Summary
I tumori neuroendocrini (NET) provengono da cellule neuroendocrine della cresta neurale. Sono in crescita lenta e impegnativi per la cultura. Vi presentiamo una strategia alternativa per far crescere le piccole viscere cullandoli come sferoidi. Questi sferoidi hanno piccoli marcatori di rete intestinale e possono essere utilizzati per i test antidroga.
Abstract
I tumori neuroendocrini intestinali piccoli (BNCR) sono tumori rari provenienti da cellule enterocrombaffina dell'intestino. La ricerca in questo campo è stata limitata perché sono state generate pochissime linee cellulari SBNET derivate dal paziente. Le cellule SBNET ben differenziate sono a crescita lenta e sono difficili da propagare. Le poche linee cellulari che sono state stabilite non sono prontamente disponibili, e dopo il tempo nella coltura potrebbero non continuare ad esprimere le caratteristiche delle cellule NET. La generazione di nuove linee cellulari potrebbe richiedere molti anni perché le cellule SBNET hanno un lungo tempo di raddoppio e sono necessari molti passaggi di arricchimento per eliminare i fibroblasti associati al cancro. Per superare questi limiti, abbiamo sviluppato un protocollo per la coltura delle cellule SBNET dai tumori rimossi chirurgicamente come sferoidi nella matrice extracellulare (ECM). L'ECM forma una matrice tridimensionale che incapsula le cellule SBNET e imita il microambiente tumorale per consentire alle cellule SBNET di crescere. Qui, abbiamo caratterizzato il tasso di crescita degli sferoidi SBNET e descritto i metodi per identificare i marcatori SBNET usando la microscopia immunofluorescenza e l'immunohistochimica per confermare che gli sferoidi sono cellule tumorali neuroendocrine. Inoltre, abbiamo usato sferoidi SBNET per testare la citotossicità della rapamicina.
Introduction
I tumori neuroendocrini intestinali piccoli (BNCRIT) provengono da cellule enterochromaffine dell'intestino tenue. Anche se gli SBNET sono generalmente noti per crescere lentamente, comunemente metastatizzano al fegato1. Mentre la rimozione chirurgica o l'ablazione del tumore può essere considerata in molti casi, la ricorrenza è quasi universale e, quindi, la terapia medica svolge un ruolo importante nella gestione. Sono stati investiti enormi sforzi per generare nuove linee cellulari SBNET per i test antidroga. Tuttavia, c'è stato molto poco successo. Solo 6 linee di celle SBNET (KRJ-I, CND2, GOT1, P-STS, L-STS, H-STS) sono state segnalate2,3,4,5; e purtroppo una linea cellulare non esprime più i marcatori NET6 e altre tre linee cellulari SBNET (KRJ-I, L-STS, H-STS) sono state determinate per essere derivate da linfoblasti trasformati invece di NET7. Al fine di accelerare l'identificazione dei farmaci per il targeting degli SBNET, sono necessari metodi alternativi per il test dei farmaci in vitro.
Qui, sfruttiamo la disponibilità di SBNET resezionati e abbiamo stabilito un modo per coltivare questi SBNET derivati dal paziente come sferoidi in crescita in ECM. L'obiettivo generale di questo manoscritto è quello di descrivere un metodo alla cultura SBNET come una cultura tridimensionale (3D) e delineare le procedure per caratterizzare questi sferoidi per la conservazione dei marcatori SBNET mediante colorazione immunofluorescenza e immunohistochimica.
Inoltre, dimostriamo come questi sferoidi SBNET possono essere utilizzati per testare l'effetto della rapamicina, un farmaco anti-cancro per NET8. La logica alla base di questo protocollo è quello di sviluppare un nuovo metodo per far crescere le cellule SBNET in vitro e usarle per i test antidroga. Il vantaggio di questa tecnica rispetto al metodo tradizionale di stabilire una linea cellulare SBNET è che le colture 3D di SBNETs possono essere rapidamente ottenute e test antidroga possono essere eseguiti entro 3 settimane. Gli sferoidi SBNET potrebbero essere potenzialmente utilizzati come modello per l'esecuzione di schermi di farmaci in vitro per identificare nuovi farmaci per i pazienti SBNET. Poiché le linee cellulari SBNET non sono ampiamente disponibili, le colture 3D degli sferoidi SBNET possono servire come nuovo modello in vitro per studiare gli SBNET e possono essere condivise tra gli scienziati del settore.
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Protocol
Tutti gli esperimenti che utilizzano campioni di tumore neuroendocrino umano sono stati approvati dal comitato IRB dell'Università dell'Iowa Hospital and Clinics (numero di protocollo 199911057). Un elenco di tutti i materiali e le attrezzature è descritto nella Tabella dei Materiali. Un elenco di supporti di crescita e soluzioni chiave è disponibile nella tabella 1.
1. Raccolta di tumore intestinale piccolo (SBNET) e dissociazione cellulare
- Ottenere campioni SBNET paziente resezionati dopo la conferma dei tessuti tumorali dal nucleo di patologia chirurgica.
- Tagliare gli SBNET a cubetti da 5 mm e conservare in 25 mL di mezzo DMEM/F12 in un tubo conico per il trasporto al laboratorio.
- Trasferire i tumori in DMEM contenenti 1% FBS, 1% penicillina /streptomycin (Pen/Strep), 1% glutammina (mezzo di lavaggio) e incubare in questo mezzo di lavaggio per 15 min.
- Trasferire i tumori a un nuovo piatto e tritare i tumori a pezzi meno di 1 mm utilizzando forbici curve sterili.
- Trasferire i tessuti macinati in un nuovo tubo da 50 mL contenente 25 mL di Wash Medium.
- Centrifugare il campione a 500 x g per 15 min a 4 gradi centigradi.
- Scartare il supernatante e risospendere nuovamente i pellet in 10 mL di Wash Medium contenenti collagenasi (100 U/mL) e DNase (0,1 mg/mL).
- Lasciare che la digestione dei tumori macinati si verifichi in un'incubatrice a 37 gradi centigradi con agitazione lenta (50 giri/min) per 1,5 h.
2. Cultura degli SBNET come sferoidi tumorali in ECM
- Una volta completata la digestione (passaggio 1.8), centrifugare a 500 x g per 15 min a 4 gradi centigradi, scartare il supernatante e risospendere il pellet in 15 mL di Wash Medium.
- Posizionare un colino a 70 m sopra un nuovo tubo da 50 mL e trasferire 10 mL del mezzo di lavaggio sopra il colino cellulare. Swirl il mezzo di lavaggio per coprire il lato del tubo di plastica per evitare che le cellule NET si attacchino al lato del tubo di plastica.
- Filtrare la sospensione cellulare attraverso il colino cellulare.
- Centrifuga a 500 x g per 15 min a 4 gradi centigradi, scartare il supernatante, rimettere in sospensione il pellet in 200 l of Wash Medium (il volume totale è di 250 gradi) e posizionarlo sul ghiaccio.
- Trasferire 5 o L di cellule a 500 l of Wash Medium (fattore di diluizione 1/100). Utilizzare le celle diluite per il conteggio cellulare utilizzando un emocitometro per ottenere il numero di cellule per millilitro. Moltiplicare per 100 per correggere il fattore di diluizione.
- Moltiplicare il numero di celle per mL ottenuto al punto 2,5 per il volume totale delle cellule in sospensione ottenuto al passo 2,4 (250 .
- Centrifuga a 500 x g per 15 min a 4 gradi centigradi, scartare il supernatale e sospendere nuovamente le cellule in ECM liquido (1 x 106 cellule / mL) e tenere il ghiaccio.
- Trasferire 5-20 l di sferoidi SBNET in ECM in una piastra di 96 pozzetti e lasciare che l'ECM liquido si solidifichi mettendo la piastra in un'incubatrice a 37 gradi centigradi per 5 min.
- Aggiungete a ciascuno degli sferoidi SBNET 200 L di SBNET (DMEM/F12 ) e 10% di FBS , 1% PEN/STREP , 10 m di nicotina, 10 m di nicotina, 10 g/mL di insulina) a ciascun pozzetto della piastra di 96 pozzetti contenente gli sferoidi SBNET in ECM.
- In alternativa, coltura organoidi SBNET nei media delle cellule staminali simili a quello che è stato descritto in precedenza per la coltivazione di fegato umano o organoidi pancreatici9 ed elencati nella Tabella dei Materiali.
- Cambiare i supporti ogni 5-7 giorni.
3. Quantificazione della dimensione dello sferoide SBNET utilizzando ImageJ
- Scatta 5-10 foto di sferoidi SBNET al Giorno 1, 4, 7, 14, 23 e 97 della cultura utilizzando un obiettivo 10x.
- Aprire le immagini salvate in ImageJ. Vai alla scheda Analizza, seleziona l'opzione Imposta misure e inserisci un segno di spunta sull'opzione Area.
- Usate lo strumento di selezione ovale dalla barra degli strumenti per generare un ellissoide o un cerchio attorno a uno sferoide ben focalizzato.
- Passare alla scheda Analizza e selezionare l'opzione Misura. Ripetere i passaggi 3.4 e 3.5 per ottenere la misurazione dell'area da 25-50 sferoidi SBNET. I valori sono forniti in quadrato di pixel.
- Convertire l'area del pixel in m2 dividendo le dimensioni di ogni pixel con la lunghezza di ogni pixel in fattore di conversione m delle immagini di microscopia.
NOTA: le cellule SBNET crescono principalmente come sferoidi e talvolta come ellissidi.
4. Caratterizzazione degli sferoidi SBNETS per immunofluorescenza
- Trasferire gli organoidi coltivati in ECM in un tubo da 1,5 mL utilizzando una pipetta P1000.
- Centrifuga a 1.500 x g per 1 min e rimuovere il supernatante.
- Lavare la coltura organoide aggiungendo 1 mL di PBS, mescolare, centrifugare a 1.500 x g per 1 min e rimuovere il supernatante.
- Fissare gli organoidi aggiungendo 500 gradi l del 4% di paraformaldeide e incubare per 15 min.
- Lavare la coltura due volte con 1 mL di PBS.
- Permeabiliizzare la coltura aggiungendo 500 L di PBS - 3% BSA - 0,1% Triton X 100 per 5 min.
- Quindi lavare per tre volte con 1 mL di PBS - 3% BSA.
- Incubare per 1 h con anticorpi primari contro la sinaptophysin (SYP)10 a 1/600 di luia o cromogranina A (CgA)11 e recettore somatostatino 2 (SSTR2) 12 a 1/400 diluizione nel buffer anticorpale (2,5% di albumina di siero bovina, 0,1% recisto somatostatico 2 (SSTR2)12 a 1/400 diluizione nel buffer anticorpale (2,5% di albumne di sornio bovino, 0,1% del retinistrazione di sodica bovina, 0,1% del sodiumato azide, 25 mM Tris pH 7.4, 150 mM di cloruro di sodio).
NOTA: Utilizzare 300 o più di soluzione anticorpale per tubo. - Lavare tre volte con 1 mL di PBS - 3% BSA.
- Incubazione con anticorpi secondari accoppiati al FITC a 1/500 di diluizione nel buffer anticorpale per 1 h. Utilizzare 300 o più di soluzione anticorpale per tubo.
- Lavare 3 volte con 1 mL di PBS - 3% BSA. Assicurati di aspirare e scartare tutti i supernatali.
- Aggiungere 5 - L di supporto di montaggio contenente la macchia nucleare DAPI.
- Utilizzare una pipetta P20 per trasferire 5 o più l of the SBNET sferoids dal passaggio 4.12 a uno scivolo di vetro e sigillare con uno slittamento di copertura.
- Scatta immagini utilizzando un microscopio fluorescente usando gli obiettivi 10x, 20x o 40x.
5. Caratterizzazione sferoidi SBNET per immunohistochimica (IHC)
- Trasferire sferoidi SBNET dalla piastra di coltura a un tubo da 1,5 mL utilizzando una pipetta P1000.
- Centrifuga a 1.500 x g per 1 min e rimuovere il supernatante.
- Fissare gli sferoidi SBNET aggiungendo al tubo 500 - L di formalina del 10% al tubo e incubare a temperatura ambiente per 2-5 giorni prima dell'incorporamento della paraffina e tagliare sezioni di sferoide spesse 4 m.
- Deparaffina, reidrata e utilizza il recupero dell'epitopo indotto dal calore nella soluzione di recupero dell'antigene a pH 9 riscaldando a 97 gradi centigradi per 20 minuti utilizzando la stazione di elaborazione automatica dei vetrini 3-in-1 per preparare i vetrini per l'incubazione degli anticorpi.
- Bloccare i vetrini e incubare con anticorpi primari contro SYP10 a una diluizione di 1/100 per 15 min, CgA11 a una diluizione 1/800 per 15 min e SSTR212 a una diluizione 1/5,500 per 30 min.
- Incubare con il sistema secondario di rilevamento degli anticorpi per 15 min per la colorazione anti-SYP e CgA e 30 min per la colorazione anti-SSTR2. Scattare foto utilizzando un obiettivo 400x.
6. Trattamento degli organoidi SBNET con rapamicino
- Sciogliere la rapamicicina in DMSO per ottenere una soluzione di 10 mM.
- Preparare il supporto di coltura SBNET con DMSO (ad es., 1 mL di misura di coltura SBNET - 1 -L di DMSO) e il mezzo di coltura SBNET con 10 M di rapamicina (ad esempio, 1 mL di sbil di coltura SBNET medio - 1 luna di 10 mM di soluzione di rapamicina).
- Trasferire 200 supporti con un mezzo di coltura SBNET con DMSO o 10 rapamicino a colture sferoidi SBNET.
- Incubare sferoidi SBNET per 5 giorni in 37 gradi centigradi.
- Aggiungere 1 M di ethidium homodimer e incubare per 30 min. Rimuovere il mezzo contenente ethidium homodimer, lavare con 200 l di PBS e trasferire 200 .L di PBS in ogni pozzo.
- Scatta immagini microscopiche di sferoidi SBNET con e senza trattamento farmacologico utilizzando il cubo di filtro rosso con gli obiettivi 10x, 20x o 40x di un microscopio fluorescente.
NOTA: Le cellule morte macchiate di Ethidium homodimer appaiono rosse utilizzando il cubo del filtro rosso G di un microscopio disponibile in commercio (Tabella dei materiali). In alternativa, il segnale può essere catturato utilizzando uno spettrofotometro a 535 nm eccitazione e 624 nm emissioni.
7. Divisione sferoidi SBNET
NOTA: Questo viene fatto per l'espansione e per la condivisione con altri ricercatori.
- Utilizzare una pipetta P1000 per rompere meccanicamente l'ECM e aspirare l'ECM con sferoidi SBNET a un tubo sterile da 1,5 mL.
- Centrifuga a 1.000 x g a 4 gradi centigradi, rimuovere tutto il supernatante e posizionare il tubo sul ghiaccio.
- Aggiungere 2-4 volte il volume del nuovo ECM al pellet. Mescolare il nuovo ECM con i vecchi sferoidi ECM e SBNET pipetting su e giù 10x. Evitare l'introduzione di bolle d'aria.
- Trasferire 5-20 l della miscela di sferoidi ECM e SBNET su una nuova piastra e lasciare che ECM si solidifichi.
- Coprire con il nuovo supporto SBNET e trasferire all'incubatrice. Il tasso di recupero è di circa il 95-100%.
- Per la spedizione di sferoidi SBNET in un altro laboratorio, trasferisci sferidi SBNET con il nuovo ECM su un pallone T25 e consenti a ECM di solidificare.
- Riempire il pallone T25 con il mezzo sferoide SBNET, avvitare saldamente il tappo e preparare il pacco di spedizione.
- Dopo aver ricevuto una cultura sferoide SBNET, rimuovere il mezzo di coltura ed eseguire il passaggio 7.1 a 7.5 per riportare gli sferoidi SBNET nella cultura.
8. Cryostorage e recupero di sferoidi SBNET
- Trasferire sferoidi SBNET da 5-10 piccoli pozzi a un tubo da 15 mL. Centrifuga a 500 x g per 15 min a 4 gradi centigradi, rimuovere il supernatale, rispendere nel mezzo di congelamento (90% FBS - 10% DMSO), conservare in un contenitore di congelamento cellulare, e posizionare questo a -80 gradi centigradi.
- Trasferire all'azoto liquido per una conservazione più lunga.
- Per recuperare sferoidi SBNET, posizionare la fiala congelata sul ghiaccio e attendere che il contenuto sia completamente scongelato. Invertire il tubo e riposizionare sul ghiaccio per accelerare il processo di scongelamento.
- Una volta scongelato il campione, collocato all'interno di una centrifuga pre-raffreddata e ruotato a 1.000 x g per 10 min.
- Rimuovere il supernatante e risospendere gli sferoidi in ECM. Tenere il tubo sul ghiaccio, trasferire 20 o più l su una nuova piastra e attendere che l'ECM si solidifichi.
- Trasferire 200 l di misura di coltura SBNET con 10 s di inibitore ROCK (Y-27632)13 e trasferirlo all'incubatrice.
- Consentire agli sferoidi SBNET di recuperare e crescere per 1 settimana. Rimuovere il vecchio mezzo di coltura, ricostituire con 200 L di SBNET misura coltura e tornare all'incubatrice.
- Consentire agli sferoidi SBNET di continuare a crescere.
NOTA: Ci vuole almeno 1 settimana per sferoidi in rapida crescita per iniziare a recuperare dopo la crioconservazione13. SBNET sferoidi prendono un minimo di 2-4 settimane per iniziare a crescere. Molte cellule SBNET moriranno entro le prime 2 settimane e il tasso di sopravvivenza è inferiore al 10%. Poiché si tratta di un processo di rendimento molto lungo e basso, è meglio condividere con altri ricercatori sferoidi SBNET nei flaconi di coltura (come descritto nel passaggio 7). Cryostorage e ripristino dovrebbero essere utilizzati solo come piano di backup in caso di contaminazione batterica.
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Representative Results
Attualmente ci sono solo 2 linee cellulari SBNET stabilite e pubblicate2,3,4,5 e non sono prontamente disponibili per molti ricercatori. Qui, proponiamo alla cultura SBNET come sferoidi in ECM e usiamo questo come un modello alternativo per studiare la sensibilità ai farmaci SBNET. Il tumore derivato dal paziente da un SBNET che metastatizzato al fegato è stato raccolto, digerito per rilasciare le cellule SBNET, e mescolato con ECM liquido per stabilire una coltura sferoide SBNET (Figura 1A). Il Ki-67 di questo SBNET era del 4,3%. Sebbene gli sferoidi SBNET abbiano un tasso di crescita lento, la loro crescita può essere monitorata da immagini microscopiche (Figura 1A). Ci vogliono circa 14 giorni perché gli sferoidi SBNET raddoppino le dimensioni quando i supporti dicolturavengono modificati una volta alla settimana ( Figura 1B). Dopo 14 giorni di cultura, gli sferoidi SBNET non aumentano di dimensioni. Invece, alcune cellule SBNET si dissociano in una posizione vicina e formano nuovi sferoidi. Per propagare la cultura degli sferoidi SBNET, raccogliere l'ECM contenente sferoidi SBNET e reseed in nuova coltura con nuovo mezzo di coltura (Passo 7).
Per confermare che le colture organoidi contengono cellule SBNET, descriviamo un metodo semplice e veloce per macchiare gli sferoidi per i marcatori SBNET come la sinapfitinella, la cromograna A e il recettore della somatostatina di tipo 2 (SSTR2) usando la microscopia immunofluorescenza (IF) ( Passo 4). Utilizzando anticorpi specifici contro la sinaptophysin, la cromogranina A e sSTR2, i nostri dati IF hanno mostrato che questi marcatori sono localizzati nel citoplasma e alla membrana delle cellule SBNET (Figura 2A, in verde) dopo 1 o 9 mesi di coltura (Figure 2B ). Per garantire la specificità degli anticorpi SYP, CgA e SSTR2, abbiamo eseguito le stesse procedure di colorazione su una linea organoide dal tumore al pancreas che non esprime SYP, CgA o SSTR2 (Figura 2C) in quanto non è stato rilevato alcun segnale verde. Il vantaggio principale di questo esperimento SBNET sferoide IF è che può essere eseguito entro 4 h e fornisce informazioni di colorazione simili a quelle dell'immunostochimica (IHC; Figura 3). Forniamo un protocollo per l'esecuzione di IHC degli sferoidi SBNET nel passaggio 5.
Coltivare SBNET come sferoidi è una tecnica preziosa per identificare i farmaci che possono inibire la crescita di SBNET. Come prova di principio, abbiamo trattato sferoidi SBNET con rapamicina per 5 giorni, un inibitore mTOR, una classe di farmaci comunemente usati per trattareNET8. Rispetto al nostro sferoide SBNET di controllo, lo sferoide trattato con rapamicina formava una struttura simile all'uva e diventava apoptotico o necrotico (Figura 4A-D). Le cellule morenti possono essere rilevate utilizzando Ethidium homodimer per macchiare DNA e RNA e generare un segnale rosso brillante14. Questo tinripuò non può penetrare la membrana cellulare delle cellule vive.
Figura 1: Tumori neuroendocrini intestinali (SBNEcrini) derivati dal paziente cresciuti in matrice extracellulare (ECM) come sferoidi. (A) Isolamento delle cellule tumorali da un SBNET resezionato e messo in coltura mescolando con ECM. La barra della scala rappresenta un'area di superficie di SBNET pari a 100 m( (B) rispetto al numero di giorni di coltura quantificati utilizzando ImageJ. I dati sono stati ottenuti da sferoidi SBNET di 1 paziente e sono rappresentati come l'area media - errore standard della media. La superficie di 30-60 sferoidi è stata misurata per ogni punto temporale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Colorazione immunofluorescenza (IF) degli sferoidi SBNET. SE colorazione di sferoidi SBNET dopo (A) 1 mese di cultura e (B) 9 mesi di cultura. (C) Se la colorazione degli organoidi tumorali del pancreas che non esprimono i marcatori SBNET come controlli negativi. Gli sferoidi tumorali sono stati fissati in paraformaldeide del 4% e macchiati usando anticorpi contro la sinaptophysina (SYP) a 1/600 di diluizione, la cromogranina A (CgA) a 1/400 di diluizione e il recettore somatostatico 2 (SSTR2) a 1/400. Se le immagini sono state scattate a 100 ms, 200 ms e 400 ms tempo di esposizione per sYP, CgA e SSTR2 colorazione, rispettivamente utilizzando gli obiettivi 10x, 20x o 40x. La barra della scala rappresenta 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Immunoistochimica (IHC) colorazione di sferoidi SBNET. Le sezioni di sferoidi SBNET fissati in formalina e in paraffina sono state deparaffinate, reidratate, bloccate e macchiate con (A) SYP,(B) CgA e (C) anticorpi SSTR2. Le immagini sono state scattate utilizzando l'obiettivo 400x. La barra della scala rappresenta 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Utilizzo di sferoidi SBNET per il test antidroga. (A) Immagine di campo luminoso di sferoidi SBNET trattati con DMSO per 5 giorni. (B) Immagine di sferoidi SBNET trattati con DMSO e macchiati con Ethidium homodimer (Ethidium H). (C) Immagine di campo luminoso di uno sferoide SBNET morto che forma struttura simile all'uva dopo il trattamento con 10 M di rapamicina per 5 giorni. (D) Sferoide SBNET morto macchiato di Ethidium H appare come punti rossi. Le immagini della colorazione Ethidium H sono state scattate utilizzando il cubo del filtro rosso al tempo di esposizione di 100 ms. La barra della scala rappresenta 10 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Media di crescita o soluzione | composizione |
| Mezzo di lavaggio | DMEM contenente 1% FBS, 1% PEN/STREP, 1% Glutamina |
| Mezzo di coltura SBNET | DMEM/F12 - 10% FBS - 1% PEN/STREP - 1% Glutamina , 10 mM di nicotina, 10 g di insulina |
| Buffer anticorpo | 2.5% albumina di siero bovino, 0,1% di azide di sodio, 25 mM Tris pH 7,4, 150 mM di cloruro di sodio |
| Mezzo di congelamento | 90% FBS - 10% DMSO |
| Mezzo di isolamento delle cellule staminali epatiche umane | DMEM/F12 , 1% Penna/Strep, 1% GlutaMAX, 10 mM HEPES, 1/50 B27 Supplemento, 1/100 N2 Supplemento, 1 mM N-acetylcysteine, 200 ng/mL Rspo 1, 50ng/mL EGF, 100 ng/mL FGF10, 10 m nicotina |
| Mezzo di isolamento delle cellule staminali pancreatiche umane | DMEM/F12 , 1% Penna/Strep, 1% GlutaMAX, 10 mM HEPES, 1/50 B27 Supplemento, 1/100 N2 Supplemento, 1 mM N-acetylcysteine, 200 ng/mL Rspo 1, 25 ng/mL Noggin, 50ng/mL EGF, 100 ng/mL FGF10, 10 mM nicotinamide, 10 uM forskolin, 5uM A83-01, 3 uME-PG10 |
Tabella 1. Elenco dei mezzi di crescita e della soluzione.
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Discussion
Le colture 3D tumorali sono diventate una risorsa preziosa per i test preclinici sui farmaci15. Varie biobanche organoidi tumorali sono stati recentemente stabiliti da cancro al seno e tumori del cancro alla prostata16,17. In questo studio, forniamo un protocollo dettagliato alla cultura SBNET come sferoidi e un metodo semplice e veloce per convalidare le colture sferoidi per i marcatori NET mediante immunofluorescenza e testare la sensibilità ai farmaci. Dalla nostra esperienza, gli sferoidi SBNET possono crescere in vari media culturali. Crescono leggermente più velocemente nei media delle cellule staminali per il pancreas umano o l'isolamento del fegato che abbiamo adattato dai protocolli pubblicati in precedenza9. Abbiamo scelto di far crescere gli SBNET nel mezzo DMEM/F12 integrato con insulina e nicotinamide perché questo è meno costoso dei supporti per le cellule staminali. Aumentare la percentuale di siero bovino fetale è un'altra strategia per promuovere la crescita delle colture organoidi SBNET; tuttavia, ciò aumenterebbe anche il costo complessivo per la manutenzione della coltura.
L'esecuzione di colorazione e imaging IF con una microscopia fluorescente utilizzando gli obiettivi 10x, 20x o 40x è un metodo semplice e veloce per testare i marcatori SBNET di espressione. Tuttavia, non fornisce una localizzazione ben definita rispetto a IHC (Figura 2, Figura 3). Ad esempio, i dati IF hanno mostrato che la localizzazione della membrana di SSTR2 è difficile da rilevare. Rileviamo principalmente il citosolico SSTR2, che è stato precedentemente riportato18. Al fine di ottenere una migliore localizzazione delle proteine marcatore, si consiglia di utilizzare SE e microscopia confocale. Nel complesso, IF è un metodo utile per confermare rapidamente i marcatori SBNET. I nostri anticorpi (anti-SYP, anti-CgA, anti-SSTR2) non hanno reagito incrociatamente con gli organoidi di controllo negativo che non esprimono SYP, CgA o SSTR2 (Figura 2C) nell'esperimento IF. Questo suggerimento che i segnali fluorescenti che abbiamo rilevato sono specifici per sferoidi SBNET.
Per aumentare la resa degli sferoidi SBNET, i passaggi critici di questo protocollo sono durante la fase di filtrazione cellulare (passaggio 2.2) e la miscelazione dello SBNET con l'ECM liquido per l'installazione in piastre di coltura tissutale (passaggio 2.8). Assicurarsi di coprire la membrana del ceppo cellulare e il tubo di raccolta con supporti al fine di evitare che le cellule SBNET si attacchino alla plastica. L'ECM liquido si solidificherà rapidamente se non viene posizionato sul ghiaccio. Assicurarsi di avere un piccolo contenitore di ghiaccio nella cappa di coltura dei tessuti al fine di mantenere le cellule ECM e SBNET fredde.
La limitazione di questa tecnica è il tasso di crescita lento degli sferoidi SBNET. Gli esperimenti devono essere pianificati in modo efficiente ed evitare di utilizzare una quantità in eccesso di sferoidi SBNET. Un'altra limitazione è il lento recupero dopo il congelamento del disgelo. Ci vuole più di 1 mese dopo lo scongelamento per gli sferoidi SBNET per iniziare a crescere. Per superare questa limitazione, si consiglia di mantenere continuamente gli sferoidi SBNET nelle culture e di dividerli in base alle esigenze (passaggio 7). Anche dopo 9 mesi di cultura, gli sferoidi SBNET mantengono ancora l'espressione dei marcatori SBNET (Figura 2B).
Anche se la cultura 3D degli sferoidi SBNET è più laboriosa rispetto alla tradizionale cultura 2D di altre linee cellulari tumorali, è un modello estremamente prezioso per la cultura in vitro di SBNET perché molti ricercatori SBNET non hanno accesso alle linee cellulari esistenti. Con questo protocollo, scienziati e medici possono stabilire colture sferoidi SBNET da tumori resezionati e condividerli con altri laboratori. Inoltre, gli sferoidi SBNET potrebbero essere potenzialmente utilizzati per stabilire modelli murini xenotrapfti di SBNET derivati dal paziente. Nel complesso, le tecniche qui presentate possono essere adattate per la coltura, la caratterizzazione e l'esecuzione di test antidroga di altri FORMATI come i NET pancreatici o polmonari. Si noti che il tasso di crescita degli organoidi varia tra i diversi tipi di NET e campioni di pazienti.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concede P50 CA174521 (a J.R. Howe e A.M. Bellizzi). P.H. Ear ha ricevuto il p50 CA174521 Career Enhancement Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-rabbit FITC | Jackson ImmunoResearch | 11-095-152 | Secondary antibody couple to a green fluorophore |
| Antigen Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | Solution at pH 9 for preparing slides for IHC |
| Autostainer Link 48 | Agilent Dako | Not Available | Automated system for antibody staining |
| Cell freezing container | Thermo Scientific | 5100-0001 | Container to for freezing cells |
| CellSence | Olympus | Version 1.18 | Computer software for using fluorescent microscope |
| Chromogranin A antibody | Abcam-45179 | RB-9003-PO | Antibodies for IF |
| Chromogranin A antibody (clone LK2H10) | Thermo Scientific | MA5-13096 | Antibodies for IHC |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | Medium for tissue preparation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | Medium for organoid cultures |
| DMSO | Sigma | D8418 | Solvent for dissolving drug |
| DNAse | Sigma | DN25 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| Ethidium Homodimer | Chemodex | CDX-E0012-T1E | DNA and RNA binding dye |
| FBS | Gibco | 16000044 | Reagent for culture media |
| Fluorescent microscope | Olympus | CKX35 | Microscope for taking pictures of SBENT spheroids |
| Glutamine | Gibco | A2916801 | Reagent for culture media |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.51 | Computer software for image analysis |
| Insulin | Sigma | I0516 | Reagent for culture media |
| Matrigel | Corning | 356235 | Matrix to embed and anchore organoids |
| Mounting medium (VECTASHIELD) | Vector Laboratories | H-1200 | Fixative for labelled-cells with a nuclear stain |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reagent for culture media |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Reagent to fix cells |
| PEN/STREP | Gibco | 15140-122 | Reagent for culture media |
| PT Link | Agilent Dako | Not Available | Automated system to prepare slides for IHC staining |
| Rapamycin | Alfa Aesar | J62473 | Drug that can inhibit NET growth |
| Secondary antibodies for IHC | Agilent Dako | K8000 | Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system |
| SSTR2 antibody | GeneScritp | A01591 | Antibodies for IF |
| SSTR2 antibody (clone UMB1) | Abcam | ab134152 | Antibodies for IHC |
| Synaptophysin antibody | Abcam | 32127 | Antibodies for IF |
| Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP) | Agilent Dako | M7315 | Antibodies for IHC |
| TritonX | Mallinckrodt | 3555 KBGE | Reagent to permeablize cells |
| Y-2763 ROCK inhibitor | Adipogen | AG-CR1-3564-M005 | To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw |
References
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