne tilnærmingen gjør vår rekrutteringsmetode lik den av "Sun Health Research Institute (SHRI) hjernedonasjon program" som er rettet mot et pensjonistsamfunn⁷³. SHRI-protokollen for hjernedonasjon er svært effektiv med det korteste gjennomsnittlige postmortemintervallet i verden (3,92 timer). I likhet med de største BBs i verden, SHRI protokollen bare kutte cerebrum, lillehjernen og hjernestammen i midtlinjen (skytten plan), deretter den ene halvdelen er dissekert frisk og frosset for biokjemiske studier, mens den andre er løst i formalin for histopatologisk vurdering. En av styrkene til SHRI-disseksjonsprotokollen er imidlertid fiksering av individuelle skiver i stedet for hele halvkule. Faktisk er fiksering av en halvkule som helhet ikke optimal, på grunn av de forskjellige fikseringsgradientene mellom overflaten og kjernen. Videre kan de kortikale proteinene påvirkes av langvarig eksponering for formalinløsningen. Dermed grunnen til at vi bestemte oss for å fikse individuelle skiver.

Beslutningen om hvilken side som er fast eller frosset, avhenger av entallsbanken (alltid den samme, tilfeldig tildelt eller tildelt avhengig av om dagen for disseksjon er oddetall eller jevn)^{31,32,33,34,35}. Så utføres biokjemisk og histopatologisk analyse separat på hver halvkule. Så mange nevrologiske sykdommer er asymmetriske, tilbyr vår BB en unik protokoll for å kutte ferske prøver: alternative seksjoner fra hjernestammen og fra hver halvkule av lillehjernen og cerebrum beholdes som fast eller frosset materiale; et fast stykke på den ene halvkule tilsvarer en frossen på den andre halvkule. Vår metode gir mulighet til å oppnå en fullstendig histologisk karakterisering av alt frosset materiale og å sammenligne resultatene fra alle områder av begge sider. Som sagt i innledningen, metoden beskrevet tillater oss å få så mye informasjon som mulig fra hjernevevet. Videre gir ABB-metoden en grunnleggende, men fullstendig nevropatologisk karakterisering, inkludert nesten alle kjente hjerneproteinopatier og vaskulær patologi. På grunn av den kontroversielle rollen vaskulære skader i å bestemme kognitiv svekkelse, bestemte vi oss for å bruke en dobbel scoring for vaskulær^{byrde 30,53}.

Som forklart i protokollen, bruker vi en tverrfaglig tilnærming. Selv om dette er en tidkrevende og arbeidstært metode, mener vi det gir flere fordeler for forskning. For eksempel, i et tidligere arbeid, viste vi at høy tHcy per se, eller MTHFR C677T TT forbundet med APOE-ε4 allele, kan være relatert til utøvende dysfunksjoner i stedet for hukommelsestap⁸¹. Derfor kan det være interessant å evaluere forsøkspersoner med denne spesielle genetiske profilen på nevropatologisk nivå. Dette er et eksempel på hvordan en slik grundig oppfølging er nyttig for å skape nye forskningshypoteser som kan etterprøves gjennom utredning av biologisk materiale samlet inn i banken vår. En annen demonstrasjon av fordelen med vår tilnærming er inkludering av QEEG blant vurderingene vi rutinemessig utfører, for sin originalitet og den relative brukervennligheten. Faktisk oppdager EEG den synaptiske aktiviteten til hjernebarken ved å registrere de elektriske potensialet til dendritter som tilhører kortikale pyramidale nevroner⁸². QEEG kan betraktes som en biomarkør for estimering av kortikal synaptisk aktivitet som er relatert til kognisjon⁸³. Spesielt har en reduksjon i alfarytmer i den bakre delen av hjernen med en generell økning av lavere frekvenser (theta- og deltarytmer) vært relatert til kortikal forbindelsessammenbrudd. Det bør vurderes at de fleste av de diagnostiske korrelasjonsstudiene har vært basert på en klinisk diagnose som bare er en sannsynlig og ikke en bestemt^{diagnose 84,,85,,86,,87}. Bare svært få målrettede studier har sammenlignet QEEG-data med det nevropatologiske bildet for å undersøke sammenhengen mellom QEEG- og LTS-varianter^88,,89og skillet mellom FTLD og AD⁸³. Ved å avslutte vår studie med en definisjon av nevropatologisk diagnose, er det da mulig å tolke observasjonene som er gjort på den cerebrale elektriske aktiviteten på riktig måte. Videre utfører seriell QEEG i hvert emne kan vi spore intra-individuelle EEG bølger bane og deres korrelasjoner med det nevropatologiske bildet. Etter individuelle modifikasjoner av kortikal elektrisk aktivitet over tid kan føre til en bedre forståelse av sin betydning som en biomarkør for begynnende demens.

Fremtidige applikasjoner og retning av metoden
Implementering av vevsfordelingen er et av våre viktigste potensielle mål. For å gjøre dette, vi har nettopp etablert en vitenskapelig kommisjon inkludert direktør for GC Foundation (geriatrician), en akademiker av nevrologi fra Universitetet i Pavia, en nevrolog og en patolog både fra GC Foundation & Geriatric Hospital ASP Golgi-Redaelli. Når du distribuerer hjernevev, histologiske lysbilder og andre biologiske prøver, er det viktig å huske at givere ble enige om donasjonen for forskningens skyld. Fordelingen av materiale bør derfor skje forsvarlig, akkurat som beskrevet i BNE Code of Conduct⁴⁰. Enhver part som sender inn en forespørsel om materiale, skal angi typen og mengden av utvalget som trengs, gi en beskrivelse av forskningsprosjektet og hvordan prøvene skal brukes, og når det er mulig, levere bevis på tidligere publikasjoner (for overføringsavtalen, se figur 9). Hjernebanken fungerer ikke for økonomisk vinning. Så, avgifter betalt av forskere bør bare dekke utgifter til vev anskaffelse, behandling, lagring og distribusjon.

Planer om å begynne å analysere tilfeller med eksomsekvensering og Omics teknikker, som proteomics og transkripsjonsmikromikk, er i bevegelse. Vår alternative prøvetakingsmetodikk vil tillate omics studier som skal utføres på histologisk veldefinerte vev fra begge halvkuler. Gjennom denne tilnærmingen vil det være mulig å sammenligne mønsteret av genaktivering i forskjellige hjerneområder på samme halvkule og i de tilsvarende områdene på den andre halvkule, og kunne korrelere genaktivering med histopatologi. På dette feltet vil dype læringsprogrammer være av stor interesse, inkludert datastyrt analyse av histologiske lysbilder og banebrytende korrelasjon av kliniske, histologiske og omics data. Andre sammenhenger mellom mange forskjellige variabler kan identifiseres så vel som andre mulige teknologiske anvendelser. Tilgjengeligheten av frosset materiale fra begge halvkuler vil tillate en nøyaktig topografi av genaktivering og proteindistribusjon. Dette vil være av spesiell interesse selv hos friske, med tanke på at både hjernefunksjoner og noen sykdommer er asymmetriske.

Videre kan vi få cellekulturer fra velemerte hjernedonorer. Faktisk leverer cellekulturer fra leptomeningene av høstede hjerner levende celler som kan brukes til videre undersøkelse av sykdom eller aldringsmekanismer, ved hjelp av den induserte pluripotente stamceller (iPSCs) teknologi som innebærer omprogrammering av leptomeningeal fibroblaster og differensiere dem i nevrale celler i avanserte^{modeller 90}.

Som hjernens alder kan forskjellige profiler av endring forekomme på molekylært, cellulært og vevsnivå. Hver hjerne er unik. Hver har sin egen måte å reagere på interne og eksterne stressfaktorer; noen motstår mens andre bukker under og viser forskjellige patologier. Uoverensstemmelser mellom den kliniske presentasjonen og det nevropatologiske bildet eksisterer ofte fordi topografien av lesjonene, i stedet for deres molekylære natur, bestemmer den kliniske presentasjonen. Den riktige og bestemte diagnosen kan bare oppnås ved å kombinere det kliniske syndromet med nevropatologiske funn som ofte legger til viktige etiologiske ledetråder som er nødvendige for å løse patogenesen av sykdommene. I Europa er det et forsøk på å skape en standard tilnærming til nevropatologisk diagnose. Vår diagnostiske protokoll følger nesten helt de nylig publiserte retningslinjene for nevropatologisk diagnose for hjernebank⁹¹. Dette vil tillate oss å samle og dele godt dokumentert hjernevev, med det potensielle målet om å etablere den første italienske Brain Bank. Faktisk, i Italia er det hjernerepositorier, men ikke hjernebanker basert på kohortstudier. Vårt mål er å utvikle en metode for hjernevevhøsting som kan implementeres bredt over hele Italia, for å etablere et nettverk som bruker en felles protokoll og deler sammenlignbart materiale. For å gjøre det, involvering av andre forskningssentre og etableringen av et bestemt nettsted er blant hovedmålene for fremtiden.

Innovative teknologier blir stadig brukt til analyse av molekylær natur nevrodegenerative sykdommer og for biomarkøridentifikasjon. I denne sammenheng vil det være et økende behov for hjerner ledsaget av informasjon om kognitive og aldrende baner oppnådd gjennom langsgående studier, med vekt på viktigheten av en nevropatologisk verifisert epidemiologisk tilnærming⁹².

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
50ml polypropilene conical tube 30x115mm	BD	405253
Anti-GFAP	Dako	Z0334	policlonal primary antibody (anti-rabbit); dilution = 1:1000
Anti-NeuN (A60)	Chemicon	MAB377	monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000
Anti-phospho TAU (AT8)	ThermoScientific	MN1020	monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:200
Anti-phospho TDP-43 (pS409/410-2)	CosmoBio	TIP-PTD-P02	policlonal primary antibody (anti-rabbit) ; dilution = 1:4000; pretreatment : Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6
Anti-α-SYN (KM51)	Novocastra	NCL-L-ASYN	monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:500; pretreatment: 1) Three step in microwave for 2 min-1 min-2 min with citrate buffer 0.01M pH 6 ; 2) 70% formic acid in H2O for 10 min
Anti-βamyloid (4G8)	BioLegend	800703	monoclonal primary antibody (anti-mouse); dilution = 1:1000; pretreatment : 70% formic acid in H2O for 10 min
Cutting board	BD	352070
DMEM High Glucose	Carlo Erba	FA30WL0101500	medium
Electrical saw with 5d blade	CEA	06.06.14/06.00.16
Electrode pH measure surface 12mm	CEA	70064.250 HHH
Electrode pH needle	Fisher Scientific	11796338
EnVision+System-HRP	Dako	K4001	secondary antibody (anti-mouse); dilution 1:2
EnVision+System-HRP	Dako	K4003	secondary antibody (anti-rabbit); dilution 1:2
Ethylether	SMI	8401530
Feather safety trimming knife blade 14cm	Fisher Scientific	11749798
Fetal Bovine Serum	Carlo Erba	FA30WS1810500	medium supplement; dilution = 20%
Forceps 15cm surgical or anatomical	Uvex	500XG
Gloves	CEA	01.28.14
Glue	Arcobaleno	2624000800002
Head supporter	Lacor	60456
L-Glutamine (100X)	Carlo Erba	FA30WX0550100	medium supplement; dilution = 1%
Measuring tape	CEABIS	CEATA34
Non adsorbable monofilament black polyamide	UHU Bostik	8000053131470
Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Life Technologies	11140050	medium supplement; dilution = 1%
Pen/Strept Solution (100X)	Carlo Erba	FA30WL0022100	medium supplement; dilution = 1%
Spinal needle quincke tipe point 20GA 3.50IN 0.9x90mm	CEA	03.06.16
Sterile scalpel with n°21 blade
Surgical basin	Olcelli Farmaceutica	A930857255
Surgical mallet and surgical cisel	CEA	79.68.88
Surgical scissor	CEA	27.08.45/79.68.64
	Feather	M130RC