Summary
Neuro-endocriene tumoren (netten) zijn afkomstig van neuro-endocriene cellen van de neurale Crest. Ze zijn traag groeiend en uitdagend voor cultuur. We presenteren een alternatieve strategie om netten van de dunne darm te kweken door ze als spheroids te kweken. Deze sferoïden hebben kleine darmen net markers en kunnen worden gebruikt voor het testen van de drug.
Abstract
Kleine darm neuroendocriene tumoren (SBNETs) zijn zeldzame kankers afkomstig van enterochromaffin cellen van de darm. Onderzoek op dit gebied is beperkt omdat er zeer weinig patiënt afgeleide SBNET cellijnen zijn gegenereerd. Goed gedifferentieerde SBNET cellen zijn traag groeien en zijn moeilijk te propageren. De weinige cellijnen die zijn vastgesteld zijn niet direct beschikbaar, en na de tijd in de cultuur mag niet blijven om de kenmerken van de netto-cellen uit te drukken. Het genereren van nieuwe cellijnen kan vele jaren duren, omdat SBNET-cellen een lange verdubbelingstijd hebben en veel verrijkingsstappen nodig zijn om de snel delende kankergerelateerde fibroblasten te elimineren. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we een protocol ontwikkeld om sbnet-cellen te kweken van operatief verwijderde tumoren als sferoïden in extracellulaire matrix (ECM). De ECM vormt een 3-dimensionale matrix die SBNET-cellen inkapt en de tumor micro-omgeving nabootst voor het laten groeien van SBNET-cellen. Hier kenmerkten we de groeisnelheid van sbnet sferoïden en beschreven methoden om sbnet-markers te identificeren met behulp van immunofluorescentie microscopie en immunohistochemie om te bevestigen dat de sferoïden neuroendocriene tumorcellen zijn. Daarnaast gebruikten we sbnet sferoïden voor het testen van de cytotoxiciteit van rapamycine.
Introduction
Kleine darm neuroendocriene tumoren (SBNETs) zijn afkomstig van enterochromaffin cellen van de dunne darm. Hoewel sbnets over het algemeen bekend zijn dat ze langzaam groeien, metastaseren ze vaak naar de lever1. Terwijl de chirurgische verwijdering of tumor ablatie kan worden overwogen in veel gevallen, herhaling is bijna universeel, en, daarom, medische therapie speelt een belangrijke rol in het management. Er zijn enorme inspanningen geïnvesteerd om nieuwe SBNET-cellijnen voor het testen van geneesmiddelen te genereren. Er is echter weinig succes geboekt. Slechts 6 sbnetcellijnen (krj-I, CND2, GOT1, P-STS, L-STS, H-STS) zijn gemeld2,3,4,5; en helaas is één cellijn niet langer NET markers6 en drie andere sbnet cellijnen (krj-I, L-STS, H-STS) die zijn vastgesteld om te worden afgeleid van getransformeerde lymfoblasten in plaats van netten7. Om de identificatie van geneesmiddelen voor het targeten van SBNETs te versnellen, zijn alternatieve methoden voor in-vitro geneesmiddelen tests nodig.
Hier maken we gebruik van de beschikbaarheid van nieuwe sbnets en hebben we een manier gecreëerd om deze door patiënten afgeleide sbnets te kweken als sferoïden in ECM. Het algemene doel van dit manuscript is om een methode te beschrijven voor cultuur sbnet als een driedimensionale (3D) cultuur en overzichts procedures om deze sferoïden te karakteriseren voor het bewaren van sbnet markers door immunofluorescentie kleuring en immunohistochemie.
Daarnaast tonen we aan hoe deze sbnet sferoïden kunnen worden gebruikt voor het testen van het effect van rapamycine, een anti-kanker medicijn voor NETs8. De achterliggende gedachte achter dit protocol is om een nieuwe methode te ontwikkelen om SBNET-cellen in vitro te laten groeien en deze te gebruiken voor het testen van medicijnen. Het voordeel van deze techniek ten opzichte van de traditionele methode voor het opzetten van een SBNET-cellijn is dat 3D-culturen van SBNETs snel kunnen worden verkregen en dat geneesmiddelen testen binnen 3 weken kunnen worden uitgevoerd. Sbnet sferoïden kan mogelijk worden gebruikt als model voor het uitvoeren van in vitro geneesmiddelen schermen om nieuwe geneesmiddelen voor sbnet-patiënten te identificeren. Aangezien sbnet-cellijnen niet algemeen beschikbaar zijn, kunnen 3D-culturen van sbnet-sferoïden fungeren als een nieuw in vitro model voor het bestuderen van sbnets en kunnen worden gedeeld door wetenschappers in het veld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten met behulp van menselijke neuro-endocriene tumormonsters zijn goedgekeurd door de Universiteit van Iowa ziekenhuis en klinieken IRB Comité (protocol nummer 199911057). Een lijst van alle materialen en apparatuur wordt beschreven in de tabel met materialen. In tabel 1vindt u een lijst met groeimedia en belangrijke oplossingen.
1. kleine darm neuroendocriene tumor (SBNET) collectie en celdissociatie
- Verkrijgen van de patiënt SBNET monsters na tumorweefsels bevestiging van de kern van de chirurgische pathologie.
- Snijd SBNETs in blokjes van 5 mm en bewaar in 25 mL DMEM/F12 medium in een conische buis voor het transport naar het laboratorium.
- Breng de tumoren in DMEM met 1% FBS, 1% penicillaire/streptomycine (pen/STREP), 1% glutamine (Wash medium) en inincuberen in dit reinigingsmiddel gedurende 15 minuten.
- Breng tumoren over naar een nieuw schaaltje en gehakt tumoren tot minder dan 1 mm stukken met behulp van steriele gebogen schaar.
- Breng de fijngehakte weefsels over in een nieuwe tube van 50 mL met 25 mL reinigingsmiddel.
- Centrifugeer het monster bij 500 x g gedurende 15 minuten bij 4 °c.
- Gooi het supernatant weg en regeer de pellets in 10 mL reinigingsmiddel dat Collagenase (100 U/mL) en DNase (0,1 mg/mL) bevat.
- Laat de vertering van de gehakte tumoren optreden in een incubator van 37 °C met langzaam schudden (50 rpm) voor 1,5 h.
2. cultuur van SBNETs als tumorsspheroïden in ECM
- Nadat de spijsvertering is voltooid (stap 1,8), centrifuge bij 500 x g gedurende 15 minuten bij 4 °c, gooi het supernatant weg en regeer de pellet in 15 ml reinigingsmiddel.
- Plaats een 70 μm-celzeef bovenop een nieuwe buis van 50 mL en breng 10 mL Wasmedium over in de celzeef. Zwenk het reinigings medium om de zijkant van de plastic buis te bedekken om te voorkomen dat de NETCELLEN aan de zijkant van de plastic buis kleven.
- Filtreer de celsuspensie door de celzeef.
- Centrifugeer bij 500 x g gedurende 15 minuten bij 4 °c, gooi het supernatant weg, hervat de pellet in 200 ΜL reinigingsmiddel (totaal volume is ~ 250 μL) en plaats het op ijs.
- Breng 5 μL cellen over naar 500 μL wasmiddel (1/100 verdunningsfactor). Gebruik de verdunde cellen voor celtellingen met behulp van een hemocytometer om het aantal cellen per milliliter te verkrijgen. Vermenigvuldig met 100 om de verdunningsfactor te corrigeren.
- Vermenigvuldig het aantal cellen per mL, verkregen in stap 2,5, door het totale volume van de cellen in suspensie verkregen in stap 2,4 (~ 250 μL).
- Centrifugeer bij 500 x g gedurende 15 minuten bij 4 °c, gooi het supernatant weg en revoer de cellen in vloeibare ECM (1 x 106 cellen/ml) en blijf op ijs.
- Breng 5-20 μL SBNETSFERIOÏDEN in ECM over naar een 96-well plaat en laat de vloeibare ecu stollen door de plaat gedurende 5 minuten in een incubator van 37 °C te plaatsen.
- Voeg 200 μL sbnet-kweekmedium (DMEM/F12 + 10% FBS + 1% pen/STREP + 1% glutamine + 10 mm Nicotinamide + 10 μg/ml insuline) toe aan elk goed van de 96-goed plaat met de sbnet sferoïden in ECM.
- Als alternatief, cultuur sbnet organoïden in stamcel media vergelijkbaar met wat eerder is beschreven voor het kweken van ofwel menselijke lever of alvleesklier organoïden9 en vermeld in de tabel van de materialen.
- Verander media elke 5-7 dagen.
3. kwantificering van SBNET-spheroid-grootte met ImageJ
- Neem 5-10 foto's van sbnet sferoïden op dag 1, 4, 7, 14, 23 en 97 van de cultuur met behulp van een 10x doelstelling.
- Open opgeslagen afbeeldingen in ImageJ. Ga naar het tabblad analyseren , selecteer de optie metingen instellen en plaats een vinkje bij de optie gebied .
- Gebruik de tool ovaal selecteren op de werkbalk om een ellipsoïde of cirkel rond een goed gerichte spheroid te genereren.
- Ga naar het tabblad analyseren en selecteer de optie meten . Herhaal de stappen 3,4 en 3,5 om de oppervlakte-meting te verkrijgen van 25-50 SBNET spheroids. De waarden worden opgegeven in pixel vierkant.
- Converteer het pixelgebied naar μm2 door de grootte van elke pixel te delen met de lengte van elke pixel naar μm conversiefactor van de microscopie beelden.
Opmerking: sbnet-cellen groeien voornamelijk als sferoïden en soms als ellipsoïden.
4. karakterisering van sbnets sferoïden door immunofluorescentie
- Breng de organoïden die in de ECM zijn geteeld over in een buis van 1,5 mL met behulp van een P1000 pipet.
- Centrifugeer bij 1.500 x g gedurende 1 minuut en verwijder het supernatant.
- Was de organoïde cultuur door 1 mL PBS toe te voegen, meng, centrifugeer bij 1.500 x g gedurende 1 minuut en verwijder het supernatant.
- Fixeer de organoïden door toevoeging van 500 μL van 4% Paraformaldehyde en inincuberen gedurende 15 min.
- Was de cultuur tweemaal met 1 mL PBS.
- Permeabilize de cultuur door toevoeging van 500 μL PBS + 3% BSA + 0,1% Triton X 100 gedurende 5 min.
- Vervolgens driemaal wassen met 1 mL PBS + 3% BSA.
- Inbroed voor 1 uur met primaire antilichamen tegen synaptophysin (SYP)10 bij 1/600 verdunning of Chromogranine A (CGA)11 en Somatostatine receptor 2 (SSTR2)12 bij 1/400 verdunning in antilichaam buffer (2,5% boviene serumalbumine, 0,1% natrium Azide, 25 mM tris pH 7,4, 150 mM natriumchloride).
Opmerking: gebruik 300 μL of meer antilichaam oplossing per buis. - Was driemaal met 1 mL PBS + 3% BSA.
- Inincuberen met secundaire antilichamen gekoppeld aan FITC bij 1/500 verdunning in antilichaam buffer voor 1 uur. gebruik 300 μL of meer van de antilichaam oplossing per buis.
- Was 3 keer met 1 mL PBS + 3% BSA. Zorg ervoor dat u aspireren en gooi alle supernatant.
- Voeg 5 μL afdekmedium met de nucleaire vlek DAPI toe.
- Gebruik een P20-pipet om 5 μL van de sbnet-sferoïden van stap 4,12 over te brengen naar een glazen schuif en afdichting met een Afdekstrook.
- Maak afbeeldingen met behulp van een fluorescerende Microscoop met behulp van de 10x, 20x of 40x doelstellingen.
5. sbnet sferoïden karakteriseren door immunohistochemie (IHC)
- Breng sbnet sferoïden over van de kweek plaat naar een buis van 1,5 ml met behulp van een P1000 pipet.
- Centrifugeer bij 1.500 x g gedurende 1 minuut en verwijder het supernatant.
- Fix sbnet sferoïden door toevoeging van 500 μL 10% formaline aan de buis uit stap 5,2 en inincuberen bij kamertemperatuur gedurende 2-5 dagen voorafgaand aan paraffine inbedding en snijd 4 μm dikke spheroid secties.
- Deparaffiniseert, rehydraat, en gebruik hitte-geïnduceerde epitoop retrieval bij een antigeen-ophaal oplossing bij pH 9 door te verwarmen tot 97 °c gedurende 20 minuten met behulp van het 3-in-1 geautomatiseerde Slide processing station om dia's voor antilichaamincubatie voor te bereiden.
- Blokkeer dia's en inbroed met primaire antilichamen tegen SYP10 bij een 1/100 verdunning gedurende 15 min, CGA11 bij een 1/800 verdunning gedurende 15 min, en SSTR212 bij een 1/5000 verdunning gedurende 30 min.
- Inincuberen met het secundaire antilichaam detectiesysteem gedurende 15 minuten voor de anti-SYP en CgA kleuring en 30 min voor anti-SSTR2 kleuring. Maak Foto's met een doelstelling van 400x.
6. behandeling van SBNET organoïden met rapamycine
- Los rapamycine op in DMSO om een stockoplossing van 10 mM te verkrijgen.
- Bereid SBNET-kweekmedium met DMSO (bijv. 1 mL SBNET-kweekmedium + 1 μL DMSO) en SBNET-kweekmedium met 10 μM rapamycine (bijv. 1 mL SBNET-kweekmedium + 1 μL van 10 mM rapamycine voorraadoplossing).
- Breng 200 μL media over met SBNET-kweekmedium met DMSO of 10 μM rapamycine naar SBNET spheroid-culturen.
- Incuberen sbnet sferoïden gedurende 5 dagen in een incubator van 37 °c.
- Voeg 1 μM ethidiumbromide homodimeer toe en incuberen gedurende 30 min. Verwijder het medium dat ethidiumbromide homodiaan bevat, was met 200 μL PBS en breng 200 μL PBS over naar elk goed.
- Gebruik de rode filter kubus met de 10x-, 20x-of 40x-doelstellingen van een fluorescerende Microscoop om microscopisch kleine afbeeldingen van sbnet-sferoïden met en zonder medicamenteuze behandeling te gebruiken.
Opmerking: dode cellen gekleurd met ethidium homodimeer worden rood weergegeven met behulp van de rode filter kubus G van een in de handel verkrijgbare Microscoop (tabel van materialen). Als alternatief kan het signaal worden opgevangen met behulp van een spectrofotometer bij 535 nm excitatie en 624 nm-emissie.
7. splitsen van sbnet sferoïden
Opmerking: dit wordt gedaan voor uitbreiding en voor het delen met andere onderzoekers.
- Gebruik een P1000 pipet om de ecu mechanisch te breken en de ECM met sbnet sferoïden naar een steriele 1,5 ml buis te zuigen.
- Centrifugeer op 1.000 x g bij 4 °c, verwijder alle supernatant en plaats de buis op ijs.
- Voeg 2-4x het volume van de nieuwe ECM toe aan de pellet. Meng de nieuwe ECM met de oude ECM en sbnet sferoïden door de 10x op en neer te pipetteren. Vermijd het introduceren van luchtbellen.
- Breng 5-20 μL van het ecu-en sbnet-sferoïden-mengsel over naar een nieuw plaatje en laat de ECM stollen.
- Afdekking met nieuw SBNET-medium en overdracht naar de incubator. Het herstelpercentage is ongeveer 95 tot 100%.
- Als u sbnet sferoïden naar een ander Lab wilt verzenden, moet u sbnet sferoïden met nieuwe ECM overbrengen naar een T25 kolf en de ECM laten stollen.
- Vul de T25 kolf met SBNET spheroid medium, schroef de dop stevig aan en bereid het verzendpakket voor.
- Nadat u een sbnet spheroid-cultuur hebt ontvangen, verwijdert u het kweekmedium en voert u stap 7,1 tot 7,5 uit om sbnet sferoïden weer in cultuur te brengen.
8. cryoopslag en terugwinning van sbnet sferoïden
- Transfer sbnet sferoïden van 5-10 kleine putjes naar een buis van 15 ml. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 15 minuten bij 4 °c, verwijder supernatant, respendeer in Vries medium (90% FBS + 10% DMSO), bewaar in een cel bevriezings container en plaats dit bij-80 °c.
- Overdracht naar de vloeibare stikstof voor langere opslag.
- Als u SBNET spheroids wilt herstellen, plaatst u de bevroren injectieflacon op ijs en wacht u tot de inhoud volledig ontdooid is. Keer de buis om en plaats deze opnieuw op ijs om het ontdooien te versnellen.
- Zodra het monster ontdooid is, wordt het in een voorgekoelde centrifuge geplaatst en gedurende 10 minuten op 1.000 x g gedraaid.
- Verwijder de supernatant en rebreng de sferoïden in ECM. Houd de buis op ijs, breng 20 μL over naar een nieuwe plaat en wacht tot de ecu stollen.
- Breng 200 μL van het SBNET-kweekmedium over met 10 μM ROTSREMMER (Y-27632)13 en breng over naar de incubator.
- Sta sbnet sferoïden toe om 1 week te herstellen en te groeien. Verwijder het oude kweekmedium, vul aan met 200 μL SBNET-kweekmedium en keer terug naar de incubator.
- Sta toe dat sbnet sferoïden blijven groeien.
Opmerking: het duurt ten minste 1 week voor snel groeiende sferoïden om te beginnen te herstellen na cryopreservatie13. Sbnet sferoïden nemen minimaal 2-4 weken om te beginnen met groeien. In de eerste 2 weken zullen veel SBNET-cellen sterven en het overlevingspercentage is minder dan 10%. Aangezien dit een zeer tijdrovend en laag opbrengst proces is, is het beter om te delen met andere onderzoekers sbnet sferoïden in cultuur kolven (zoals beschreven in stap 7). Cryostorage en Recovery mag alleen worden gebruikt als een back-upplan in geval van bacteriële besmetting optreedt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Er zijn momenteel slechts 2 sbnet cellijnen opgericht en gepubliceerd2,3,4,5 en ze zijn niet direct beschikbaar voor veel onderzoekers. Hier stellen we voor om sbnet als sferoïden in ECM te kweken en dit als alternatief model te gebruiken om de gevoeligheid van het sbnet te bestuderen. Patiënt-afgeleide tumor van een sbnet dat uitgezaaid naar de lever werd verzameld, verteerd om sbnet cellen vrij te geven, en vermengd met vloeibare ECM voor de vaststelling van een sbnet spheroid cultuur (Figuur 1A). De Ki-67 van dit SBNET was 4,3%. Hoewel sbnet sferoïden een langzame groei hebben, kan hun groei worden bewaakt door microscopische beeldvorming (Figuur 1a). Het duurt ongeveer 14 dagen voor sbnet-sferoïden om te verdubbelen in grootte wanneer de cultuur media eenmaal per week worden gewijzigd (Figuur 1B). Na 14 dagen in de cultuur, de sbnet sferoïden niet toenemen in grootte. In plaats daarvan zullen sommige SBNET-cellen dissociëren naar een naburige locatie en nieuwe spheroids vormen. Als u de sbnet sferoïden-cultuur wilt propageren, oogst dan de ECM met sbnet-sferoïden en reseed deze in een nieuwe kweek plaat met een nieuw kweekmedium (stap 7).
Om te bevestigen dat de organoïde culturen SBNET-cellen bevatten, beschrijven we een eenvoudige en snelle methode om de sferoïden te vlekken op SBNET-markers zoals synaptophysin, chromogranine A en de Somatostatine receptor type 2 (SSTR2) met behulp van Immunofluorescentie (IF) microscopie ( Stap 4). Met behulp van antilichamen die specifiek zijn tegen synaptophysin, chromogranine A en SSTR2 toonden onze if-gegevens aan dat deze markers gelokaliseerd zijn in het cytoplasma en op het membraan van sbnet-cellen (Figuur 2A, in het groen) na 1 of 9 maanden in cultuur (Falgoritmisch 2b ). Om de specificiteit van de SYP, CGA en SSTR2 antilichamen te waarborgen, hebben we dezelfde kleurings procedures uitgevoerd op een organoïde lijn van pancreas tumor die SYP, CGA of SSTR2 niet Express (Figuur 2C) als er geen groen signaal werd gedetecteerd. Het belangrijkste voordeel van deze SBNETSPHEROID als experiment is dat het kan worden uitgevoerd binnen 4 uur en geeft vergelijkbare kleurings informatie als de immunohistochemie (IHC; Figuur 3). Wij bieden een protocol voor het uitvoeren van IHC van de sbnet sferoïden in stap 5.
Culturing sbnet als sferoïden is een waardevolle techniek voor het identificeren van geneesmiddelen die sbnet-groei kunnen remmen. Als bewijs van principe behandelden we sbnet-sferoïden met rapamycine gedurende 5 dagen, een mtor-remmer, een klasse van geneesmiddelen die gewoonlijk worden gebruikt voor de behandeling van netten8. In vergelijking met onze controle SBNETSPHEROID vormde de met rapamycine behandelde spheroid een druiven achtige structuur en werd apoptotic of necrotische (Figuur 4a-D). Stervende cellen kunnen worden gedetecteerd met behulp van ethidium homodimeer om DNA en RNA te vlekken en een helder rood signaal14te genereren. Deze kleurstof kan niet doordringen in de celmembraan van levende cellen.
Figuur 1: patiënt-afgeleide kleine darm neuroendocriene tumoren (sbnets) gekweekt in extracellulaire matrix (ECM) als spheroids. (a) isolatie van tumorcellen van een geperfectioneerd sbnet en zet in cultuur door menging met ECM. Schaalbalk vertegenwoordigt 100 μm.B) oppervlakte van sbnet-sferoïden met betrekking tot het aantal dagen in cultuur dat met imagej is gekwantificeerd. Gegevens werden verkregen uit SBNETSFERIOÏDEN van 1 patiënt en worden weergegeven als het gemiddelde gebied ± standaardfout van het gemiddelde. Het oppervlak van 30 tot 60 sferioïden werd voor elk tijdspunt gemeten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: immunofluorescentie (if) KLEURING van sbnet-spheroids. Bij kleuring van sbnet-sferoïden na (a) 1 maand in cultuur en (B) 9 maanden in cultuur. C) als kleuring van pancreas tumor organoïden die geen sbnet markers als negatieve controles uitdrukken. Tumor sferoïden werden vastgesteld in 4% Paraformaldehyde en gekleurd met antilichamen tegen synaptophysin (SYP) bij 1/600 verdunning, chromogranine A (CgA) bij 1/400 verdunning, en Somatostatine receptor 2 (SSTR2) bij 1/400. ALS beelden werden genomen op 100 MS, 200 MS en 400 MS belichtingstijd voor SYP, CgA en SSTR2 kleuring, respectievelijk met behulp van de 10x, 20x of 40x doelstellingen. Schaalbalk vertegenwoordigt 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: immunohistochemie (IHC) KLEURING van sbnet spheroids. Met formalin vaste en paraffine-ingesloten SBNETSSPHEROIDS-profielen werden gedeparaffiniseerd, gerehydrateerd, verstopt en gekleurd met (A) SYP, (B) CGA en (C) SSTR2 antilichamen. Afbeeldingen werden gemaakt met behulp van de 400x-doelstelling. Schaalbalk vertegenwoordigt 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: gebruik van sbnet sferoïden voor geneesmiddelen tests. (a) helderveld beeld van sbnet sferoïden gedurende 5 dagen behandeld met DMSO. B) afbeelding van sbnet-spheroïden die met DMSO zijn behandeld en gekleurd met ethidium homodimeer (ethidium H). C) helderveld beeld van een dode sbnetspheroid die druiven achtige structuur vormt na behandeling met 10 μM rapamycine gedurende 5 dagen. D) dode sbnetspheroid gekleurd met ethidium H verschijnt als rode stippen. Afbeeldingen van ethidium H kleuring werden genomen met behulp van de rode filter kubus op 100 MS belichtingstijd. Schaalbalk vertegenwoordigt 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Groeimedia of oplossing | Samenstelling |
| Wash medium | DMEM met 1% FBS, 1% PEN/STREP, 1% glutamine |
| SBNET Culture medium | DMEM/F12 + 10% FBS + 1% PEN/STREP + 1% glutamine + 10 mM Nicotinamide + 10 μg/mL insuline |
| Antilichaam buffer | 2,5% boviene serumalbumine, 0,1% natrium azide, 25 mM tris pH 7,4, 150 mM natriumchloride |
| Vries medium | 90% FBS + 10% DMSO |
| Humane lever stamcel isolatie medium | DMEM/F12, 1% pen/STREP, 1% GlutaMAX, 10 mM HEPES, 1/50 B27 supplement, 1/100 N2 supplement, 1 mM N-Acetylcysteïne, 200 ng/mL RSPO 1, 50ng/mL EGF, 100 ng/mL FGF10, 10 mM Nicotinamide, 10 uM Forskolin, 5uM A83-01 |
| Humane alvleesklier stamcel isolatie medium | DMEM/F12, 1% pen/STREP, 1% GlutaMAX, 10 mM HEPES, 1/50 B27 supplement, 1/100 N2 supplement, 1 mM N-Acetylcysteïne, 200 ng/mL RSPO 1,25 ng/mL Noggin, 50ng/mL EGF, 100 ng/mL FGF10, 10 mM Nicotinamide, 10 uM Forskolin, 5uM A83-01, 3 uM PGE-2 |
Tabel 1. Lijst van groeimedia en oplossing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tumor 3D culturen zijn uitgegroeid tot een waardevolle bron voor preklinische drug testen15. Verschillende tumor organoïde biobanken zijn onlangs opgericht uit borstkanker en prostaatkanker tumoren16,17. In deze studie bieden we een gedetailleerd protocol aan cultuur-SBNET als sferoïden en een eenvoudige en snelle methode om de spheroid-culturen voor netto-markers te valideren door immunofluorescentie en test geneesmiddel gevoeligheid. Vanuit onze ervaring kunnen sbnet sferoïden groeien in verschillende cultuur media. Ze groeien iets sneller in stamcel media voor humane alvleesklier of lever isolatie die we hebben aangepast uit eerder gepubliceerde protocollen9. We kozen ervoor om de SBNETs te laten groeien in DMEM/F12 medium aangevuld met insuline en nicotinamide omdat dit minder duur is dan stamcel media. Het verhogen van het percentage van het foetaal runderserum is een andere strategie om de groei van sbnet organoïde-culturen te bevorderen; Dit zou echter ook de totale kosten voor cultuur onderhoud verhogen.
Optreden als kleuring en beeldvorming met een fluorescerende microscopie met behulp van de 10x, 20x of 40x doelstellingen is een snelle en eenvoudige methode om te testen voor de uitdrukking SBNET markers. Het geeft echter geen goed gedefinieerde lokalisatie in vergelijking met IHC (Figuur 2, Figuur 3). De IF-gegevens toonden bijvoorbeeld aan dat de lokalisatie van het membraan van SSTR2 moeilijk te detecteren is. We detecteren vooral de cytosolische SSTR2, die eerder is gemeld18. Om een betere lokalisatie van de marker eiwitten te verkrijgen, raden we aan om te gebruiken als en confocale microscopie. Kortom, als is een handige methode om snel te bevestigen SBNET markers. Onze antilichamen (anti-SYP, anti-CGA, anti-SSTR2) reageerden niet met de negatieve controle organoïden die SYP, CGA of SSTR2 (Figuur 2C) niet uitdrukken in het if-experiment. Deze suggestie dat de fluorescerende signalen die we hebben gedetecteerd specifiek zijn voor SBNET spheroids.
Om de opbrengst van SBNET-spheroids te verhogen, zijn de kritieke stappen van dit protocol tijdens de cel filtratie stap (stap 2,2) en het mengen van het SBNET met de vloeibare ECM voor het in weefselkweek platen (stap 2,8). Zorg ervoor dat u het celzeef membraan en het opvang buisje met media afdekt om te voorkomen dat de SBNET-cellen aan het plastic kleven. Vloeibare ECM zal snel stollen als het niet op ijs wordt geplaatst. Zorg ervoor dat u een kleine ijscontainer in de weefselcultuur kap hebt om de ECM en SBNET cellen koud te houden.
De beperking van deze techniek is de trage groeisnelheid van de SBNET spheroids. Experimenten moeten efficiënt worden gepland en geen overtollige hoeveelheid SBNET-spheroids gebruiken. Een andere beperking is het langzame herstel na bevriezing ontdooien. Het duurt meer dan 1 maand na ontdooien voor de sbnet sferoïden om te beginnen te groeien. Om deze beperking te overwinnen, stellen we voor om sbnet sferoïden continu te onderhouden in culturen en deze indien nodig te splitsen (stap 7). Zelfs na 9 maanden in de cultuur, behouden de sbnet sferoïden nog steeds de uitdrukking van sbnet-markers (Figuur 2B).
Hoewel de 3D-cultuur van sbnet sferoïden meer arbeidsintensief is dan de traditionele 2D-cultuur van andere cellijnen van kanker, is het een uiterst waardevol model voor in vitro cultuur van sbnet omdat veel sbnet-onderzoekers geen toegang hebben tot de bestaande cellijnen. Met dit protocol kunnen wetenschappers en clinici SBNET-spheroid-culturen van de tumor tot stand brengen en deze delen met andere laboratoria. Daarnaast kunnen de sbnet-sferoïden worden gebruikt om sbnet patiënt-afgeleide xenotransplantaatmodellen is-muizen te vestigen. Over het algemeen kunnen de hier gepresenteerde technieken worden aangepast voor het kweken, karakteriseren en uitvoeren van drugs testen van andere netten zoals pancreas-of Long netten. Merk op dat de groeisnelheid van de organoïden zal variëren tussen de verschillende soorten netten en patiënt monsters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door NIH grants P50 CA174521 (aan J.R. Howe en A.M. Bellizzi). P.H. ear is een ontvanger van de P50 CA174521 Career Enhancement Program Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-rabbit FITC | Jackson ImmunoResearch | 11-095-152 | Secondary antibody couple to a green fluorophore |
| Antigen Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | Solution at pH 9 for preparing slides for IHC |
| Autostainer Link 48 | Agilent Dako | Not Available | Automated system for antibody staining |
| Cell freezing container | Thermo Scientific | 5100-0001 | Container to for freezing cells |
| CellSence | Olympus | Version 1.18 | Computer software for using fluorescent microscope |
| Chromogranin A antibody | Abcam-45179 | RB-9003-PO | Antibodies for IF |
| Chromogranin A antibody (clone LK2H10) | Thermo Scientific | MA5-13096 | Antibodies for IHC |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | Medium for tissue preparation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | Medium for organoid cultures |
| DMSO | Sigma | D8418 | Solvent for dissolving drug |
| DNAse | Sigma | DN25 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| Ethidium Homodimer | Chemodex | CDX-E0012-T1E | DNA and RNA binding dye |
| FBS | Gibco | 16000044 | Reagent for culture media |
| Fluorescent microscope | Olympus | CKX35 | Microscope for taking pictures of SBENT spheroids |
| Glutamine | Gibco | A2916801 | Reagent for culture media |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.51 | Computer software for image analysis |
| Insulin | Sigma | I0516 | Reagent for culture media |
| Matrigel | Corning | 356235 | Matrix to embed and anchore organoids |
| Mounting medium (VECTASHIELD) | Vector Laboratories | H-1200 | Fixative for labelled-cells with a nuclear stain |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reagent for culture media |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Reagent to fix cells |
| PEN/STREP | Gibco | 15140-122 | Reagent for culture media |
| PT Link | Agilent Dako | Not Available | Automated system to prepare slides for IHC staining |
| Rapamycin | Alfa Aesar | J62473 | Drug that can inhibit NET growth |
| Secondary antibodies for IHC | Agilent Dako | K8000 | Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system |
| SSTR2 antibody | GeneScritp | A01591 | Antibodies for IF |
| SSTR2 antibody (clone UMB1) | Abcam | ab134152 | Antibodies for IHC |
| Synaptophysin antibody | Abcam | 32127 | Antibodies for IF |
| Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP) | Agilent Dako | M7315 | Antibodies for IHC |
| TritonX | Mallinckrodt | 3555 KBGE | Reagent to permeablize cells |
| Y-2763 ROCK inhibitor | Adipogen | AG-CR1-3564-M005 | To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw |
References
- Maxwell, J. E., Sherman, S. K., Howe, J. R. Translational Diagnostics and Therapeutics in Pancreatic Neuroendocrine Tumors. Clinical Cancer Research. 22, 5022-5029 (2016).
- Pfragner, R., et al. Establishment of a continuous cell line from a human carcinoid of the small intestine (KRJ-I). International Journal of Oncology. 8, 513-520 (1996).
- Kolby, L., et al. A transplantable human carcinoid as model for somatostatin receptor-mediated and amine transporter-mediated radionuclide uptake. American Journal of Pathology. 158, 745-755 (2001).
- Van Buren, G., et al. The development and characterization of a human midgut carcinoid cell line. Clinical Cancer Research. 13, 4704-4712 (2007).
- Pfragner, R., et al. Establishment and characterization of three novel cell lines - P-STS, L-STS, H-STS - derived from a human metastatic midgut carcinoid. Anticancer Research. 29, 1951-1961 (2009).
- Ellis, L. M., Samuel, S., Sceusi, E. Varying opinions on the authenticity of a human midgut carcinoid cell line--letter. Clinical Cancer Research. 16, 5365-5366 (2010).
- Hofving, T., et al. The neuroendocrine phenotype, genomic profile and therapeutic sensitivity of GEPNET cell lines. Endocrine Related Cancer. 25, 367-380 (2018).
- Moreno, A., et al. Antitumor activity of rapamycin and octreotide as single agents or in combination in neuroendocrine tumors. Endocrine Related Cancer. 15, 257-266 (2008).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocols. 11, 1724-1743 (2016).
- Saito, Y., et al. Establishment of Patient-Derived Organoids and Drug Screening for Biliary Tract Carcinoma. Cell Reports. 27, 1265-1276 (2019).
- Park, S. J., et al. Detection of bone marrow metastases of neuroblastoma with immunohistochemical staining of CD56, chromogranin A, and synaptophysin. Applied Immunohistochemisty and Molecular Morphology. 18, 348-352 (2010).
- Clifton-Bligh, R. J., et al. Improving diagnosis of tumor-induced osteomalacia with Gallium-68 DOTATATE PET/CT. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98, 687-694 (2013).
- Clinton, J., McWilliams-Koeppen, P. Initiation, Expansion, and Cryopreservation of Human Primary Tissue-Derived Normal and Diseased Organoids in Embedded Three-Dimensional Culture. Current Protocols in Cell Biology. 82, 66 (2019).
- Markovits, J., Roques, B. P., Le Pecq, J. B. Ethidium dimer: a new reagent for the fluorimetric determination of nucleic acids. Analytical Biochemistry. 94, 259-264 (1979).
- Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery. Cell Chemical Biology. 24, 1092-1100 (2017).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172, 373-386 (2018).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communication. 9, 2404 (2018).
- Singh, S. P., et al. SSTR2-based reporters for assessing gene transfer into non-small cell lung cancer: evaluation using an intrathoracic mouse model. Human Gene Therapy. 22, 55-64 (2011).
