Summary
أورام الغدد الصماء العصبية (الناموسيات) تنشا من خلايا الغدد الصماء العصبية. فهي بطيئه النمو وتحديا للثقافة. نحن نقدم استراتيجية بديله لزراعه الشباك من الأمعاء الصغيرة عن طريق الخياطة لهم كما خزان. هذه الخزان لديها علامات الأمعاء الصغيرة NET ويمكن استخدامها لاختبار المخدرات.
Abstract
أورام الغدد الصماء العصبية الصغيرة (SBNETsات) هي سرطانات نادره منشؤها خلايا enterochromaffinه من الأمعاء. وقد كان البحث في هذا المجال محدودا لأنه تم إنشاء عدد قليل جدا من خطوط الخلايا SBNET المستمدة من المريض. خلايا SBNET المتمايزة بشكل جيد بطيئه النمو ويصعب نشرها. والخطوط الخلوية القليلة التي أنشئت ليست متاحه بسهوله ، وبعد وقت في الثقافة قد لا تستمر في التعبير عن خصائص الخلايا NET. توليد خطوط الخلايا الجديدة قد يستغرق سنوات عديده منذ الخلايا SBNET لديها وقت مضاعفه طويلة وهناك حاجه إلى العديد من الخطوات الإثراء من أجل القضاء علي الأورام الليفية المرتبطة بالسرطان بسرعة الانقسام. للتغلب علي هذه القيود ، قمنا بتطوير بروتوكول للثقافة SBNET الخلايا من الأورام المزالة جراحيا كما خزان في مصفوفة خارج الخلية (ECM). يشكل ECM مصفوفة ثلاثية الابعاد تغلف خلايا SBNET وتحاكي البيئة الصغرى للورم للسماح لخلايا SBNET بالنمو. هنا ، ونحن ميزت معدل النمو من SBNET خزان ووصفت طرق لتحديد علامات SBNET باستخدام المجهر المناعي ومناعي للتاكد من ان الخزان هي خلايا الورم الغدد الصماء العصبية. الاضافه إلى ذلك ، استخدمنا SBNET خزان لاختبار السمية الخلوية من rapamycin.
Introduction
الأورام العصبية المعوية الصغيرة (سبنتس) تنشا من خلايا enterochromaffinه من الأمعاء الصغيرة. علي الرغم من انه من المعروف عموما SBNETs تنمو ببطء, انها تنتشر عاده إلى الكبد1. في حين يمكن النظر في أزاله الجراحية أو استئصال الورم في كثير من الحالات ، وتكرار يكاد يكون عالميا ، التالي ، العلاج الطبي يلعب دورا هاما في الاداره. وقد استثمرت جهود هائله لتوليد خطوط خلوية جديده SBNET لاختبار المخدرات. ومع ذلك ، لم يكن هناك نجاح يذكر. فقط 6 خطوط الخلايا sbnet (krj-I, CND2, GOT1, ف-sts, L-sts, H-sts) وقد تم الإبلاغ عن2,3,4,5; وللاسف خط خليه واحده لم يعد يعبر عن علامات NET6 وثلاثه أخرى خطوط الخلية sbnet (krj-I ، L-Sts ، H-sts) كانت مصممه علي ان تستمد من الليمفاوية تحولت بدلا من الشباك7. وللتعجيل بتحديد الادويه اللازمة لاستهداف الشبكات الكهربائية الخاصة ، هناك حاجه إلى أساليب بديله لاختبار المخدرات في المختبر.
هنا ، ونحن نستفيد من توافر SBNETsات وانشات وسيله للثقافة هذه SBNETs المستمدة من المريض كما خزان النمو في ECM. الهدف العام لهذه المخطوطة هو وصف طريقه للثقافة SBNET كثقافة ثلاثية الابعاد (3D) والخطوط العريضة الإجراءات لتوصيف هذه الخزان للاحتفاظ بعلامات SBNET عن طريق تلطيخ المناعي والمناعي.
الاضافه إلى ذلك ، فاننا نظهر كيف يمكن استخدام هذه SBNET خزان لاختبار تاثير rapamycin ، وهو دواء مضاد للسرطان لشبكات8. الأساس المنطقي وراء هذا البروتوكول هو تطوير طريقه جديده لزراعه خلايا SBNET في المختبر واستخدامها لاختبار المخدرات. الميزة من هذا تقنيه علي الطريقة تقليديه من يؤسس [سبنت] خليه خط ان ثقافات [3 د] من [سبنتس] يستطيع بسرعة كنت نلت واختبار المخدر يستطيع كنت أنجزت ضمن 3 أسابيع. ويمكن استخدام SBNET خزان كنموذج لأداء في شاشات المخدرات في المختبر لتحديد الادويه الجديدة للمرضي SBNET. منذ خطوط الخلايا SBNET ليست متاحه علي نطاق واسع ، والثقافات 3D من خزان SBNET يمكن ان تكون بمثابه نموذج جديد في المختبر لدراسة Sbnetات ويمكن تقاسمها بين العلماء في هذا المجال.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تمت الموافقة علي جميع التجارب باستخدام عينات الورم العصبي الغدد الصماء البشرية من قبل جامعه أيوا مستشفي وعيادات اللجنة الهجرة والامومه (البروتوكول رقم 199911057). وترد قائمه بجميع المواد والمعدات في جدول المواد. وترد في الجدول 1قائمه بوسائط النمو والحلول الرئيسية.
1. أورام الأمعاء العصبية الصغيرة (SBNET) جمع وتفكك الخلية
- الحصول علي عينات SBNET المريض المقسمة بعد تاكيد انسجه الأورام من النواة الجراحية الامراض.
- قطع SBNETs إلى مكعبات 5 ملم وتخزينها في 25 مل من DMEM/F12 المتوسطة في أنبوب مخروطي للنقل إلى المختبر.
- نقل الأورام في DMEM التي تحتوي علي 1 ٪ ، 1 ٪ البنسلين/ستربتومايسين (القلم/بكتيريا) ، 1 ٪ الجلوتامين (غسل المتوسطة) واحتضان في هذا المتوسط يغسل لمده 15 دقيقه.
- نقل الأورام إلى طبق جديد والأورام المفروم إلى اقل من 1 ملم القطع باستخدام مقص المنحنية العقيمة.
- نقل الانسجه المفروم إلى أنبوب 50 mL جديده تحتوي علي 25 مل من غسل المتوسطة.
- الطرد المركزي العينة في 500 x g لمده 15 دقيقه في 4 ° c.
- تجاهل ماده طافي وأعاده تعليق الكريات في 10 مل من غسل المتوسطة التي تحتوي علي كولاجيناز (100 U/ml) و dnase (0.1 mg/ml).
- السماح بهضم الأورام المفرومة تحدث في حاضنه 37 درجه مئوية مع اهتزاز بطيء (50 دوره في الدقيقة) ل 1.5 h.
2. ثقافة من [سبنتس] بما ان ورم خزان في [ECM]
- بعد اكتمال عمليه الهضم (الخطوة 1.8) ، جهاز الطرد المركزي في 500 x g لمده 15 دقيقه في 4 °c ، وتجاهل ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في 15 مل من غسل المتوسطة.
- وضع مصفاه الخلية 70 μm علي راس أنبوب 50 mL جديده ونقل 10 مل من متوسط غسل فوق مصفاه الخلية. دوامه غسل المتوسطة لتغطيه الجانب من أنبوب من البلاستيك لمنع الخلايا NET من التصاق إلى جانب أنبوب من البلاستيك.
- تصفيه تعليق الخلية من خلال مصفاه الخلية.
- جهاز الطرد المركزي في 500 x g لمده 15 دقيقه في 4 °c ، وتجاهل supernatant ، وأعاده تعليق بيليه في 200 Μl من غسل المتوسطة (حجم الكلي هو ~ 250 μl) ووضعه علي الجليد.
- نقل 5 μL من الخلايا إلى 500 μL من غسل المتوسطة (1/100 عامل التخفيف). استخدم الخلايا المخففة لعد الخلايا باستخدام مقياس الكريات الدموية للحصول علي عدد الخلايا في المليلتر. اضرب ب100 لتصحيح عامل التخفيف.
- ضرب عدد الخلايا لكل مل الحصول عليها في الخطوة 2.5 بالحجم الإجمالي للخلايا في تعليق الحصول عليها في الخطوة 2.4 (~ 250 μL).
- جهاز الطرد المركزي في 500 x g لمده 15 دقيقه في 4 °c ، وتجاهل supernatant ، وأعاده تعليق الخلايا في ECM السائل (1 × 106 خلايا/مل) والحفاظ علي الجليد.
- نقل 5-20 μL من SBNET خزان في ECM إلى لوحه 96 البئر والسماح لل ECM السائل ليصلب عن طريق وضع لوحه في الحاضنة 37 درجه مئوية لمده 5 دقائق.
- أضافه 200 μL من المتوسطة الثقافة SBNET (DMEM/F12 + 10 ٪ + 1 ٪ القلم/بكتيريا + 1 ٪ الجلوتامين + 10 ملم نيكوتيناميد + 10 ميكروغرام/مل الانسولين) إلى كل بئر من لوحه 96-حسنا التي تحتوي علي خزان SBNET في ECM.
- بدلا من ذلك ، الثقافة SBNET العضوية في وسائل الاعلام الخلايا الجذعية مماثله لما سبق وصفه لزراعه الكبد البشري أو البنكرياس العضوي9 والمدرجة في جدول المواد.
- تغيير الوسائط كل 5-7 يوما.
3. القياس الكمي لحجم كروي SBNET باستخدام ImageJ
- التقاط 5-10 الصور من SBNET خزان في اليوم 1 ، 4 ، 7 ، 14 ، 23 و 97 من الثقافة باستخدام هدف 10x.
- افتح الصور المحفوظة في ImageJ. انتقل إلى علامة التبويب تحليل ، حدد الخيار تعيين القياسات ووضع الاختيار علي منطقه الخيار.
- استخدم أداه التحديد البيضاوية من شريط الاداات لإنشاء مجسم اهليلجي أو دائره حول كروي مركزه بشكل جيد.
- انتقل إلى علامة التبويب تحليل وحدد الخيار قياس . كرر الخطوات 3.4 و 3.5 من أجل الحصول علي قياس مساحة من 25-50 SBNET خزان. يتم توفير القيم في مربع بكسل.
- تحويل منطقه بكسل إلى μm2 عن طريق تقسيم حجم كل بكسل مع طول كل بكسل لعامل التحويل ميكرومتر من الصور المجهري.
ملاحظه: خلايا SBNET تنمو أساسا كما خزان وأحيانا الاهليلجي.
4-توصيف الخزان المناعية لل SBNETS
- نقل العضو العضوي المزروع في ECM إلى أنبوب 1.5 مل باستخدام ماصه P1000.
- الطرد المركزي في 1,500 x g لمده دقيقه واحده وأزاله supernatant.
- غسل الثقافة العضوية عن طريق أضافه 1 مل من تلفزيوني ، مزيج ، الطرد المركزي في 1,500 x g لمده 1 دقيقه وأزاله supernatant.
- إصلاح الهيكل التنظيمي عن طريق أضافه 500 μL من 4 ٪ بارافورمالدهيد واحتضان لمده 15 دقيقه.
- غسل الثقافة مرتين مع 1 مل من تلفزيوني.
- يتخلل الثقافة عن طريق أضافه 500 μL من تلفزيوني + 3 ٪ بوسنيا + 0.1 ٪ تريتون X 100 لمده 5 دقائق.
- ثم يغسل لمده ثلاث مرات مع 1 مل من تلفزيوني + 3 ٪ جيش الصرب البوسنيين.
- احتضان لمده 1 ساعة مع الأجسام المضادة الاوليه ضد سينابتوفيسين (SYP)10 في 1/600 التخفيف أو كروموغرانين A (cga)11 ومستقبلات سوماتوستاتين 2 (SSTR2)12 في 1/400 التخفيف في العازلة المضادة (2.5 ٪ الزلال المصل البقري ، 0.1 ٪ الصوديوم أزيد ، 25 ملم تريس pH 7.4 ، 150 mM كلوريد الصوديوم).
ملاحظه: استخدام 300 μL أو أكثر من حل الأجسام المضادة لكل أنبوب. - يغسل ثلاث مرات مع 1 مل من تلفزيوني + 3 ٪ جيش الصرب البوسنيين.
- احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية إلى FITC في التخفيف 1/500 في العازلة المضادة ل 1 ح. استخدام 300 μL أو أكثر من حل الأجسام المضادة لكل أنبوب.
- يغسل 3 مرات مع 1 مل من تلفزيوني + 3 ٪ بوسني. تاكد من ان يستنشق والتخلص من كل supernatant.
- أضافه 5 μL من المتوسطة المتصاعدة التي تحتوي علي DAPI وصمه عار النووية.
- استخدام ماصه P20 لنقل 5 μL من خزان SBNET من الخطوة 4.12 إلى شريحة زجاجيه وختم مع زلة الغطاء.
- التقاط الصور باستخدام المجهر الفلورسنت باستخدام 10x ، 20x أو 40x الأهداف.
5-التوصيف الخزان لشركه SBNET بواسطة مناعي (IHC)
- نقل SBNET خزان من لوحه الثقافة إلى أنبوب 1.5 mL باستخدام ماصه P1000.
- الطرد المركزي في 1,500 x g لمده دقيقه واحده وأزاله supernatant.
- إصلاح sbnet خزان عن طريق أضافه 500 μl من 10 ٪ الفورمالين إلى أنبوب من الخطوة 5.2 واحتضان في درجه حرارة الغرفة لمده 2-5 أيام قبل تضمين البارافين وقطع 4 ميكرون سميكه كروي المقاطع.
- المغادرين ، وأعاده هيدرات ، واستخدام استرداد الحرارة المستحثة في محلول Antigen استرداد في pH 9 عن طريق التسخين إلى 97 درجه مئوية لمده 20 دقيقه باستخدام 3 في 1 محطه معالجه الشرائح الألى لاعداد الشرائح لاحتضان الأجسام المضادة.
- كتله الشرائح واحتضان مع الأجسام المضادة الاوليه ضد10 ليرة سوريه في تخفيف 1/100 لمده 15 دقيقه ، cga11 في 1/800 التخفيف لمده 15 دقيقه ، SSTR212 في 1/5000 التخفيف لمده 30 دقيقه.
- احتضان مع نظام الكشف عن الأجسام المضادة الثانوية لمده 15 دقيقه لتلطيخ لل ليرة سوريه و CgA و 30 دقيقه لتلطيخ المضادة لSSTR2. التقاط الصور باستخدام هدف 400x.
6. علاج العضو العضوي sbnet مع راباميسين
- ذوب راتاميسين في DMSO للحصول علي حل الأسهم 10 ملم.
- اعداد sbnet الثقافة المتوسطة مع dmso (علي سبيل المثال ، 1 مل من sbnet الثقافة المتوسطة + 1 μl من dmso) و sbnet الثقافة المتوسطة مع 10 ميكرومتر من راباميسين (علي سبيل المثال ، 1 مل من sbnet الثقافة المتوسطة + 1 μl من 10 مم راباميسين الأسهم الحل).
- نقل 200 μl الوسائط مع وسط الثقافة sbnet مع dmso أو 10 μM راباميسين إلى الثقافات كروي sbnet.
- احتضان SBNET خزان لمده 5 أيام في 37 درجه مئوية حاضنه.
- أضف 1 μM من ايثيديوم هوديومير وحضن لمده 30 دقيقه. أزاله المتوسطة التي تحتوي علي التماثل المتماثل ، وغسل مع 200 μL من تلفزيوني ، ونقل 200 μL من الخدمات التلفزيونية لكل بئر.
- التقاط الصور المجهرية من SBNET خزان مع وبدون علاج المخدرات باستخدام مكعب فلتر احمر مع 10x ، 20x ، أو 40x الأهداف من المجهر الفلورسنت.
ملاحظه: تظهر الخلايا الميتة الملطخة بالحمص الأحمر الملون بالحمراء باستخدام المكعب المرشح الأحمر G من المجهر المتاح تجاريا (جدول المواد). بدلا من ذلك ، يمكن التقاط اشاره باستخدام مقياس طيفي في 535 nm الاثاره و 624 nm الانبعاثات.
7. تقسيم SBNET خزان
ملاحظه: يتم ذلك للتوسع والمشاركة مع الباحثين الآخرين.
- استخدام ماصه P1000 لكسر ميكانيكيا ECM ويستنشق ECM مع SBNET خزان أنبوب معقم 1.5 mL.
- الطرد المركزي في 1,000 x g في 4 درجه مئوية ، وأزاله كل ماده طافي ووضع أنبوب علي الجليد.
- أضافه 2-4x حجم ECM جديده لبيليه. خلط ECM الجديد مع ECM القديمة و SBNET خزان عن طريق التنضيد صعودا وهبوطا 10x. تجنب إدخال فقاعات الهواء.
- نقل 5-20 μL لمزيج ECM و SBNET خزان إلى لوحه جديده والسماح ECM لترسيخ.
- تغطيه مع المتوسطة SBNET الجديدة ونقل إلى الحاضنة. ويبلغ معدل الاسترداد حوالي 95 إلى 100 في المائة.
- للشحن خزان SBNET إلى مختبر آخر ، نقل SBNET خزان مع ECM جديده إلى قارورة T25 والسماح ECM لترسيخ.
- ملء قارورة T25 مع SBNET كروي المتوسطة ، والمسمار علي الغطاء باحكام ، واعداد حزمه الشحن.
- عند تلقي الثقافة كروي SBNET ، أزاله المتوسطة الثقافة وتنفيذ الخطوة 7.1 إلى 7.5 لوضع SBNET خزان مره أخرى في الثقافة.
8. مخزن واستعاده خزان SBNET
- نقل SBNET خزان من 5-10 الآبار الصغيرة إلى أنبوب 15 مل. أجهزه الطرد المركزي في 500 x g لمده 15 دقيقه في 4 °c ، أزاله supernatant ، أعاده التعليق في تجميد المتوسطة (90 ٪ + 10 ٪ dmso) ، تخزين في حاويه تجميد الخلية ، ووضع هذا في-80 درجه مئوية.
- نقل إلى النيتروجين السائل لتخزين أطول.
- لاستعاده خزان SBNET ، ضع القارورة المجمدة علي الثلج وانتظر حتى يذوب المحتوي تماما. عكس الأنبوب وأعاده وضعه علي الجليد من أجل تسريع عمليه الذوبان.
- مره واحده يتم أذابه العينة ، وضعت داخل الطرد المركزي قبل المبردة وتدور في 1,000 x g لمده 10 دقيقه.
- أزاله ماده طافي وأعاده تعليق خزان في ECM. الحفاظ علي أنبوب علي الجليد ، ونقل 20 μL إلى لوحه جديده ، والانتظار لل ECM لترسيخ.
- نقل 200 μL من وسط الثقافة SBNET مع 10 μM من المثبط روك (27632)13 ونقل إلى الحاضنة.
- السماح لخزان SBNET بالانتعاش والنمو لمده أسبوع واحد. أزاله المتوسطة الثقافة القديمة ، وتجديد مع 200 μL من المتوسطة الثقافة SBNET والعودة إلى الحاضنة.
- السماح لخزان SBNET بالاستمرار في النمو.
ملاحظه: يستغرق الأمر أسبوعا واحدا علي الأقل لخزان المتزايدة بسرعة للبدء في التعافي بعد التجميد13. SBNET خزان تاخذ الحد الأدنى من 2-4 أسابيع للبدء في النمو. سوف يموت العديد من الخلايا SBNET خلال الأسابيع الاولي 2 ومعدل البقاء علي قيد الحياة اقل من 10 ٪. لان هذا هو عمليه تستغرق وقتا طويلا جدا ومنخفضه الغلة ، فمن الأفضل لتبادل مع الباحثين الآخرين SBNET خزان في قوارير الثقافة (كما هو موضح في الخطوة 7). يجب استخدام مخزن والاسترداد فقط كخطه احتياطيه في حاله حدوث تلوث بكتيري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هناك حاليا فقط 2 خطوط الخلية sbnet التي أنشئت ونشرت2,3,4,5 وانها ليست متاحه بسهوله لكثير من الباحثين. هنا, نقترح علي الثقافة SBNET كما خزان في ECM واستخدام هذا كنموذج بديل لدراسة الحساسية SBNET المخدرات. تم جمع الورم المشتق من المريض من SBNET التي انتشرت إلى الكبد ، وهضمها للإفراج عن خلايا SBNET ، ومختلطة مع ECM السائل لإنشاء ثقافة كروي SBNET (الشكل 1ا). كان ال [كي-67] من هذا [سبنت] 4.3%. علي الرغم من ان SBNET خزان لديها معدل نمو بطيء ، ويمكن رصد نموها عن طريق التصوير المجهري (الشكل 1ا). هو ياخذ تقريبا 14 أيام ل [سبنت] خزان ان يضاعف في حجم عندما الثقافة أوساط يكون غيرت مره في أسبوع (شكل 1[ب]). بعد 14 يوما في الثقافة ، SBNET خزان لا تزيد في الحجم. بدلا من ذلك ، سيتم فك بعض خلايا SBNET إلى موقع مجاور وتشكيل خزان جديده. لنشر الثقافة خزان SBNET, حصاد ECM التي تحتوي علي SBNET خزان وreseed لهم في لوحه الثقافة الجديدة مع الوسط الثقافي الجديد (الخطوة 7).
للتاكد من ان الثقافات العضوية تحتوي علي خلايا sbnet ، ونحن وصف طريقه بسيطه وسريعة لوصمه عار خزان لعلامات sbnet مثل سينابتوفيسين ، كروموغرانين a ، ومستقبلات سوماتوستاتين نوع 2 (SSTR2) باستخدام المجهر المناعي (IF) ( الخطوة 4). باستخدام الأجسام المضادة المحددة ضد سينابتوفيسين ، كروموغرانين A و SSTR2 ، أظهرت بيانات IF لدينا ان هذه العلامات مترجمه في السيتوبلاسما وفي غشاء خلايا sbnet (الشكل 2ا، باللون الأخضر) بعد 1 أو 9 أشهر في الثقافة (Fف 2b ). لضمان خصوصية الأجسام المضادة ليرة سوريه و cga و SSTR2 ، أجرينا نفس إجراءات تلطيخ علي خط organoid من ورم البنكرياس التي لا تعبر عن ليرة سوريه أو cga أو SSTR2 (الشكل 2ج) كما لم يتم الكشف عن اشاره خضراء. الميزة الرئيسية لهذه التجربة كروي IF SBNET هو انه يمكن القيام به في غضون 4 ساعات ويعطي المعلومات تلطيخ مماثله كما مناعي (IHC; الشكل 3). نحن نقدم بروتوكول لأداء IHC من خزان SBNET في الخطوة 5.
الخياطة SBNET كما خزان تقنيه قيمه لتحديد الادويه التي يمكن ان تمنع نمو SBNET. كدليل علي المبدا ، عالجنا sbnet خزان مع راباميسين لمده 5 أيام ، مثبط mtor ، فئة من الادويه التي تستخدم عاده لعلاج الناموسيات8. بالمقارنة مع سيطرتنا SBNET كروي ، شكلت كروي rapamycin المعالجة العنب مثل هيكل وأصبح ابوتوتيك أو نخريه (الشكل 4ا-د). ويمكن الكشف عن خلايا الموت باستخدام Ethidium homodimer لوصمه عار الحمض النووي والجيش النيبالي الريبي وتوليد اشاره حمراء ساطعه14. لا يمكن لهذه الصبغة اختراق غشاء الخلية من الخلايا الحية.
الشكل 1: أورام الغدد الصماء العصبية المعوية الصغيرة المستمدة من المريض (sbnets) المزروعة في مصفوفة خارج الخلية (ECM) كما خزان. (ا) عزل الخلايا السرطانية من sbnets المقسمة ووضعها في الثقافة عن طريق الاختلاط مع ECM. شريط مقياس يمثل 100 μm. (ب) المساحة السطحية لخزان sbnet فيما يتعلق بعدد الأيام في الثقافة الكمية باستخدام imagej. تم الحصول علي البيانات من SBNET خزان من 1 المريض ويتم تمثيلها باعتبارها منطقه متوسط ± خطا قياسي من المتوسط. وتم قياس المساحة السطحية التي تبلغ 30 إلى 60 خزان لكل نقطه زمنيه. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تلطيخ المناعة (IF) من خزان sbnet. إذا تلطيخ خزان SBNET بعد (ا) 1 شهر في الثقافة و (ب) 9 أشهر في الثقافة. (ج) إذا تلطيخ البنكرياس الأورام العضوية التي لا تعبر عن علامات sbnet كعناصر التحكم السلبية. تم إصلاح خزان الورم في 4 ٪ بارافورمالدهيد وملطخه باستخدام الأجسام المضادة ضد سينابتوفيسين (SYP) في 1/600 التخفيف ، كروموغرانين A (cga) في 1/400 التخفيف ، ومستقبلات سوماتوستاتين 2 (SSTR2) في 1/400. IF تم التقاط الصور في 100 ms ، 200 ms و 400 ms وقت التعرض ل ليرة سوريه ، CgA و SSTR2 تلطيخ ، علي التوالي باستخدام 10x ، 20x أو 40x الأهداف. شريط مقياس يمثل 50 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مناعي (ihc) تلطيخ خزان sbnet. فورالين-الثابتة والبارافين جزءا لا يتجزا من خزان SBNET الأقسام كانت المغادرين ، وأعاده ترطيب ، وسدت وملطخه (ا) ليرة سوريه ، (ب) cga ، و (ج) SSTR2 الأجسام المضادة. تم التقاط الصور باستخدام الهدف 400x. شريط مقياس يمثل 50 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: استخدام sbnet خزان لاختبار المخدرات. (ا) صوره الحقل الساطع من SBNET خزان تعامل مع dmso لمده 5 أيام. (ب) صوره من sbnet خزان التعامل مع dmso وملطخه بالحمص الايثديمير (Ethidium H). (ج) صوره الحقل الساطع لكروي sbnet الميت تشكيل هيكل مثل العنب بعد العلاج مع 10 μM من راباميسين لمده 5 أيام. (د) القتلى sbnet كروي الملطخة مع الايثديه ح يظهر النقاط الحمراء. تم التقاط صور من تلطيخ Ethidium H باستخدام مكعب مرشح الأحمر في 100 ms الوقت التعرض. شريط مقياس يمثل 10 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
| وسائل الاعلام النمو أو الحل | تكوين |
| غسل المتوسطة | المحتوي الذي يحتوي علي 1% من الأقلام ، 1% من القلم/البكتيريا ، 1% الجلوتامين |
| [سبنت] ثقافة متوسطه | DMEM/F12 + 10 ٪ من الأقلام + 1 ٪ القلم/بكتيريا + 1 ٪ الجلوتامين + 10 ملم نيكوتيناميد + 10 ميكروغرام/مل الانسولين |
| عازل الأجسام المضادة | 2.5 ٪ الزلال المصل البقري ، 0.1 ٪ الصوديوم أزيد ، 25 ملم تريس الأس الهيدروجيني 7.4 ، 150 مم كلوريد الصوديوم |
| تجميد المتوسطة | 90% + 10% |
| الكبد البشري عزل الخلايا الجذعية المتوسطة | DMEM/F12, 1% القلم/بكتيريا, 1% جلوساماكس, 10 مم HEPES, 1/50 الملحق B27, 1/100 N2 الملحق, 1 مم N-اسيتيل, 200 ng/mL Rspo 1, 50ng/mL EGF, 100 ng/mL FGF10, 10 مم نيكوتيناميد, 10 ام فورسكولين, 5 Um A83-01 |
| الإنسان البنكرياس الجذعية عزل الخلية المتوسطة | DMEM/F12 ، 1 ٪ القلم/بكتيريا ، 1 ٪ جلوساماكس ، 10 ملم HEPES ، 1/50 الملحق B27 ، 1/100 N2 الملحق ، 1 مم ن-اسيتيل ، 200 ng/mL Rppi 1 ، 25 نانوغرام/مل نوجين ، 50ng/mL EGF ، 100 ng/mL FGF10 ، 10 ملم نيكوتيناميد ، 10 ام فورسكولين ، 5uM A83-01 ، 3 uM PGE-2 |
الجدول 1 قائمه وسائل الاعلام النمو والحل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أصبحت الثقافات الورم 3D موردا قيما لاختبار المخدرات قبل السريرية15. وقد أنشئت في الاونه الاخيره الأورام العضوية المختلفة بيوانكات من سرطان الثدي وأورام سرطان البروستاتا16,17. في هذه الدراسة ، ونحن نقدم بروتوكولا مفصلا للثقافة SBNET كما خزان وطريقه بسيطه وسريعة للتحقق من صحة الثقافات الكروية للعلامات صافي من قبل المناعي واختبار حساسية المخدرات. من تجربتنا ، يمكن خزان SBNET تنمو في وسائل الاعلام الثقافية المختلفة. انها تنمو بشكل أسرع قليلا في وسائل الاعلام الخلايا الجذعية البنكرياس البشري أو الكبد العزلة التي قمنا بتكييفها من البروتوكولات المنشورة سابقا9. اخترنا ان تنمو SBNETs في DMEM/F12 المتوسطة تستكمل مع الانسولين نيكوتيناميد لان هذا هو اقل تكلفه من وسائل الاعلام الخلية الجذعية. زيادة النسبة المئوية لمصل الأبقار الجنينية هي استراتيجية أخرى لتعزيز نمو الثقافات العضوية SBNET; ومع ذلك ، فان هذا من شانه أيضا زيادة التكلفة الاجماليه لصيانة الثقافة.
أداء IF تلطيخ والتصوير مع المجهر الفلورسنت باستخدام 10x ، 20x أو 40x الأهداف هي طريقه سريعة وبسيطه لاختبار علامات SBNET التعبير. ومع ذلك ، فانه لا يعطي توطين محدده بشكل جيد بالمقارنة مع IHC (الشكل 2، الشكل 3). علي سبيل المثال ، أظهرت بيانات IF انه من الصعب الكشف عن تعريب الغشاء SSTR2. نحن أساسا الكشف عن SSTR2 عصاري خلوي ، والتي سبق الإبلاغ عن18. من أجل الحصول علي توطين أفضل للبروتينات علامة ، ونحن نوصي باستخدام IF والمجهر البؤري. عموما ، IF هو وسيله مفيده لتاكيد بسرعة علامات SBNET. الأجسام المضادة لدينا (مكافحه-ليرة سوريه ، المضادة--cga ، المضادة لSSTR2) لم تتفاعل مع العضوية التحكم السلبية التي لا تعبر عن ليرة سوريه ، cga ، أو SSTR2 (الشكل 2ج) في IF التجربة. هذا الاقتراح ان إشارات الفلورسنت التي اكتشفناها محدده ل SBNET خزان.
لزيادة الغلة من خزان SBNET ، والخطوات الحرجة من هذا البروتوكول هي اثناء خطوه الترشيح الخلية (الخطوة 2.2) وخلط SBNET مع ECM السائل لنقلها إلى لوحات ثقافة الانسجه (الخطوة 2.8). تاكد من تغطيه غشاء مصفاه الخلية وأنبوب جمع مع وسائل الاعلام من أجل منع خلايا SBNET من التصاق إلى البلاستيك. السائل ECM سوف يصلب بسرعة إذا لم توضع علي الجليد. تاكد من ان يكون وعاء الجليد الصغيرة في النسيج الثقافة هود من أجل الحفاظ علي ECM وخلايا SBNET الباردة.
والحد من هذه التقنية هو معدل النمو البطيء لخزان SBNET. يجب تخطيط التجارب بكفاءة وتجنب استخدام كميه زائده من خزان SBNET. وهناك قيد آخر هو بطء الانتعاش بعد تجميد ذوبان الجليد. يستغرق أكثر من 1 شهر بعد ذوبان لخزان SBNET للبدء في النمو. للتغلب علي هذا القيد ، نقترح الحفاظ علي خزان SBNET باستمرار في الثقافات وتقسيمها حسب الحاجة (الخطوة 7). حتى بعد 9 أشهر في الثقافة ، خزان SBNET لا تزال تحافظ علي التعبير عن علامات SBNET (الشكل 2ب).
علي الرغم من ان ثقافة 3D من SBNET خزان هو أكثر كثافة العمل من الثقافة 2D التقليدية لخطوط الخلايا السرطانية الأخرى ، بل هو نموذج قيمه للغاية للثقافة في المختبر من SBNET لان العديد من الباحثين SBNET ليس لديهم الوصول إلى خطوط الخلايا الموجودة. مع هذا البروتوكول ، يمكن للعلماء والأطباء السريريين إنشاء الثقافات الكروية SBNET من الأورام التي تم تقسيمها ومشاركتها مع المختبرات الأخرى. الاضافه إلى ذلك ، خزان sbnet يمكن ان تستخدم لإنشاء sbnet نماذج الماوس طعم الغيروي المستمدة من المريض. وعموما ، يمكن تكييف التقنيات المعروضة هنا لأغراض الزراعة ، وتوصيف وأداء اختبار المخدرات من الشبكات الأخرى مثل شبكات البنكرياس أو الرئة. لاحظ ان معدل نمو الهيكل التنظيمي سيختلف بين أنواع مختلفه من الناموسيات وعينات المريض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منح P50 CA174521 (إلى J.R. هاو و ص Bellizzi). عدسه P.H. الاذن هو المتلقي لجائزه برنامج تعزيز الحياة المهنية P50 CA174521.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-rabbit FITC | Jackson ImmunoResearch | 11-095-152 | Secondary antibody couple to a green fluorophore |
| Antigen Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | Solution at pH 9 for preparing slides for IHC |
| Autostainer Link 48 | Agilent Dako | Not Available | Automated system for antibody staining |
| Cell freezing container | Thermo Scientific | 5100-0001 | Container to for freezing cells |
| CellSence | Olympus | Version 1.18 | Computer software for using fluorescent microscope |
| Chromogranin A antibody | Abcam-45179 | RB-9003-PO | Antibodies for IF |
| Chromogranin A antibody (clone LK2H10) | Thermo Scientific | MA5-13096 | Antibodies for IHC |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | Medium for tissue preparation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | Medium for organoid cultures |
| DMSO | Sigma | D8418 | Solvent for dissolving drug |
| DNAse | Sigma | DN25 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| Ethidium Homodimer | Chemodex | CDX-E0012-T1E | DNA and RNA binding dye |
| FBS | Gibco | 16000044 | Reagent for culture media |
| Fluorescent microscope | Olympus | CKX35 | Microscope for taking pictures of SBENT spheroids |
| Glutamine | Gibco | A2916801 | Reagent for culture media |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.51 | Computer software for image analysis |
| Insulin | Sigma | I0516 | Reagent for culture media |
| Matrigel | Corning | 356235 | Matrix to embed and anchore organoids |
| Mounting medium (VECTASHIELD) | Vector Laboratories | H-1200 | Fixative for labelled-cells with a nuclear stain |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reagent for culture media |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Reagent to fix cells |
| PEN/STREP | Gibco | 15140-122 | Reagent for culture media |
| PT Link | Agilent Dako | Not Available | Automated system to prepare slides for IHC staining |
| Rapamycin | Alfa Aesar | J62473 | Drug that can inhibit NET growth |
| Secondary antibodies for IHC | Agilent Dako | K8000 | Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system |
| SSTR2 antibody | GeneScritp | A01591 | Antibodies for IF |
| SSTR2 antibody (clone UMB1) | Abcam | ab134152 | Antibodies for IHC |
| Synaptophysin antibody | Abcam | 32127 | Antibodies for IF |
| Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP) | Agilent Dako | M7315 | Antibodies for IHC |
| TritonX | Mallinckrodt | 3555 KBGE | Reagent to permeablize cells |
| Y-2763 ROCK inhibitor | Adipogen | AG-CR1-3564-M005 | To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw |
References
- Maxwell, J. E., Sherman, S. K., Howe, J. R. Translational Diagnostics and Therapeutics in Pancreatic Neuroendocrine Tumors. Clinical Cancer Research. 22, 5022-5029 (2016).
- Pfragner, R., et al. Establishment of a continuous cell line from a human carcinoid of the small intestine (KRJ-I). International Journal of Oncology. 8, 513-520 (1996).
- Kolby, L., et al. A transplantable human carcinoid as model for somatostatin receptor-mediated and amine transporter-mediated radionuclide uptake. American Journal of Pathology. 158, 745-755 (2001).
- Van Buren, G., et al. The development and characterization of a human midgut carcinoid cell line. Clinical Cancer Research. 13, 4704-4712 (2007).
- Pfragner, R., et al. Establishment and characterization of three novel cell lines - P-STS, L-STS, H-STS - derived from a human metastatic midgut carcinoid. Anticancer Research. 29, 1951-1961 (2009).
- Ellis, L. M., Samuel, S., Sceusi, E. Varying opinions on the authenticity of a human midgut carcinoid cell line--letter. Clinical Cancer Research. 16, 5365-5366 (2010).
- Hofving, T., et al. The neuroendocrine phenotype, genomic profile and therapeutic sensitivity of GEPNET cell lines. Endocrine Related Cancer. 25, 367-380 (2018).
- Moreno, A., et al. Antitumor activity of rapamycin and octreotide as single agents or in combination in neuroendocrine tumors. Endocrine Related Cancer. 15, 257-266 (2008).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocols. 11, 1724-1743 (2016).
- Saito, Y., et al. Establishment of Patient-Derived Organoids and Drug Screening for Biliary Tract Carcinoma. Cell Reports. 27, 1265-1276 (2019).
- Park, S. J., et al. Detection of bone marrow metastases of neuroblastoma with immunohistochemical staining of CD56, chromogranin A, and synaptophysin. Applied Immunohistochemisty and Molecular Morphology. 18, 348-352 (2010).
- Clifton-Bligh, R. J., et al. Improving diagnosis of tumor-induced osteomalacia with Gallium-68 DOTATATE PET/CT. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98, 687-694 (2013).
- Clinton, J., McWilliams-Koeppen, P. Initiation, Expansion, and Cryopreservation of Human Primary Tissue-Derived Normal and Diseased Organoids in Embedded Three-Dimensional Culture. Current Protocols in Cell Biology. 82, 66 (2019).
- Markovits, J., Roques, B. P., Le Pecq, J. B. Ethidium dimer: a new reagent for the fluorimetric determination of nucleic acids. Analytical Biochemistry. 94, 259-264 (1979).
- Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery. Cell Chemical Biology. 24, 1092-1100 (2017).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172, 373-386 (2018).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communication. 9, 2404 (2018).
- Singh, S. P., et al. SSTR2-based reporters for assessing gene transfer into non-small cell lung cancer: evaluation using an intrathoracic mouse model. Human Gene Therapy. 22, 55-64 (2011).
